張媛媛，張彬，韓愛云，張文娜，俞龍泉

（石家莊學(xué)院，河北石家莊050035）

三種低聚果糖檢測(cè)方法的比較

張媛媛，張彬，韓愛云，張文娜，俞龍泉

（石家莊學(xué)院，河北石家莊050035）

通過對(duì)紙層析法，高效液相色譜-示差檢測(cè)法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法三種低聚果糖檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法分離度高，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，操作相對(duì)簡單易行，優(yōu)于其它兩種方法。該方法采用氨基柱，流動(dòng)相為乙腈與水，采用梯度洗脫，流速設(shè)定1.0 mL/min。ELSD的漂移管溫度設(shè)定85℃；載氣為空氣，流速2.0 L/min。低聚果糖各組分的回收率范圍為97.73%～99.39%，日內(nèi)精密度＜1.2%；日間精密度＜2.8%。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法簡便快捷，準(zhǔn)確性，重現(xiàn)性好，更適合于低聚果糖的檢測(cè)。

高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測(cè)；低聚果糖

低聚果糖（fructooligsacchrides，F(xiàn)OS）是果糖基通過β-1，2糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，其主要成分為蔗果三糖（GF2），蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）［1］，具有充當(dāng)雙歧桿菌和乳桿菌的生長因子，提高腸道有益菌群數(shù)量，從而改善人體內(nèi)腸道環(huán)境，防止腹瀉與便秘等生理功能［2-3］。目前，低聚果糖作為一種功能因子廣泛應(yīng)用于奶粉、飲料、糖果等食品領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中所含的低聚果糖的含量進(jìn)行定量分析，因此尋找到一種快速、穩(wěn)定、實(shí)用性強(qiáng)的低聚果糖檢測(cè)方面也變得十分重要。

前人研究結(jié)果中，甘賓賓等用高效液相色譜-示差檢測(cè)法，以乙腈、水為流動(dòng)相，對(duì)低聚果糖進(jìn)行了檢測(cè)［4］。唐軍等采用紙層析法對(duì)低聚果糖進(jìn)行了檢測(cè)［5］。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法作為一種新型檢測(cè)方法在低聚果糖檢測(cè)方面應(yīng)用不廣，而且上述文獻(xiàn)都是采用單一方法對(duì)低聚果糖進(jìn)行測(cè)定，缺少不同方法之間的橫向比較。目前，還沒有對(duì)于低聚果糖檢測(cè)方法橫向比較的研究報(bào)道。本研究擬對(duì)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、紙層析法和高效液相色譜-示差檢測(cè)法三種檢測(cè)方法進(jìn)行研究對(duì)比，得到一種更靈敏，準(zhǔn)確，快速的低聚果糖分析方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品：蔗果三糖（GF2，純度99%）、蔗果四糖（GF3，純度99%）、蔗果五糖（GF4，純度88%），日本島津株式會(huì)社；低聚果糖樣品：蘇州鑫發(fā)生物科技有限公司；乙腈：色譜純；正丙醇、醋酸乙酯、磷酸、α-萘酚溶液、活性炭、硅藻土、乙醇：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；新華三號(hào)濾紙；

1.1.2主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1100）、示差檢測(cè)器：安捷倫公司；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD-UM 3000）：上海通微科技有限公司；電子天平（AL 204）：瑞士梅特勒-托利多公司；721型分光光度計(jì)：上海精科；超聲波清洗器（YQ-520 A）：上海易凈超聲波儀器有限公司；色譜柱：NH2分析柱（4.6 mm×300 mm，5 μm），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）。

1.2方法

1.2.1低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品各200 mg，分別放入10 mL容量瓶，用超純水稀釋至刻度，超聲處理3 min后，用0.50 μm濾膜過濾。然后，取等量已配好的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，超聲處理3min后，用0.50 μm濾膜過濾，備用。

1.2.2低聚果糖樣品溶液配制

稱取一定量的樣品，用超純水稀釋至刻度，超聲處理5 min后，用0.50 μm濾膜過濾，備用。

1.2.3紙層析檢測(cè)法

將低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)樣于新華三號(hào)濾紙，點(diǎn)樣量10 μL，放置于層析缸中，展開劑為：V正丙醇∶V醋酸乙酯∶V水=8∶1∶1，待層析液上行至距濾紙頂端1 cm左右時(shí)，取出用電吹風(fēng)吹干后，均勻噴灑顯色劑（含10%磷酸的1%α-萘酚溶液），放于烘箱中干燥顯色，斑點(diǎn)顯出后，剪下顯色斑點(diǎn)于帶塞的玻璃試管中，用10 mL的洗脫液（去離子水和乙醇溶液）洗脫一定時(shí)間，然后在721分光光度計(jì)上測(cè)定其吸光度，計(jì)算其含量。

1.2.4高效液相色譜-示差檢測(cè)器檢測(cè)法

采用乙腈（75%）：水（25%）為流動(dòng)相；設(shè)定流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，40℃。

1.2.5高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)法

采用乙腈與水為流動(dòng)相；設(shè)定流速，1.0 mL/min，梯度洗脫；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，室溫；ELSD的漂移管溫度，85℃；載氣，空氣；流速，2.0 L/min。

2結(jié)果與分析

2.1紙層析檢測(cè)法

2.1.1定性分析

經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖全部呈現(xiàn)紫青色，斑點(diǎn)清晰，表示該方法可以用于低聚果糖的定量分析。

2.1.2定量分析

取同一樣品，分別進(jìn)行三次定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1　重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 1Reproducibility Test

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用紙層析檢測(cè)法進(jìn)行定量分析時(shí)，由于受實(shí)驗(yàn)方法自身精確度限制，以及環(huán)境影響和操作誤差影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差，樣品檢測(cè)含量波動(dòng)較大，其RSD均在5%以上，穩(wěn)定性不佳。

2.2高效液相色譜-示差檢測(cè)器檢測(cè)法

按照1.2.3.1的色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖由于分子結(jié)構(gòu)特征及理化特性十分相近，出峰時(shí)間存在重疊，洗脫效果不好，而且示差折光檢測(cè)器受檢測(cè)環(huán)境的影響很大，檢測(cè)靈敏度低。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符［6］。

2.3高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)法

2.3.1ELSD參數(shù)的選擇

漂移管溫度和霧化氣體流量是影響ELSD兩個(gè)重要因素。霧化器的氣體流速?zèng)Q定霧化時(shí)液滴的大小，從而影響基線噪聲。漂移管溫度決定了樣品的揮發(fā)程度，從而影響樣品的響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)通過觀察樣品分離度以及計(jì)算最佳信噪比（S/N），選擇漂移管溫度85℃，載氣流量2.0 L/min。

2.3.2流動(dòng)相條件選擇

采用乙腈、水為流動(dòng)相。由于要檢測(cè)的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，在采用等度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)水相比例較大時(shí)，峰有重疊，不能達(dá)到較好的分離度；為了使低聚果糖達(dá)到較好的分離度，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，洗脫條件為：0～20 min（70%～65% A，30%～35%B），20 min～22 min（65%A，35%B），22 min～25 min（65%～70%A，35%～30%B），25 min～28 min（70%A，30%B）。色譜圖見圖1。

圖1　低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1Representative HPLC-ELSD chromatograms of FOS

2.3.2方法學(xué)考察

2.3.2.1回歸方程、線性關(guān)系、檢出限（LOD）與定量限（LOQ）

將低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至不同濃度，按2.2的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得回歸方程，見表2。

表2　低聚果糖的回歸方程、線性關(guān)系、檢出限與定量限Table 2Calibration curve，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ of FOS

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上，表明方程是準(zhǔn)確可信的，線性范圍在0.67 μg～14.0 μg。

2.3.2.2精密度實(shí)驗(yàn)

取一定量的低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2的色譜條件進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)與日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3Intra-and inter-day variations of HPLC-ELSD method

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)RSD值均小于1.2%，日間精密度實(shí)驗(yàn)RSD值均小于2.8%，說明該檢測(cè)方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性很好，適用于低聚果糖的定量檢測(cè)。

2.3.2.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取一定量的樣品溶液，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻，按2.2的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4Accuracy of HPLC-ELSD method

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低聚果糖各組分的回收率范圍為97.73%～99.39%，其RSD值均小于1.4%。

3結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用紙層析檢測(cè)法對(duì)低聚果糖進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)其進(jìn)行定性分析；但由于紙層析檢測(cè)法精確度低，容易受環(huán)境和操作誤差影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差，表明該方法不適合用于低聚果糖的定量分析。

高效液相色譜-示差檢測(cè)法受環(huán)境影響較大，靈敏度低，且無法采用梯度洗脫，由于蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖由于分子結(jié)構(gòu)特征及理化特性十分相近，導(dǎo)致出峰時(shí)間存在重疊，洗脫效果不好，表明該方法不適合用于低聚果糖的定性定量分析。

高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)法是一種新型檢測(cè)方法［7-8］，其工作原理依據(jù)檢測(cè)樣品中不揮發(fā)的固體顆粒產(chǎn)生的散射光信號(hào)強(qiáng)度與其質(zhì)量成正比這一原理進(jìn)行檢測(cè)分析。在低聚果糖檢測(cè)方面顯示出明顯的優(yōu)越性，并且在多梯度的情況下能夠獲得穩(wěn)定的基線和較低的噪音，達(dá)到理想的分離度［9-10］。低聚果糖各組分的回收率范圍為97.73%～99.39%，日內(nèi)精密度＜1.2%；日間精密度＜2.8%。

綜上所述，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法分離度高，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，操作相對(duì)簡單易行，優(yōu)于其它兩種方法，更適合于含有低聚果糖的食品的檢測(cè)。

［1］黃磊，陳山.日本曲霉和黑曲霉發(fā)酵甘蔗糖蜜和酵母粉生產(chǎn)低聚果糖［J］.廣西蔗糖，2012，36（4）:38-43

［2］惠伯棣，李京，鄭康成，等.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器在番茄紅素反相HPLC定量分析中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2006，27（2）:226-229

［3］張悅晗，甄漢深，成莉.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）應(yīng)用概況［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（4）:831-833

［4］甘賓賓.高效液相色譜法測(cè)定低聚果糖的組分［J］.色譜，1999，17（1）:87-89

［5］唐軍，儲(chǔ)炬，李友榮.低聚果糖的檢測(cè)及其生產(chǎn)菌株的篩選［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1998，29（4）152-155

［6］于曉瑾，仇凱，熊正河.食品中低聚果糖和低聚半乳糖檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（20）:125-129

［7］王一博，王春雨，曲范娜，等.高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定豬、牛、羊、熊膽粉中5種膽汁酸的含量［J］.分析化學(xué)，2014，42（1）:109-112

［8］趙燕燕，劉麗艷，杜光玲，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定奶制品中動(dòng)物水解蛋白［J］.食品科學(xué)，2010，31（20）:282-285

［9］劉葦，金城，孔維軍，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定牛黃中多種有效成分含量及其質(zhì)量相關(guān)性研究［J］.分析化學(xué)，2010，38（4）:522-526

［10］李海龍，王靜，張英春，等.HPLC-ELSD法測(cè)定苦杏仁中苦杏仁苷的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（1）:109-112

Comparison of Three Methods for Determination of Fructooligosaccharides

ZHANG Yuan-yuan，ZHANG Bin，HAN Ai-yun，ZHANG Wen-na，YU Long-quan
（Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

A High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection method was compared with Paper Chromatography method and High Performance Liquid Chromatography-Refractive Index Detection method in this study.The comparison result showed that the High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection method was significantly better than the other two methods.The experimental conditions were showed as follows：Compounds were successfully separated on a Waters NH2column（4.6 mm）by a gradient elution.Acetonitrile and water were selected as the mobile phase A and B with a flow rate of 1.0 mL/min.The parameters of ELSD were set as follow：drift tube temperature was 85℃，air carrier gas flow rate was 2.0 L/min.The result showed that good separation effect was obtained and the recoveries were ranging from 97.73%to 99.39%.The intra-day precision（RSD）was less than 1.2%and the within-day precision（RSD）was less than 2.8%.The method showed good separation effect，accuracy，reproducibility，and suitable for the detection of fructooligosaccharides in practice.

high performance liquid chromatography；evaporative light scattering detection；fructooligosaccharides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.025

2015-05-20

石家莊學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（NO.13BS014）資助

張媛媛（1983—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品分析與食品安全，功能性食品研究與開發(fā)。