李娟 夏凱麗 王遠(yuǎn)宏 董蘊(yùn)琪 郝蕾

（天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

解淀粉芽孢桿菌LJ1搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

李娟 夏凱麗 王遠(yuǎn)宏 董蘊(yùn)琪 郝蕾

（天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LJ1是從天津土壤中分離篩選出的一株具有廣譜抑菌效果的生防菌株，該實(shí)驗(yàn)旨在明確B. amyloliquefaciens LJ1的抑菌譜并通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件提升其抑菌效果。通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)檢測(cè)菌株LJ1對(duì)14種病原真菌的抑制效果；采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件；最后用孢子萌發(fā)法和盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化后發(fā)酵液的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明B. amyloliquefaciens LJ1對(duì)黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、蘋果腐爛病菌（Valsa ceratosperma）等11種病原真菌有抑制作用；優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件為溫度30℃、初始pH 5、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量50 mL/250 mL；優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯 200 g，蔗糖10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，蒸餾水1 000 mL。經(jīng)發(fā)酵條件與培養(yǎng)基優(yōu)化后，B. amyloliquefaciens LJ1發(fā)酵液對(duì)Botrytis cinerea孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)99.7%，盆栽實(shí)驗(yàn)防效達(dá)51.08%。

解淀粉芽孢桿菌LJ1；抑菌譜；發(fā)酵條件優(yōu)化

微生物農(nóng)藥在四大種類生物農(nóng)藥中占有舉足輕重的地位［1］。芽孢桿菌由于抗逆性高、作用機(jī)制復(fù)雜、功能明顯等因素已作為微生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）是芽孢桿菌的一個(gè)種，也是重要的防治植物病害的微生物資源［2-4］。解淀粉芽孢桿菌能夠分泌多種依賴NRPs（Nonribosomal peptide synthetase，NRPs）和PKS（Polyketide synthetase，PKS） 以 及NRPS/PKS代謝途徑組合的次生代謝抑菌物質(zhì)［5-8］，并協(xié)同其他機(jī)制如誘導(dǎo)抗病性［9］、促進(jìn)生長(zhǎng)［10］和提高植物營(yíng)養(yǎng)吸收率［11］等因素保障植物的健康。優(yōu)化發(fā)酵條件，增加生物活性物質(zhì)的含量和微生物的生物量是提高生防制劑應(yīng)用效果的的重要前提，與此相關(guān)的與解淀粉芽孢桿菌的研究已有報(bào)道［12-14］。

解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens LJ1是從土壤中分離獲得的一株生防菌株，它與環(huán)境相容性好，對(duì)生物安全，大田試驗(yàn)表明LJ1發(fā)酵液對(duì)瓜類白粉病有很好的防治效果并可以誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生抗病性［15，16］。本實(shí)驗(yàn)探索解淀粉芽孢桿菌LJ1的抑菌譜和對(duì)黃瓜灰霉病防治能力，并對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化，以期提高其抑菌能力和防病效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）LJ1由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離，篩選，保存。指示菌：黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、小麥赤霉病菌（Gibberrella zeae）、栆輪紋病菌（Macrophoma kuwastsukaii）、板栗炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、蘋果腐爛病菌（Valsa ceratosperma）、稻瘟病菌（Phyricularia grisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、蘋果青霉病菌（Penicillium expansum）、棗黑點(diǎn)病菌（Coniothyrium fucsidulum）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、高粱炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麥全蝕病菌（Gaeumanomyces graminis）由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 16 g，蒸餾水 1 000 mL。LB培養(yǎng)基：Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 16 g，蒸餾水 1 000 mL。種子培養(yǎng)基：Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 000 mL。無(wú)碳培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。無(wú)氮培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，KH2PO41.36 g，Na2HPO42.13 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 5 g，CaCl20.005 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1平板抑菌效果的測(cè)定 采用管碟法［17］稍加改進(jìn)來(lái)檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌LJ1對(duì)上述14種病原真菌的抑菌效果。取25℃培養(yǎng)5 d的指示菌，取4 cm2的菌塊加入3 mL無(wú)菌水沖洗，制成菌絲懸浮液，取1 mL菌絲懸浮液加入30-50℃的PDA培養(yǎng)基中迅速搖勻，倒入培養(yǎng)皿中（厚度為3 mm），待凝固后將牛津杯置于培養(yǎng)基中央，加入200 μL在PDA液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min培養(yǎng)16 h的LJ1發(fā)酵液。將平板置于27℃下培養(yǎng)3 d后，觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 種子液的制備：將解淀粉芽孢桿菌LJ1在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種在種子培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。取48支含5 mL種子培養(yǎng)基的試管，接10 μL種子液加入試管中，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h用種子培養(yǎng)基接LJ1菌株，置于搖床中，28℃ 200 r/min搖菌。每隔2 h測(cè)定培養(yǎng)液吸光值，每個(gè)處理重復(fù)3次。以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制LJ1菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 以初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量為試驗(yàn)因素，按照正交設(shè)計(jì)表L9（34）設(shè)計(jì)4個(gè)因素、3個(gè)水平（表1）的正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化B. amyloliquefaciens LJ1的搖瓶發(fā)酵條件。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在PDA液體培養(yǎng)基中加入1%的種子液，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表各處理不同發(fā)酵條件搖菌26 h。各組發(fā)酵液稀釋100倍后采用載玻片孢子萌發(fā)法測(cè)定對(duì)B.cinerea孢子萌發(fā)的抑制效果。

萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%

LJ1發(fā)酵液抑菌率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%

1.2.4 解淀粉芽孢桿菌LJ1培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1培養(yǎng)基碳源的選擇 參考谷醫(yī)林的研究［18］，在無(wú)碳培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的可利用碳源，28℃，200 r/min搖菌26 h。分別用分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm下的OD值，篩選出有利于LJ1菌株生長(zhǎng)的幾種碳源。將篩選出的碳源加入無(wú)碳培養(yǎng)基中，終濃度分別為10 g/L、20 g/L、50 g/L。加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復(fù)3次，用活菌計(jì)數(shù)法［19］測(cè)定培養(yǎng)基中菌量，進(jìn)而篩選出最佳碳源及其最適濃度。

1.2.4.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1氮源的選擇 在無(wú)氮培養(yǎng)基中分別加入終濃度為5 g/L的牛肉浸膏、酵母膏、草酸銨、乙酸銨、硝酸鉀、尿素、硫酸銨、亞硝酸鈉、鉬酸銨、氯化銨、磷酸二氫銨、黃豆粉、硝酸鈣等氮源，28℃，200 r/min搖菌26 h。用分光光度計(jì)檢測(cè)OD600值和轉(zhuǎn)接劃線的方法來(lái)測(cè)定LJ1可利用氮源，并選取有利于菌株LJ1生長(zhǎng)的氮源，進(jìn)一步篩選。將初步篩選出的氮源加入無(wú)氮培養(yǎng)基中，終濃度分別為5 g/L、10 g/L、20 g/L。加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復(fù)3次，用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)基中菌量，篩選出最佳氮源及其最佳濃度。

1.2.4.3 解淀粉芽孢桿菌LJ1無(wú)機(jī)鹽的選擇 將MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、FeC6H5O7、FeCl3、CuSO4·5H2O加入PDA液體培養(yǎng)基中終濃度分別為0. 5 g/L、1 g/L、1.5 g/L。以PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照，加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復(fù)3次，用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)基中菌量，篩選出最佳金屬離子及其的最佳濃度。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化驗(yàn)證 用孢子萌發(fā)法和盆栽試驗(yàn)法來(lái)驗(yàn)證培養(yǎng)基和條件優(yōu)化后的發(fā)酵液抑菌效果。將種子液以1%接種量分別接種到PDA液體培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基中。PDA液體培養(yǎng)基發(fā)酵條件：28℃，200 r/min，初始pH 7.0 裝液量100 mL，優(yōu)化培養(yǎng)基采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件，采用孢子萌發(fā)法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)的抑制效果。

盆栽實(shí)驗(yàn)：將優(yōu)化前、后發(fā)酵液稀釋100倍后噴施于三葉期黃瓜幼苗上，每個(gè)處理重復(fù)6盆，每盆3株黃瓜苗，以無(wú)菌水噴灑為對(duì)照。24 h后，將1×105CFU/mL的黃瓜灰霉病菌孢子懸浮液均勻噴灑在黃瓜苗葉片上。于20℃，保濕，溫室密閉培養(yǎng)，7 d后觀察黃瓜苗發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)并計(jì)算發(fā)酵液防治效果，病情分級(jí)參考曹春娜等的方法［20］。

病情指數(shù)=∑［（各級(jí)病葉數(shù)×代表級(jí)值）］（/調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高代表級(jí)值）×100

防治效果（%）=（對(duì)照發(fā)病指數(shù)-處理發(fā)病指數(shù)）/對(duì)照發(fā)病指數(shù)×100

2 結(jié)果

2.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1平板抑菌效果

將LJ1與14種病原真菌做平板對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌LJ1與高粱炭疽病菌（C. graminicola）、小麥紋枯病菌（R. cerealis）、小麥全蝕病菌（G. graminis）對(duì)峙培養(yǎng)無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，對(duì)黃瓜灰霉病菌（B. cinerea），蘋果炭疽病菌（G. cingulata）、棗輪紋病菌（M. kuwastsukaii）等11種病原菌均產(chǎn)生明顯抑菌圈，其中對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制效果最高，抑菌圈直徑達(dá)15.73 mm。對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果顯示B. amyloliquefaciens LJ1具有廣譜抑菌效果，有較好的應(yīng)用潛力。

表2 B. amyloliquefaciens LJ1和植物病原真菌的對(duì)峙培養(yǎng)

2.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)和繁殖規(guī)律。細(xì)菌的生長(zhǎng)一般要經(jīng)過(guò)延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、死亡期4個(gè)時(shí)期，LJ1的生長(zhǎng)曲線如圖1所示為S型生長(zhǎng)曲線。在0-6 h LJ1菌量處在延滯期，LJ1菌株繁殖較少，為細(xì)菌的分裂增殖儲(chǔ)存充足的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物。6-14 h細(xì)菌LJ1處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，OD值快速上升。14-26 h細(xì)菌LJ1處于穩(wěn)定期，群體生長(zhǎng)停止，生長(zhǎng)曲線趨于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)B. amyloliquefaciens LJ1的活菌數(shù)和抑菌效果均在穩(wěn)定期進(jìn)行檢測(cè)。26 h后進(jìn)入死亡期，細(xì)菌繁殖速度減慢逐漸死亡。

圖1 B. amyloliquefaciens LJ1的生長(zhǎng)曲線

2.3 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)不同發(fā)酵條件培養(yǎng)的B. amyloliquefaciens LJ1發(fā)酵液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)的抑制效果如表3所示，表4為正交實(shí)驗(yàn)各因素不同水平的評(píng)價(jià)。由表4可以看出不同pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量培養(yǎng)的LJ1發(fā)酵液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)的抑制效果不同。由極差R值的大小比較說(shuō)明對(duì)LJ1菌株發(fā)酵液抑菌能力的影響順序?yàn)檠b液量＞ pH值＞溫度＞轉(zhuǎn)速。其中，裝液量和pH值對(duì)發(fā)酵液的抑菌效果影響較大。裝液量50 mL，pH值5，溫度30℃均顯著好于其他水平。轉(zhuǎn)速200 r/min與150 r/min無(wú)顯著差異，但顯著好于100 r/min。綜合考慮仍選擇200 r/min為最優(yōu)轉(zhuǎn)速。因此，B. amyloliquefaciens LJ1發(fā)酵條件最優(yōu)組合為裝液量50 mL，pH值5，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。

表3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化B. amyloliquefaciens發(fā)酵條件［L9（34）］

表4 發(fā)酵條件的多重比較

2.4 解淀粉芽孢桿菌LJI培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 C源對(duì)解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 以16種解淀粉芽孢桿菌LJ1可以利用碳源為單一碳源搖菌培養(yǎng)。以脯氨酸、葡萄糖、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基搖菌后B. amyloliquefaciens LJ1生長(zhǎng)狀態(tài)最好，培養(yǎng)基渾濁度較高。在無(wú)碳培養(yǎng)基中分別加入10 g/L、20 g/L、50 g/L的脯氨酸、葡萄糖、蔗糖，28℃，200 r/min搖菌26 h 后，檢測(cè)B. amyloliquefaciensLJ1菌量，結(jié)果如圖2所示，不同碳源對(duì)LJ1菌量的影響不同。在無(wú)碳培養(yǎng)基中加入相應(yīng)碳源后，碳源對(duì)菌量的影響由大到小依次為：蔗糖＞葡萄糖＞脯氨酸，當(dāng)加入10 g/L蔗糖時(shí)菌量達(dá)到最大，為9.08×108CFU/mL。由圖2可知各碳源最適濃度均為10 g/L，加入過(guò)量碳源不利于LJ1的生長(zhǎng)。因此，選擇10 g/L的蔗糖為最佳碳源。

2.4.2 氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 將各氮源加入無(wú)氮培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示B. amyloliquefaciens LJ1可利用氯化銨、牛肉浸膏、酵母膏、草酸銨、乙酸銨、尿素、硫酸銨、磷酸二氫銨、硝酸鈣、黃豆粉為唯一氮源；不可利用鉬酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鉀。其中以黃豆粉、酵母膏和硝酸鈣為氮源時(shí)B. amyloliquefaciens LJ1生長(zhǎng)狀態(tài)最好，培養(yǎng)基渾濁度較高。

圖2 碳源對(duì)菌株LJ1生長(zhǎng)量大小的影響

所篩選的氮源就LJ1生長(zhǎng)量而言，都有一個(gè)較為適合的濃度（圖3），硝酸鈣適宜濃度為5 g/L，酵母膏適宜濃度為10 g/L，黃豆粉適宜濃度為20 g/L。比較而言，以有機(jī)氮源對(duì)LJ1的生長(zhǎng)較為有利，尤其黃豆粉最為明顯，其最大生長(zhǎng)量達(dá)到1.59×108CFU/mL，分別為前兩者最大生長(zhǎng)量的2.02倍和2.56倍。同為有機(jī)氮源，黃豆粉較酵母膏更適宜LJ1的生長(zhǎng)，可能由于黃豆粉富含速效氮源和遲效氮源，以及碳水化合物和微量元素，更適宜細(xì)菌快速繁殖。因此，選擇20 g/L的黃豆粉為最佳氮源。

圖3 氮源對(duì)菌株LJ1生長(zhǎng)量大小的影響

2.4.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 在PDA液體培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)鹽，搖菌后檢測(cè)其菌量。結(jié)果（圖4）表明培養(yǎng)基中加入CuSO4·5H2O后菌株LJ1在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)極慢，說(shuō)明Cu2+對(duì)解淀粉芽孢桿菌LJ1的生長(zhǎng)有抑制作用，這與Cu2+使細(xì)菌蛋白變性有關(guān)。如圖4所示，MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、FeC6H5O7、FeCl3均能促進(jìn)LJ1菌量的增長(zhǎng)，且MgCl2·6H2O ＞MnSO4·H2O ＞ ZnSO4·7H2O ＞ FeC6H5O7＞FeCl3。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MgCl2·6H2O達(dá)到1.5 g/L時(shí)，其菌量較加入0.5 g/L和1.0 g/L有明顯的躍升，為2.403× 1010CFU/mL。這一現(xiàn)象與鎂離子參與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的合成，尤其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)繁殖影響較大有關(guān)［21］。因此，研究中選擇1.5 g/L MgCl2·6H2O作為適宜濃度。

圖4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)LJ1生長(zhǎng)量（107）的影響

2.5 優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PDA液體培養(yǎng)基（優(yōu)化前）為：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，初始pH7.0，28℃，200 r/min，裝液量100 mL/250 mL。

優(yōu)化后為：馬鈴薯 200 g，蔗糖 10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，初始pH 5.0，30℃，200 r/min，裝液量50 mL/250 mL。如表5所示，經(jīng)過(guò)優(yōu)化B. amyloliquefaciens LJ1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件后，發(fā)酵液對(duì)B. cinerea的抑制和防治效果都得到了顯著提高。LJ1發(fā)酵液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)的抑菌率從65.0%提高至99.7%；溫室條件下對(duì)黃瓜灰霉病發(fā)生的防治效果從30.98%提高到51.08%。

3 討論

B. amyloliquefaciens LJ1對(duì) B. cinerea、G. cingul-ata、G. zeae、M. kuwastsukaii等11種病原真菌均有較好的抑菌效果。優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液及發(fā)酵條件不僅可以提高菌體的生長(zhǎng)速度，還可以有效地提高抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量及防效［22-24］。對(duì)B. amyloliquefaciens LJ1發(fā)酵條件的研究表明，溫度30℃、初始pH 5、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量50 mL時(shí)，LJ1發(fā)酵液抑菌活性達(dá)到最高。其中，裝液量和pH值對(duì)發(fā)酵液的抑菌效果影響較大。裝液量與抑菌效果呈負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)速與抑菌效果呈正相關(guān)，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌LJ1為好氧型細(xì)菌。這一結(jié)果暗示LJ1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)多少和菌體數(shù)量有相關(guān)性，通過(guò)提高溶解氧可以加速LJ1的生長(zhǎng)，提高LJ1細(xì)胞生長(zhǎng)量，從而縮短其進(jìn)入次生代謝的時(shí)間，加快、加大次生代謝抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。pH值主要通過(guò)影響菌體細(xì)胞膜滲透性及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)離子化程度來(lái)影響菌體對(duì)養(yǎng)分的吸收。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LJ1菌株在初始pH 4的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)，而初始pH 5時(shí)效果最好，說(shuō)明B. amyloliquefaciens LJ1適宜在偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)，過(guò)酸過(guò)堿均不利于它的生長(zhǎng)，與Zhao等［25］的研究一致。

表5 發(fā)酵液對(duì)黃瓜灰霉的抑制與防效分析

細(xì)菌菌體發(fā)酵過(guò)程中，延滯期和對(duì)數(shù)期主要進(jìn)行菌體的繁殖，菌量大量增加，進(jìn)入穩(wěn)定期后菌量基本保持穩(wěn)定，細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物積累，常常在這個(gè)時(shí)期進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和檢測(cè)。B. amyloliquefaciens LJ1在14-26 h處于穩(wěn)定期，在26 h時(shí)菌量保持較高但略有下降，此時(shí)次生代謝物質(zhì)較多，因此選擇發(fā)酵26 h時(shí)進(jìn)行抑菌能力檢測(cè)。在不同培養(yǎng)條件下，菌量是次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生多少的一個(gè)重要前提條件［26］，這與上述結(jié)果與分析相一致。研究中也發(fā)現(xiàn)，一些礦物質(zhì)元素能提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量，尤以Mg2+最為明顯，這和Mg2+是一些功能蛋白的重要輔酶因子有關(guān)，Mg2+可以提高其催化活性，加快代謝進(jìn)程，提高抑菌活性［27］。

碳氮比是微生物發(fā)酵培養(yǎng)中關(guān)鍵的參數(shù)，它反映了培養(yǎng)基中碳、氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和兩者的比率。眾多研究發(fā)現(xiàn)，適宜的碳氮比是提高發(fā)酵活性物質(zhì)含量和生物量的重要條件［28-30］。本研究中，氮源對(duì)生物量變化的影響尤其明顯，分析認(rèn)為主要是因?yàn)槭艿教嫉嚷实挠绊懰隆４送?，由于培養(yǎng)基中沒有目的性加入緩沖物質(zhì)，不適宜的碳氮比也可能通過(guò)影響動(dòng)態(tài)發(fā)酵過(guò)程中pH值來(lái)影響發(fā)酵生物量。

4 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌LJ1有廣譜的抑菌效果。優(yōu)化后發(fā)酵條件為30℃、初始pH 5、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量50 mL/250 mL，裝液量和pH值對(duì)發(fā)酵液的抑菌效果影響較大。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為：馬鈴薯200 g，蔗糖 10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL。在優(yōu)化條件下B. amyloliquefaciens LJ1發(fā)酵液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)的抑制率從65.0%提高至99.7%；溫室條件下對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果從30.98%提高到51.08%。

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（責(zé)任編輯李楠）

The Optimization of Fermentation Condition in Flask for Bacillus amyloliquefaciens LJ1

Li Juan Xia Kaili Wang Yuanhong Dong Yunqi Hao Lei
（Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384）

Bacillus amyloliquefaciens strain LJ1 isolated from the soil of Tianjin is biocontrol one with broad inhibition spectrum. This study aims to clarify the inhibition spectrum of strain B. amyloliquefaciens LJ1 and improve the antifungal activity by optimizing the medium composition and fermentation conditions. The confront culture was performed to test the antifungal activity of LJ1 on 14 phytopathogenic fungi. The medium composition and fermentation conditions were optimized by single-factor and orthogonal experiments. Finally， the inhibitory effect of optimized broth was tested by methods of spore germination and pot experiment. The results showed that B. amyloliquefaciens LJ1 inhibited 11 tested fungal pathogens， i. e. ， Botrytis cinerea， Glomerella cingulata， and Valsa ceratosperma. The optimal fermentation conditions were as temperature 30℃， initial pH5.0， rotation speed 200 r/min， and medium volume 50 mL/250 mL. The optimal composition of the medium was 200 g potato， 10 g sucrose， 20 g soybean flour， 1.5 g MgCl2·6H2O， and 1 000 mL distilled water. In conclusion， the inhibition rate of B. amyloliquefaciens LJ1 to the conidia germination of B. cinerea reached 99.7%， and the control efficacy of pot experiment was 51.08% under the optimum fermentation medium and culture conditions.

Bacillus amyloliquefaciens LJ1；inhibition spectrum；optimization of fermentation condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.031

2015-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171892），國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201410061107）

李娟，女，碩士研究生，研究方向：果樹病蟲害綜合治理；E-mail：jie_5101@163.com；夏凱麗為并列第一作者

王遠(yuǎn)宏，男，博士，教授，研究方向：生物農(nóng)藥及合成生物學(xué)；E-mail：wangyh@tjau.edu.cn