李晶，張樹(shù)良，趙冬梅

（天津市紅橋區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，天津300122）

發(fā)酵法制取大豆染料木素的研究

李晶，張樹(shù)良，趙冬梅

（天津市紅橋區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，天津300122）

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定，得出納豆芽孢桿菌A-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)染料木素的最佳條件為8%豆粕添加量，培養(yǎng)溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)64 h，pH為7.3，裝液量為50 mL/250 mL，接菌量為10%。最終目的產(chǎn)物染料木素的產(chǎn)率為0.12%，轉(zhuǎn)化率為89.13%，達(dá)到理想水平。

豆粕；發(fā)酵；染料木素；培養(yǎng)條件

大豆異黃酮是黃酮類(lèi)化合物，是大豆生長(zhǎng)中形成的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種生物活性物質(zhì)。大豆異黃酮含有九種葡糖苷和三種苷元，染料木素是其中活性功能最高的一種苷元成分，具有雌性激素及抗雌激素性質(zhì)、抗氧化作用，可以抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）的活性，也可以抑制拓?fù)洚愘?gòu)酶Ⅱ的活性，具有誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等作用，是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑，其抗癌作用及機(jī)制具有廣泛的應(yīng)用前景。

染料木苷在生物酶的作用下脫去一個(gè)葡萄糖形成染料木素，納豆芽胞桿菌分泌的β-葡萄糖苷酶就具有同樣的作用。本試驗(yàn)通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)定，得出納豆芽孢桿菌A-3發(fā)酵豆粕在最佳條件下，染料木素的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率明顯提高。

1材料與方法

1.1菌種

納豆菌A（BacillusnattoA）、納豆菌B（BacillusnattoB）。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基

葡萄糖3%，大豆蛋白胨2%，pH7.2～7.4，NaCl1%。

1.2.2斜面培養(yǎng)基

牛肉膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%，瓊脂2%，pH7.2～7.4，NaCl 0.5%。

1.2.3發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

葡萄糖2%，大豆蛋白胨2%，NaCl 1%，MgSO40.05%，CaCl20.01%，pH 7.2～7.4。

1.3儀器與主要原料

全溫振蕩器（型號(hào)HZQ-QX）：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；高溫高壓滅菌鍋（型號(hào)：MLS-3750）：SANYO Electric Co.，Ltd；三頻數(shù)控超聲波清洗器（型號(hào)：KQ-200VDV）：昆山市超聲儀器有限公司；液質(zhì)聯(lián)用儀（型號(hào)：Xevo-TQD）：美國(guó)沃特斯公司；高效液相色譜儀（型號(hào)：Agilent1260）：美國(guó)安捷倫公司；脫脂豆粕：天津?qū)嵃l(fā)冠華生物科技有限公司提供。

1.4菌種篩選

1.4.1菌種純化

挑取納豆菌A和B各一環(huán)，分別溶于10 mL無(wú)菌水內(nèi)，配成10-1菌懸液，再逐步稀釋成10-3～10-4的菌懸液，取0.1 mL涂于平板培養(yǎng)24 h。

1.4.2菌種初篩

將納豆菌A和B從平板中分離的20株菌轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)，24 h后接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行酶活初測(cè)，接種量為10%，利用水楊苷法測(cè)定酶活，方法參照葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化、粗分離及其特征，選出酶活較高的菌株。

1.4.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

通過(guò)對(duì)pH、裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間等因素的選擇來(lái)優(yōu)化菌的產(chǎn)酶條件。

1.4.4菌種馴化

制定三級(jí)馴化方案。將發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的大豆蛋白胨用豆粕替代，替代量分別為2%、4%和6%，將篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行逐級(jí)馴化，保存于斜面培養(yǎng)基。

1.5發(fā)酵培養(yǎng)

將馴化后的菌株轉(zhuǎn)接至豆粕培養(yǎng)基進(jìn)行液體深層發(fā)酵，通過(guò)控制pH、裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間等因素，確定最佳的發(fā)酵方案，通過(guò)噴霧干燥將發(fā)酵液制成粉末，使最終目的產(chǎn)物染料木素產(chǎn)率達(dá)到理想值。

1.6測(cè)定方法

樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均用80%乙醇溶解，料∶液=1∶15，超聲波提取2次，20 min/次，45 Hz，提取液定容到250 mL，再稀釋一定濃度，進(jìn)行0.45 μm過(guò)濾。由于樣品含有其他與目的產(chǎn)品相近的物質(zhì)，干擾大，雜峰多，因此本試驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用的方法，進(jìn)一步確定染料木素的含量。

色譜條件：安捷倫C18柱（4.6 mmi.d.×250 mm，5 μm）；柱溫30℃；0.04 mol乙酸胺（乙酸調(diào)pH4）∶甲醇=70∶30為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2結(jié)果與分析

2.1菌種的篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)Natto A和Natto B兩株菌的分離純化，各挑選10株菌進(jìn)行發(fā)酵液的酶活測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　酶活測(cè)定結(jié)果Table 1Enzyme activity assay results U/mL

從整體來(lái)看，Natto A比Natto B的產(chǎn)酶水平要高，其中最高的是Natto A-3，可以選擇該菌進(jìn)行下一步馴化。另外有個(gè)別酶活是負(fù)值，據(jù)記載是在測(cè)酶活過(guò)程中，吸光度出現(xiàn)了負(fù)值。

2.2納豆菌生長(zhǎng)曲線

將馴化后的Natto A-3接入種子培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL，在48 h內(nèi)每隔4 h取樣利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定生物量，方法參照［納豆菌液體發(fā)酵條件的初步研究］結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　Natto A-3生長(zhǎng)曲線Fig.1Growth curve of Natto A-3

納豆菌從4 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，到40h時(shí)倒到最大值，后進(jìn)入平穩(wěn)期?？梢?jiàn)該菌株最佳發(fā)酵時(shí)間為40 h。

2.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究不同pH（7.2、7.3、7.4、7.5）采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其它發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速140 r/min、發(fā)酵溫度34℃、裝液量為50 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間為48 h對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　不同pH對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2Effect of different pH on the activity of β-glucosidase

由圖2可知，最佳起始pH為7.3，酶活達(dá)到39.2 U/mL。

2.3.2不同的裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究不同裝液量（20、30、40、50、60 mL）/250 mL采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其它發(fā)酵條件不變，對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　不同裝液量對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3Effect of different liquid loading on the activity of β-glucosidase

由圖3可知，最佳裝液量為40 mL/250 mL三角瓶，酶活達(dá)到40.1 U/mL，裝液量40 mL和50 mL時(shí)酶活相差不大，在實(shí)驗(yàn)中為了提高效率，可以選用50 mL的裝液量。

2.3.3不同的發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究不同溫度（28、32、37、40℃）采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方其它發(fā)酵條件不變，對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3.4不同的轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4　不同培養(yǎng)溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.4Effect of different cultivation temperature on the activity of β-glucosidase

研究不同轉(zhuǎn)速（70、120、150、180 r/min）采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其它發(fā)酵條件不變，對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　不同轉(zhuǎn)速對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.5Effect of different rotation speed on the activity of β-glucosidase

由圖5可知，轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，菌株的產(chǎn)酶最高，為39.5 U/mL。納豆菌為兼性好氧芽孢桿菌，由此可見(jiàn)，增大溶氧量對(duì)菌體產(chǎn)酶也有很大影響。

2.3.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究不同發(fā)酵時(shí)間（24、32、48、60、72 h）采用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其它發(fā)酵條件不變，對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.6Effect of different fermentation hours on the activity of β-glucosidase

由圖6可知，發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，菌株產(chǎn)酶最高，為49.6 U/mL。

2.4正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)一系列產(chǎn)酶條件優(yōu)化，得出NattoA-3的單因素產(chǎn)酶條件，分別是pH為7.3，裝液量為50mL/250mL，培養(yǎng)溫度為34℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵56 h。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間與其他條件相比對(duì)產(chǎn)酶的影響稍顯平穩(wěn)，其他條件的變化反差較大基本可以確定。另外，豆粕的添加量也是影響染料木素產(chǎn)率的重要因素。為了最大限度使產(chǎn)率提高，本實(shí)驗(yàn)采取三因素三水平L9（33）正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件。因素水平表見(jiàn)表2，結(jié)果分析表見(jiàn)表3。

表2　因素水平表Table 2Factor Level

表3　結(jié)果分析表Table 3Result Analysis

從表3結(jié)果分析表明，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主次順序分別為C＞A＞B，最佳優(yōu)化組合為A1B3C3，即8%豆粕添加量，180 r/min，培養(yǎng)64 h。從總體趨勢(shì)來(lái)看，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)染料木素的產(chǎn)率影響最大，在豆粕添加量相同的情況下，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)率越高。

3討論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定，得出納豆芽孢桿菌A-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)染料木素的最佳條件為8%豆粕添加量，培養(yǎng)溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)64 h，pH為7.3，裝液量為50 mL/250 mL，接菌量為10%通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)，目的產(chǎn)物染料木素的產(chǎn)率為0.12%，轉(zhuǎn)化率為89.13%，達(dá)到理想水平。發(fā)酵法生產(chǎn)的大豆染料木素產(chǎn)品對(duì)異黃酮中的染料木苷等糖苷形式進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高了染料木素的含量，對(duì)大豆豆粕進(jìn)行后續(xù)的加工延長(zhǎng)整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而且對(duì)大豆行業(yè)的發(fā)展起到了極其重要的促進(jìn)作用，產(chǎn)業(yè)化前景十分良好。

［1］孫體健，王浩江，曹曉峰，等.發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮的超聲波提取工藝［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006，18（5）:418-420

［2］Matusuura M.β-Glucosidases from soybeans hydrolyze daidzin and genistin［J］.Food Science，1993，58（1）:144-147

［3］孫麗艷，崔洪斌，趙琪，等.發(fā)酵罐制備大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化酶（β-糖苷酶）條件的研究［J］.大豆通報(bào)，2006，3:17-21

［4］孫艷，莊逢源.大豆異黃酮的微生物轉(zhuǎn)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32（5）:147-150

［5］徐世芳，陳愛(ài)瑛.微膠囊大豆異黃酮有效成分的HPLC含量測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2007，28（11）:473-475

Study on the Soybean Genistein by Fermentation Method

LI Jing，ZHANG Shu-liang，ZHAO Dong-mei
（Product Quality Supervision and Inspection Institute of Hongqiao District，Tianjin 300122，China）

The optimal conditions of producing genistein demonstrated by applying sigle factor and response surface methodology were that the concentration of soybean meal，rotation speed，fermentation hours the optimal pH were 8%，180 r/min，64 h，7.3，the liquid loading amount was 50 mL/250 mL，the bacteria amount was 10%.The yield of genistein ratio arrived at 0.12%，the conversion rate was 89.13%，which achieves the optimal level.

defatted soybean meal；fermentation genistein；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.019

2015-05-15

李晶（1969—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品檢驗(yàn)技術(shù)。