沈偉，胡玲玲，李赫宇，胡高升

（1.山東中醫(yī)藥高等專科學校，山東煙臺264199；2.即墨市第一人民醫(yī)院，山東即墨266219；3.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457；4.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧沈陽110016）

兩段培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體中腺苷積累動態(tài)研究

沈偉1，胡玲玲2，李赫宇3，胡高升4，*

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東煙臺264199；2.即墨市第一人民醫(yī)院，山東即墨266219；3.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457；4.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧沈陽110016）

對冬蟲夏草進行了兩階段培養(yǎng)，運用RP-HPLC法對菌絲體進行了腺苷和蟲草素含量測定，重點考察起始靜置培養(yǎng)時間對菌絲體中腺苷積累的影響，此外還比較了市售冬蟲夏草藥材和人工栽培北蟲草子實體中腺苷和蟲草素的含量。結果表明，當靜置培養(yǎng)起始時間為第3天時，培養(yǎng)6 d得到的菌絲體中腺苷含量為全程振蕩培養(yǎng)組的1.5倍，起始靜置培養(yǎng)時間越長，菌絲體中腺苷含量越低。培養(yǎng)菌絲體中腺苷含量為市售冬蟲夏草藥材的7倍左右，但兩者的蟲草素含量均顯著低于人工栽培的北蟲草子實體。

冬蟲夏草；兩階段培養(yǎng)；腺苷；北蟲草；含量測定

冬蟲夏草是麥角菌科（Clavicepitaceae）真菌冬蟲夏草菌［Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.］寄生在蝙蝠蛾科昆蟲蝙蝠蛾（Hepialus armoricnus Oberthur）幼蟲上的子座和幼蟲尸體的復合體［1］，中國傳統(tǒng)醫(yī)學認為冬蟲夏草性味甘、平，入肺、腎經(jīng)，功能益肺腎，止咳嗽，補虛損、益精氣，主要用于治療久咳虛喘、勞嗽痰血、陽痿遺精、腰膝酸痛等癥［2］?，F(xiàn)代藥理學研究表明它還有抑菌、抗癌、抗病毒、抗輻射、鎮(zhèn)靜、降血壓等作用［3］。

冬蟲夏草因其具備廣泛的藥理活性，從古至今就已廣泛用做民間的滋補品，但因其生長環(huán)境嚴格和寄生條件特殊，加上人為采挖過渡，天然資源稀少，價格昂貴。近年來關于冬蟲夏草的研究主要集中于無性形的確定、人工栽培、液體深層發(fā)酵培養(yǎng)、化學成分以及藥理作用的研究。經(jīng)大量研究表明人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲體，經(jīng)毒理、藥效和植化等研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，且一些成分的含量高于天然冬蟲夏草［4-8］，因此長期以來人們一直致力于深層發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體作為替代品［9］。腺苷和蟲草素是冬蟲夏草的主要活性物質。腺苷（C10H13N5O4），具有改善心腦血液循環(huán)［10］、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質釋放和調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性［11］等藥理作用，目前已作為冬蟲夏草的質控指標［2］。蟲草素即3′-脫氧腺苷，具有免疫調節(jié)、抗菌、抗病毒、抗癌以及抗衰老等作用［12］。

目前冬蟲夏草的發(fā)酵培養(yǎng)形式主要為液體培養(yǎng)，而最近的研究表明，兩階段培養(yǎng)法（振蕩培養(yǎng)+靜置培養(yǎng)）被證明在多種藥用真菌的培養(yǎng)中能顯著提高有效成分的積累［13］，目前冬蟲夏草的該方面研究較落后，僅見有對兩階段培養(yǎng)法中多糖積累的影響［14］，而未見該培養(yǎng)方法對腺苷和蟲草素積累的影響，基于上述研究現(xiàn)狀，本文在本課題組前期研究基礎上［15］，對兩階段培養(yǎng)法中較重要的影響因素——靜置培養(yǎng)起始時間——進行了優(yōu)化，并對得到的冬蟲夏草菌絲體進行了腺苷和蟲草素的含量測定，同時與市售冬蟲夏草藥材、北蟲草人工栽培品中兩種成分的含量進行了比較。

1材料和方法

1.1菌株

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis.）由沈陽藥科大學中藥學院中藥生物技術研究室保藏，保藏形式為凍干管，臨用時接種至斜面種子培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)。

1.2材料鑒定

所用冬蟲夏草藥材和北蟲草子實體均購自藥店，經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院賈凌云副教授鑒定為冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）藥材和北蟲草（Cordyceps militaris）干燥子實體。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1斜面種子培養(yǎng)基

固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯25%，蔗糖2%，瓊脂1.8%。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基

土豆200 g/L+蔗糖20 g/L+MgSO41.0 g/L+ KH2PO42.0 g/L+酵母提取物2.0 g/L+蛋白胨3.0 g/L+

1.4發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.4.1種子液的發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下，用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取2 cm2的菌種，轉入至150mL三角燒瓶中，培養(yǎng)基裝量：50 mL，培養(yǎng)溫度：（25±1）℃；光照強度：58.4 μmol·m-2· s-1；光照時間：24 h/d；搖床轉速：120 r/min，培養(yǎng)時間為7 d。

1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)與取樣方法

將種子液按體積接種量為5%進行接種至裝有50 mL培養(yǎng)基的150 mL三角燒瓶，培養(yǎng)條件同1.3.1，在振蕩培養(yǎng)開始的不同時間取出進行靜置培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)環(huán)境溫度（25±1）℃；光照強度：58.4 μmol·m-2·s-1；光照時間：24 h/d。靜置培養(yǎng)的取樣時間為振蕩培養(yǎng)的第3天，第5天和第7天，隔一定時間進行取樣，取樣時用60目不銹鋼篩網(wǎng)濾取菌絲體，50℃烘干至恒重，稱取重量，用研缽研成細粉，裝到離心管中，密封后置于干燥器中備用?？疾熘芷跒?9 d。取樣示意圖如圖1所示。

圖1　兩階段培養(yǎng)法樣品取樣示意圖Fig.1Diagrammatic sketch of two-stage cultured mycelium sampling of C.sinensis

1.5儀器與試藥

1.5.1儀器

高效液相色譜儀（L-2455 UV-VIS Diode-Array Detector，L-2420 Autosampler、L-2200 Pump，Heater AT-330，D2000色譜工作站）（HITACHI），PLATISIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：迪馬科技有限公司；HDL-超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-80BSH-II型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KH2200B型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ZQLY-300F振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器；TGL-18R冷凍高速離心機：珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司。

1.5.2試藥

高效液相分析中所用色譜純乙腈，甲醇均購自百靈威科技有限公司，液相用水為娃哈哈純凈水；培養(yǎng)基配制過程中水為二次蒸餾水，所用無機鹽、乙醇、酵母粉、瓊脂、蛋白胨、維生素等試劑均為分析純，購自山東禹王化學試劑有限公司，土豆為市售；所用腺苷和蟲草素標準品購自中國生物制品檢定院。

1.6分析條件

參照2010年版《中華人民共和國藥典》方法，并結合本研究室前期研究結果［15］，采用反相高效液相色譜法測定菌絲體中腺苷和蟲草素的含量。

檢測方法：流動相為乙腈∶水∶甲醇=2∶85∶2（v∶v∶v）；檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃，進樣量10 μL，含量測定方法為標準曲線法。

1.7菌絲體干重及腺苷和蟲草素的含量測定方法

1.7.1菌絲體干重測定

將培養(yǎng)物用60目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾出物用等體積蒸餾水洗滌，于50℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，稱定即為菌絲體干重。

1.7.2腺苷和蟲草素標準品溶液的配制

分別精密稱取3.0 mg腺苷和蟲草素對照品，加入90%甲醇溶解，量瓶中定容至25 mL，搖勻，用90%甲醇依次稀釋，最終分別得到濃度為0.3、0.9、1.5、3.0、6.0、9.0、15.0、30.0 μg/mL的腺苷和蟲草素系列對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

1.7.3標準曲線與線性范圍考察

取1.7.2中得到的腺苷和蟲草素標準品，分別進行標準曲線的制備，進樣量10 μL，每個濃度重復進樣3次，取平均值進行標準曲線的繪制，將對照品濃度（μg/mL）（Y）與峰面積（X）進行線性回歸，得腺苷對照品標準曲線方程為：Y=0.000072X+0.00058（R2=0.9996），在所測試濃度范圍內(nèi)線性良好；蟲草素標準曲線方程為：Y=0.000 089X+0.003 1（R2=0.999 8），在所測試濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.7.4供試品樣品溶液配制

精密稱取20 mg各組菌絲體粉末（80目），精密加入1 mL 90%甲醇，充分混懸后，稱取重量，超聲提取30 min，補足失重，離心（13 000 r/min，10 min，室溫），取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，將濾液進行分析，記錄腺苷標準品的出峰時間和峰面積，記錄樣品溶液中與標準品保留時間一致的峰面積，利用1.7.3中得到的標準曲線進行含量計算。冬蟲夏草藥材和北蟲草干燥子實體均同法烘干，研成粉末（80目），同法提取。

1.7.5精密度考察

取3.0 μg/mL的腺苷和蟲草素標準品溶液進樣分析5次，RSD均＜3%。

1.7.6回收率考察

平行稱取9份已知含量樣品各20 mg，分別加入相當于樣品中腺苷和蟲草素含有量的80%，100%，120%對照品溶液，每組3份，50℃揮干溶劑后，按1.7.4項下操作，將測得值減去已知量，再除以加入量，計算加樣回收率，結果表明，腺苷和蟲草素的加樣回收率均在95%～105%范圍內(nèi)。

1.7.7重現(xiàn)性考察

取同一批樣品5份，按1.7.4項下操作，分析后，讀取峰面積，求得樣品中腺苷和蟲草素的含量，計算RSD值，結果表明，兩者的RSD值均＜3%。

2結果與討論

2.1靜置培養(yǎng)對菌絲體形態(tài)的影響

圖2顯示的為振蕩培養(yǎng)3 d后取出，靜置培養(yǎng)6 d的菌餅（3～9號樣品）。

圖2　靜置培養(yǎng)冬蟲夏草菌餅（3～9號樣品）形態(tài)Fig.2Characteristics of static cultured mycelium of C.sinensis（Sample number 3-9）

由圖2可見，靜置培養(yǎng)對菌絲體外觀具有顯著影響，在振蕩培養(yǎng)條件下，菌絲體為直徑不超過0.5 cm的菌球，肉眼可見表面觸手狀菌絲體，但是在靜置培養(yǎng)中，在第三天，已經(jīng)可見培養(yǎng)物表面呈現(xiàn)細密的白色茸毛，并互相連接在一起，形成一整塊具有一定機械強度的菌餅，菌餅形態(tài)見圖2，僅有少量菌絲體仍以菌球狀態(tài)存在。

2.2不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體生物量的影響

不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體生物量的影響見圖3。

圖3　不同培養(yǎng)方式對菌絲體生物量的影響Fig.3Effects of starting time of static culture on biomass accumulation of cultured C.sinensis mycelium

在振蕩培養(yǎng)條件下，菌絲體生物量最高點為培養(yǎng)的第7天，達到17.5 gDW/L，此生物量產(chǎn)量亦為所有培養(yǎng)條件下最高值，可見，振蕩培養(yǎng)有利于得到更高的生物量。此后至12 d，生物量緩慢減少，12 d以后，生物量迅速降低，這與培養(yǎng)基中碳源已經(jīng)基本消耗完畢，菌絲體生長進入衰亡期。在靜置培養(yǎng)起始時間不同的條件下，生物量均在靜置培養(yǎng)的第3天有一明顯下降趨勢，隨后生物量才開始上升。靜置培養(yǎng)條件下的生物量最高值為第3天開始靜置培養(yǎng)9 d時達到，為13.9 g/L（以干重計）。此外，由圖3可見，隨著起始靜置培養(yǎng)時間的延長，各處理組的最大生物量逐漸減小。

2.3不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體中腺苷含量的影響

不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體中腺苷含量的影響見圖4。

圖4　不同培養(yǎng)方式處理組腺苷含量隨時間變化趨勢Fig.4Effects of starting time of static culture on adenosine content in cultured C.sinensis mycelium

在振蕩培養(yǎng)菌絲體中腺苷的含量最高點在培養(yǎng)的第五天，為0.105%，此后逐漸降低，而在靜置培養(yǎng)條件下，最高值為起始靜置培養(yǎng)時間為第3天的處理組，其含量最高點在培養(yǎng)的第9天，高達0.14%，高于對照組的最高含量40%左右，此外，在靜置培養(yǎng)起始時間為第5天的處理組，腺苷含量的最高點相同，最高含量為0.132%，此后，兩處理組中腺苷含量均呈顯著下降趨勢，起始時間為第7天的菌絲體中，腺苷含量持續(xù)下降，與全程振蕩培養(yǎng)的處理組中趨勢類似，幾種培養(yǎng)條件下，在第19天，菌絲體中的腺苷含量降到最低值。由此可見，合適的起始靜置培養(yǎng)時間可顯著提高冬蟲夏草菌絲體中腺苷的積累。

2.4不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體中腺苷產(chǎn)量的影響

為了得到優(yōu)化的培養(yǎng)條件，合理的收獲時間是重要考察指標，不同培養(yǎng)方式對冬蟲夏草菌絲體中腺苷產(chǎn)量的影響見圖5。

振蕩培養(yǎng)條件下，菌絲體中腺苷的最大產(chǎn)量為培養(yǎng)的第7天，為12.5 mg/L，而在兩階段培養(yǎng)條件下，起始靜置培養(yǎng)為3 d和5 d的處理組中，腺苷產(chǎn)量的最高點均在培養(yǎng)的第9天，分別達到18.5 mg/L和16.1 mg/L，較全程振蕩培養(yǎng)組高48%和28.8%。由此可見，靜置培養(yǎng)的確能顯著提高培養(yǎng)體系中目標成分的積累。

圖5　不同培養(yǎng)方式處理組腺苷產(chǎn)量隨時間變化趨勢Fig.5Effects of starting time of static culture on adenosine yield in cultured C.sinensis mycelium

2.5北蟲草栽培品，冬蟲夏草藥材和菌絲體中腺苷和蟲草素的含量測定

在對冬蟲夏草菌絲體進行含量測定的過程中，我們發(fā)現(xiàn)其中蟲草素的含量極低，因此，我們對市場上常見的北蟲草人工栽培品，藥店中零售的冬蟲夏草藥材進行了兩種成分的含量測定和比較，結果見圖6。

圖6　人工培養(yǎng)北蟲草，冬蟲夏草藥材與冬蟲夏草菌絲體提取物腺苷和蟲草素含量比較Fig.6Content determination of adenosine and cordycepin in twostage cultured mycelium and medicinal material of C.sinensis and artificial cultured C.militaris fruiting body

該結果表明，冬蟲夏草菌絲體和藥材中腺苷含量均能滿足藥典要求［2］（0.01%），但蟲草素含量遠遠低于北蟲草子實體，而北蟲草中雖然蟲草素含量高，但是腺苷含量卻又遠低于冬蟲夏草菌絲體和藥材。

3結論

兩階段培養(yǎng)法中，起始靜置培養(yǎng)時間為該工藝中的重要影響因素，本文的研究結果表明，起始靜置培養(yǎng)時間為第3天時，菌絲體中的腺苷含量以及培養(yǎng)體系中的腺苷產(chǎn)量均顯著高于全程振蕩培養(yǎng)的菌絲體。與全程振蕩相比，雖然培養(yǎng)時間稍長，但由于該過程參考文獻：

除光照外無需額外的能源消耗，因此，對于降低冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)成本，得到腺苷含量更高的菌絲體具有實際應用價值。此外，培養(yǎng)菌絲體中的腺苷含量高于藥店所售冬蟲夏草藥材6倍左右，人工栽培的北蟲草中的腺苷含量極低，但其中的蟲草素含量卻遠高于冬蟲夏草藥材及其培養(yǎng)菌絲體。我們將對該菌絲體的培養(yǎng)工藝進行進一步優(yōu)化，以求其中腺苷和蟲草素的含量均有顯著積累。

［1］林群英，鐘月金，李泰輝，等.蟲草屬生物學研究進展［J］.食用菌學報，2006，13（2）:89-92

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010版一部）［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:106

［3］郭宏春，高繼全，習欠云，等.冬蟲夏草研究進展［J］.微生物學雜志，2003，23（1）:50-55

［4］李紹平，李萍，季暉，等.天然與發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中核苷類成分的含量及其變化［J］.藥學學報，2001，36（6）:436-439

［5］沈曉云，李兆田，田軍.冬蟲夏草與蟲草菌絲有效成分分析比較［J］.山西大學學報，1998，21（1）:80-85

［6］董方霆，廖杰.HPLC分析天然及人工培殖冬蟲夏草菌絲體中的甘露醇［J］.藥物分析雜志，1998，12（S1）:124-125

［7］龔曉健，季暉，盧順高，等.人工蟲草多糖對小鼠免疫功能的影響［J］.中國藥科大學學報，2000，31（1）:53-55

［8］盧玉蘭，翁開敏.冬蟲夏草的藥理作用研究［J］.中國藥師，2003，6（6）:371-372

［9］魏濤，魏威凜，貢曉娟，等.冬蟲夏草菌絲體鎮(zhèn)咳、祛痰及抗菌消炎作用的研究［J］.食品科學，2002，23（3）:126-130

［10］Toda N，Okunishi H，Taniyama K，et al.Responses to adenine nucleotides and related compounds of isolated dog cerebral，coronary and mesenteric arteries［J］.Blood Vessel，1982，19（5）:226-236

［11］PellegA，PorterRS.Thepharmacologyofadenosine［J］.Pharmacotherapt，1990，10（3）:157-174

［12］李婧.蟲草菌素（cordycepin）研究進展［J］.美國中華健康衛(wèi)生雜志，2005，8（3）:27-30

［13］Qinghua Fang，Jianjiang Zhong.Two-stage cultue process for improved production of Ganoderic acid by liquid fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum［J］.Biotechnol Prog，2002，18（1）:51-54

［14］崔建東，張思，齊紅彥.冬蟲夏草多糖合成兩階段培養(yǎng)的設計與優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（2）:182-188

［15］王海霞，胡高升，蒙婭，等.RP-HPLC法測定冬蟲夏草發(fā)酵液凍干粉中蟲草素和腺苷含量［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19（4）:309-312

Studies on Adenosine Accumulation in Two-Stage Cultured Cordyceps sinensis Mycelium

SHEN Wei1，HU Ling-ling2，LI He-yu3，HU Gao-sheng4，*
（1.Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199，Shandong，China；2.The First Peoples's Hospital of Jimo City，Jimo 266219，Shandong，China；3.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；4.School of Traditional Chinese Material Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning，China）

Two-stage culture process was applied in mycelium of Cordyceps sinensis.The contents of adenosine and cordycepin was determined using RP-HPLC method to investigate the effects of initiation static culture time on the accumulation of biomass and adenosine.The contents of two compounds in cultured mycelium and medicinal material of C.sinensis and artificial cultured C.militaris fruiting body was also determined and compared.Our results demonstrated that，when static culture was conducted on third day of culture and for 6 days，the content of adenosine was 1.5 times of samples obtained in shaking condition.When the static initiation time was 5thand 7thday after culture，the content of adenosine was both lower than that in 3rdday. Besides，content of adenosine in static cultured mycelium is about 7 times of that in medicinal material of C.sinensis.artificial cultured C.militaris fruiting body contains much lower adenosine but higher cordycepin than C.sinensis mycelium and medicinal material.

Cordyceps sinensis；two-stage culture；adenosine；Cordyceps militaris；content determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.014

2015-06-08

沈偉（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：中藥化學與中藥炮制學。

胡高升（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：中藥資源學。