李志英，智新，張焱，董晶

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

超聲與乙醇/硫酸銨雙水相體系耦合提取甘草中總黃酮的研究

李志英，智新，張焱，董晶

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

以甘草為原料，利用超聲與乙醇-硫酸銨雙水相體系耦合提取甘草粉末中的總黃酮。通過進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到甘草總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：利用超聲與乙醇-硫酸銨雙水相體系耦合對(duì)甘草總黃酮進(jìn)行提取分離的最佳工藝條件為：料液比1∶35；醇水比0.7∶1；硫酸銨的質(zhì)量濃度0.25 g/mL，提取時(shí)間40 min。在此條件下，甘草總黃酮得率是1.96%。與超聲法比較，雙水相體系耦合提取得率明顯高于常規(guī)超聲提取法。

超聲提取；雙水相體系；甘草；總黃酮；正交實(shí)驗(yàn)

甘草為豆科植物甘草、脹果甘草、光果甘草的根莖，是我國(guó)2000多種草藥中用量最大的一味草藥，素有“十方九草，無草不成方”之說，享有“中草藥之王”的美譽(yù)［1］。它的干燥根莖具有消熱解毒、祛痰止渴、潤(rùn)肺止咳的功效，主要含有三萜類成分及黃酮類化合物，后者具有顯著的清除人體內(nèi)自由基、治療心血管疾病、抗心律失常、抗腫瘤，抗癌等功效［2］。國(guó)內(nèi)外的研究表明，黃酮類化合物不僅具有多種生物學(xué)活性，而且具有劑量小、見效快、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，所以在食品和醫(yī)藥保健領(lǐng)域方面有著十分廣闊的應(yīng)用前景［3］。

雙水相萃取法，是一種新型的液-液萃取技術(shù)，條件溫和，萃取時(shí)間短，提取效率較高，操作簡(jiǎn)便，且?guī)缀醪淮嬖谟袡C(jī)溶劑殘留問題，受到人們極大的關(guān)注，是一種很有發(fā)展前途的萃取方法［4］。隨著研究的不斷深入，以無機(jī)鹽代替高聚物的普通有機(jī)物雙水相體系，因其價(jià)格低廉、低毒、體系簡(jiǎn)單、溶劑的回收利用及后續(xù)處理容易等優(yōu)點(diǎn)使雙水相萃取的工業(yè)化成為可能［5］。此外，超聲提取法利用超聲波的“空穴作用”產(chǎn)生的沖擊波和射流破壞植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)式黃酮化合物釋放和溶出，而將雙水相技術(shù)與超聲技術(shù)進(jìn)行集成促進(jìn)了不同分離技術(shù)的交叉、滲透和融合，有效提高了分離效率［6］。本文以一定濃度的乙醇溶液和硫酸銨組成的雙水相體系與超聲耦合來提取甘草中的總黃酮，并通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)考察料液比、醇水比、硫酸銨的質(zhì)量濃度和提取時(shí)間等提取條件對(duì)總黃酮得率的影響，從而選擇出適合提取甘草總黃酮的最佳條件。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Fw135型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：南京臨江科技開發(fā)有限責(zé)任公司。甘草：購于山西省忻州市五臺(tái)山大藥房，在100℃烘干3 h，固體粉碎機(jī)粉碎，過120目篩，裝瓶備用；硝酸鋁：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；槲皮素：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2溶液的配制

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.125 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取槲皮素0.025 0 g，用少量無水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，再用30%乙醇定容，得到濃度為0.5 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取25 mL該溶液，用30%乙醇定容至100 mL的容量瓶中，得到濃度為0.125 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液以備用。硝酸鋁溶液（1%）：準(zhǔn)確稱取1.000 3 g硝酸鋁固體，加入蒸餾水溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容。

1.3甘草總黃酮的提取方法

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g甘草粉末于100 mL具塞錐形瓶中，按照1∶30的固液比、0.7∶1醇水比以及0.30 g/mL硫酸銨1 mL，在超聲波功率為280 W、溫度為50℃的條件下提取30 min，趁熱對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置分層后，將上層乙醇相溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，并用30%乙醇定容［7］。

1.4甘草總黃酮的測(cè)定方法

準(zhǔn)確量取提取液2 mL于10 mL比色管中，分別加入1%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，用30%乙醇溶液定容，以30%乙醇做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)269 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮的得率按照下式計(jì)算：Et%=（C×V×50）/W× 100%，式中Et%為得率，C為測(cè)得的提取液濃度，W為原料的質(zhì)量［8］。

2結(jié)果與討論

2.1最大吸收波長(zhǎng)

準(zhǔn)確量取0.125 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL甘草黃酮提取液2 mL于兩支10 mL比色管中，按實(shí)驗(yàn)1.4的方法，以30%乙醇做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)200 nm～600 nm之間掃描，結(jié)果如圖1。

圖1　最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定Fig.1The determination of maximum absorption wavelength

圖1中，曲線1和曲線2分別為槲皮素和甘草黃酮提取液的吸收光譜，二者均在269 nm處有最大吸收，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為269 nm。

2.2槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取0.125 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL的比色管中，加入1%硝酸鋁溶液1 mL，用30%的乙醇定容至10 mL。以30%乙醇為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)269 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=42.4x+0.204 6，R2=0.999 7。式中：x為質(zhì)量濃度，mg/mL；y為吸光度值。

2.3固液比對(duì)甘草總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g甘草粉五份于具塞錐形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它條件，改變料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35進(jìn)行提取，得提取液，精確吸取樣品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果如表1。

表1　料液比對(duì)甘草黃酮得率的影響Table 1Effect of material liquid ratio on yield of the licorice flavonoid

由表1可知，隨著固液比的增大，甘草總黃酮的得率不斷上升，當(dāng)固液比為1∶30時(shí)，甘草總黃酮得率達(dá)到最大值，此后，隨著乙醇用量以及硫酸銨溶液體積的增加，總黃酮的得率隨之下降，因此固液比為1∶30時(shí)最合適。

2.4醇水比對(duì)甘草總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g甘草粉五份于具塞錐形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它條件，改變醇水比分別為0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1進(jìn)行提取，得提取液，精確吸取樣品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果如表2。

表2　醇水比對(duì)甘草黃酮得率的影響Table 2Effect of alcohol water ratio on yield of the licorice flavonoid

由表2可知，在醇水比為0.4∶1～0.7∶1的條件下，甘草總黃酮的得率得到了明顯的提升，當(dāng)醇水比達(dá)到0.7∶1時(shí)，黃酮得率最大，繼續(xù)增加醇水比總黃酮得率反而下降，其主要原因是隨著乙醇用量的增加，黃酮在乙醇中的溶解度也逐漸增大，再增加乙醇的體積，可能會(huì)影響雙水相體系的分相能力，從而導(dǎo)致得率下降，因此0.7∶1為最佳醇水比。

2.5硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)甘草總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g甘草粉五份于具塞錐形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它條件，改變硫酸銨溶液濃度比分別為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 g/mL進(jìn)行提取，得提取液，精確吸取樣品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果如表3。

表3　硫酸銨的質(zhì)量對(duì)甘草黃酮得率的影響Table 3Effect of the quality of ammonium sulfate on yield of the licorice flavonoid

由表3可知，在固液比和醇水比一定的條件下，硫酸銨的質(zhì)量濃度為0.30 g/mL時(shí)，甘草總黃酮得率可達(dá)到最大，此后，質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，甘草總黃酮得率逐漸下降，這是因?yàn)榱蛩徜@用量剛開始增大時(shí)，它的鹽析作用不斷增強(qiáng)，雙水相體系的分相能力也逐漸增大，溶解黃酮的乙醇相濃度也逐漸增大［9］；為了形成穩(wěn)定的雙水相體系，硫酸銨的最佳質(zhì)量濃度為0.30 g/mL。

2.6提取時(shí)間對(duì)甘草總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g甘草粉五份于具塞錐形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它條件，改變時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，進(jìn)行提取，得提取液，精確吸取樣品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果如表4。

表4　提取時(shí)間對(duì)甘草黃酮得率的影響Table 4Effect of extracting time on yield of the licorice flavonoid

由表4所示，隨著超聲提取時(shí)間的增加，甘草總黃酮得率也在不斷增大，當(dāng)提取時(shí)間增大到30 min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值；再繼續(xù)增加提取時(shí)間，總黃酮得率反而下降。這是因?yàn)閯傞_始隨著時(shí)間的增加甘草中的總黃酮不斷浸出，以至于達(dá)到30 min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大；再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，乙醇揮發(fā)量增大，溶解到乙醇中的總黃酮的量也減少，從而總黃酮得率會(huì)逐漸下降［10］，因此選擇30 min作為超聲提取的最佳時(shí)間。

2.7正交試驗(yàn)

在單因素考查的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)法對(duì)提取因素如：固液比，醇水比，硫酸銨的質(zhì)量濃度，超聲提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，如表5，選用正交表對(duì)甘草總黃酮提取工藝進(jìn)行研究。超聲與乙醇-硫酸銨雙水相體系耦合進(jìn)行提取的條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表6。

表5　正交試驗(yàn)的因素與水平Table 5Factors and levels in the orthogonal array design

表6　正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6Results and analysis of the orthogonal experiment

由表6正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果可知，甘草總黃酮的最佳提取工藝條件為：A3B2C1D3，即固液比為1∶35，醇水比為0.7∶1，硫酸銨的質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，提取時(shí)間為40 min。從表2中極差可看出各因素對(duì)總黃酮的得率影響程度為：提取時(shí)間＞固液比＞質(zhì)量濃度＞醇水比，即4個(gè)因素中，以提取時(shí)間對(duì)甘草總黃酮得率的影響最大。

2.8不同提取方法的比較

將本法與超聲提取法進(jìn)行比較研究，結(jié)果如表7所示。

由表7可知，本法的總黃酮得率明顯高于常規(guī)的超聲提取法，而且本法操作方便，無毒，條件溫和，是非常適宜提取甘草總黃酮的操作方法。

表7　不同提取方法的比較Table 7The Comparison of different extraction methods

3結(jié)論

1）采用超聲與乙醇-硫酸銨雙水相體系耦合提取法甘草總黃酮的提取最佳工藝條件是：固液比為1∶35、醇水比為0.7∶1、硫酸銨的質(zhì)量濃度為0.25 g/mL、提取時(shí)間為40 min，在此條件下總黃酮的得率達(dá)到1.96%。各因素對(duì)甘草總黃酮的提取率影響程度為：提取時(shí)間＞固液比＞質(zhì)量濃度＞醇水比。

2）雙水相體系耦合提取的甘草總黃酮，提取工藝比較簡(jiǎn)單，與常規(guī)超聲提取法比較，總黃酮得率較高，該研究結(jié)果對(duì)中草藥及天然植物中的有效成分具有一定的參考價(jià)值。

［1］中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2005年版［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:205

［2］孫蕓，阿依努爾·吾買爾，燕雪花，等.甘草黃酮的提取方法及藥理作用研究進(jìn)展［J］.新疆中醫(yī)藥，2009，27（7）:72-75

［3］鄒玉紅，寇小燕，韓秋霞.超聲波輔助法提取甘草總黃酮工藝的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（14）:8345-8347

［4］汪建紅，廖立敏，王碧.乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中總黃酮研究［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，47（1）:78-81

［5］鐘玲，張?jiān)椒?，李小菊，?乙醇/無機(jī)鹽雙水相體系分離純化黃芪總黃酮的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，28（22）:58-62

［6］高云濤，李干鵬，李正全，等.超聲集成丙醇-硫酸銨雙水相體系從苦蕎麥苗中提取總黃酮及其抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（2）:110-113

［7］齊玉，孫波，趙曉，等.聚乙二醇/磷酸氫二鉀雙水相體系萃取蛋清溶菌酶方法的建立［J］.中國(guó)家禽，2013，35（5）:22-26

［8］江詠，李曉璽，李琳，等.雙水相萃取技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（10）:235-238

［9］那吉，董學(xué)暢，王雪梅，等.超聲波協(xié)同丙醇-硫酸銨雙水相體系提取燈盞花總黃酮的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24（12）:51-53

［10］趙曉莉，岳紅，張穎，等.柿葉黃酮在雙水相體系中的分配行為［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，26（1）:83-86

Ultrasonic Coupling Extraction with Ethanol Ammonium Sulfate Aqueous Two-Phase System of Licorice Flavonoids in Research

LI Zhi-ying，ZHI Xin，ZHANG Yan，DONG Jing
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Liquorice as raw material，ultrasonic-ammonium sulfate aqueous two-phase system coupled with ethanol extraction flavonoids of glycyrrhiza powder.By single factor experiment and orthogonal experiment was carried out optimum conditions of licorice flavonoids.Results showed that the use of ultrasound-ammonium sulfate aqueous two-phase system coupled with ethanol extraction and separation of licorice flavonoids best process conditions for：solid-liquid ratio rising 1∶35；Alcohol water ratio of 0.7∶1.The quality of the ammonium sulfate concentration of 0.25 g/mL，extracting time 40 mins.In this condition，the licorice flavonoids extraction rate was 1.96%.Extraction efficiency by using double water phase system extraction was higher than that of conventional ultrasonic extraction.

ultrasonic extraction；aqueous two-phase systems；licorice；flavonoids；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.026

2014-01-06

忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐基地（院政字201331）；忻州師范學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2012.1022）

李志英（1970—），女（漢），教授，碩士，從事分析化學(xué)教學(xué)與科研工作。