印翠 張俊玲 施志儀 孫文慧 孫近近

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

應(yīng)用于miRNA靶標(biāo)檢測(cè)的雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及鑒定

印翠 張俊玲 施志儀 孫文慧 孫近近

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

以牙鲆空通氣孔同源框2基因（empty spiracles homeobox 2，emx2）為例，構(gòu)建包含emx2 3'UTR區(qū)的野生型和突變型雙熒光素酶重組報(bào)告表達(dá)載體，以期應(yīng)用于miRNA靶標(biāo)的檢測(cè)。利用Trizol 法提取牙鲆成魚(yú)精卵巢混合組織總 RNA，參照已克隆出來(lái)的 emx2 基因cDNA 序列，設(shè)計(jì)并合成 emx2 3'UTR片段的引物并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將得到的基因片段和 psiCHECK-2 載體雙酶切后，用T4 DNA Ligase 酶進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化入 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選后得到野生型重組質(zhì)粒；同時(shí)采用定點(diǎn)誘變法對(duì)emx2基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變并采用同樣的方法形成突變型重組質(zhì)粒。對(duì)野生型和突變型重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測(cè)序分析。成功克隆了emx2 3'UTR區(qū)，并將emx2 3'UTR區(qū)的miRNA靶點(diǎn)序列GACTTGA突變?yōu)?AGTCCAG，成功構(gòu)建了野生型和突變型包含emx2 3'UTR區(qū)的miRNA靶標(biāo)檢測(cè)載體。通過(guò)RT-PCR、基因重組及定點(diǎn)誘變技術(shù)成功構(gòu)建了應(yīng)用于miRNA靶標(biāo)驗(yàn)證的野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體 psiCHECK-emx2-3'UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR。

牙鲆；miRNA；emx2；定點(diǎn)誘變；psiCHECK-emx2-3'UTR；psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR

MicroRNAs（miRNAs）是一類長(zhǎng)約22個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA，普遍存在于各種生物中［1-4］，通過(guò)與靶基因的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的互補(bǔ)結(jié)合［5，6］，進(jìn)而誘導(dǎo)靶mRNA 的切割降解、翻譯抑制等其他調(diào)節(jié)機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［7］。已有報(bào)道表明，多達(dá)30%的基因成為了miRNA的潛在靶基因［8，9］，因而miRNA靶標(biāo)的檢測(cè)逐漸成為研究miRNA功能的重要環(huán)節(jié)。全基因組研究已經(jīng)證實(shí)了miRNA在哺乳動(dòng)物性腺的發(fā)育中起著舉足輕重的作用。我們先前已在牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺中鑒定了 141個(gè)成熟miRNA，有些miRNA如pol-miR-143、pol-let-7a等在精卵巢中均有較高表達(dá)，而一些miRNA如pol-miR-26a、pol-miR-26b等則存在明顯的性別差異表達(dá)［10］。在豬的卵巢中，miR-26b被報(bào)道可通過(guò)直接下調(diào)ATM基因的表達(dá)而體外誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡［11］。我們通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù) TargetScan、PicTar和miRBase等靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，牙鲆空通氣孔同源框2基因（Empty spiracles homeobox 2，emx2）的3'UTR區(qū)可與pol-mir-26a，-26b完全互補(bǔ)結(jié)合從而可能成為其靶基因。

emx2基因是果蠅ems（Empty spiracles）的同源結(jié)構(gòu)域基因，含同源轉(zhuǎn)錄因子，在果蠅頭部的早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。脊椎動(dòng)物emx2位于同源盒基因（Homeoticgenes，hox）家族的外側(cè)，在哺乳動(dòng)物發(fā)育中的大腦表達(dá)并對(duì)端腦背側(cè)、大腦皮層和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用［12-14］。近幾年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物Emx2基因在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中是一種必需的增殖抑制基因［15］；而在發(fā)育中的泌尿生殖系統(tǒng)以及能形成排泄器官和生殖系統(tǒng)的原基細(xì)胞中也有表達(dá)，并呈生殖周期性變化［16，17］。缺乏EMX2可使老鼠患特納綜合癥即性腺發(fā)育不完全［18］。生殖周期中自然發(fā)生的EMX2表達(dá)下降對(duì)正常的增殖、蛻膜化等都是必需的。目前，對(duì)此基因在魚(yú)類性腺發(fā)育中的功能及其與miRNA的關(guān)聯(lián)研究甚少。因此，本研究以牙鲆emx2基因?yàn)槔寺×薳mx2 3'UTR區(qū)，并對(duì)其潛在的pol-miR-26a-26b可能結(jié)合位點(diǎn)，即miRNA識(shí)別靶mRNA的“種子序列”進(jìn)行定點(diǎn)誘變的基礎(chǔ)上，構(gòu)建野生型和突變型emx2基因 3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，旨在為后續(xù)研究miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)emx2基因的表達(dá)而調(diào)控牙鲆性腺發(fā)育的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol Reagent（Invitrogen 公司，美國(guó)）；M-MLV、Rnasin inhibitor、Dpn I酶和psiCHECKTM-2靶標(biāo)克隆載體（Promega，美國(guó)）；DL2000、1 kb DNA Ladder Marker、PrimeSTAR HS DNA-Polymerse、T4 DNA Ligase、Not I、Xho I、TaKaRa TaqTM（TaKaRa公司，日本）；DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（DONGSHENG BIOTECH，中國(guó)）；E.coli DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)先前我們已測(cè)序得到的牙鲆miRNA和emx2基因序列，通過(guò)靶基因預(yù)測(cè) 軟 件 miRBase（http：//www.mirbase.org/），PicTar WEB INTERFACE（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/ PicTar_vertebrate.cgi），TargetScanFish 6.2（http：//www. targetscan.org/fish_62/）和computer-based RNAhybrid（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ submission. html）等預(yù)測(cè)miRNA與其靶基因3'UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 牙鲆總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR釣取基因 根據(jù)我們已克隆的牙鲆emx2基因序列設(shè)計(jì)3' UTR區(qū)引物，上下游引物5'端分別攜帶Xho I、NotI酶切位點(diǎn)。用于構(gòu)建野生型靶標(biāo)克隆載體的引物為3'-emx2XhoIF：5'-CCGCTCGAGGAGGAAGGCTCGGA GTCTCAG-3'，3'-emx2NotIR：5'-ATAAGAATGCGGCC GCGCATTTCTGTACATGGAATACGC-3'。

取剛解剖完的牙鲆成魚(yú)精卵巢混合組織1 g，研磨后采用Trizol法提取精卵巢混合組織總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，3'-emx2Xho IF、3'-emx2NotIR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，包含2.5 μL 2 mmol/L dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5 μL 25 mmol/L MgSO4、1.5 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus Neo、17.1 μL ddH2O、上下游引物各0.3 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s，58℃退火15 s，68℃ 延伸 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后取5 μL產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

采用DONGSHENG公司的DNA凝膠回收試劑盒，對(duì)上述目的片段進(jìn)行回收。回收的目的片段與pMD19-T載體連接，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 野生型重組報(bào)告載體的構(gòu)建 分別取野生型emx2 3'UTR PCR回收產(chǎn)物和psiCHECK-2載體各15 μL，用Xho I/Not I雙酶切，在50 μL的酶切體系中加入1.5 μL Xho I、1.5 μL Not I、5 μL 10×buffer、27 μL ddH2O。37℃反應(yīng)3 h左右。酶切產(chǎn)物采用DONGSHENG公司的DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。在10 μL目的片段和載體的連接體系中加入3 μL酶切回收的PCR產(chǎn)物、2 μL 酶切回收的載體psiCHECK-2、1 μL 10×Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、3 μL ddH2O。16℃連接2 h，連接物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上，37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取若干陽(yáng)性克隆于3 mL LB管中搖床過(guò)夜培養(yǎng)后，采用G-SHUN高純質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得野生型psiCHECK-emx2-3'UTR重組質(zhì)粒。利用雙酶切和測(cè)序?qū)﹃?yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.2.4 突變型重組報(bào)告載體的構(gòu)建 根據(jù)miRBase、TargetScanFish 6.2、RNAhybrid預(yù)測(cè)出的miRNA與其靶基因3'UTR 區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的序列，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，將emx2 3'UTR中第971位堿基GACTTGA突變?yōu)锳GTCCAG。同時(shí)結(jié)合Primer 5.0 和Oligo 6來(lái)設(shè)計(jì)包含突變序列的引物，委托上海英駿公司合成。引物序列為：mutemx2F：5'-GCACGCAGCCTTTCTG TCAGAGTCCAGCCCTCCAGTGAAAGTTGCCAAG-3'；mutemx2R：5'-CTTGGCAACTTTCACTGGAGGGCTGG ACTCTGACAGAAAGGCTGCGTGC-3'。

以上述構(gòu)建好的野生型重組報(bào)告載體psiCHECK-emx2-3'UTR的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，質(zhì)粒稀釋50倍 后取1 μL做 模 板。 采 用KOD Plus neo DNA Polymerase進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變。在0.2 mL EP管中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。在25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 L 2 mmol/L dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5 μL 25 mmol/L MgSO4、1 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus Neo、16.6 μL ddH2O、上下游引物各0.3 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性3 min；98℃變性15 s，58℃15 s，68℃ 4 min 30 s，共20 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，取1 μL Dpn I酶 37℃ 4 h處理去除帶甲基化的原始模板鏈，取1 μL Dpn I酶處理的DNA轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上，37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取若干陽(yáng)性克隆于3 mL LB管中搖床過(guò)夜培養(yǎng)后，采用G-SHUN高純質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得突變型psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR重組質(zhì)粒。利用雙酶切和測(cè)序?qū)﹃?yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

為確定emx2與miRNA之間的關(guān)系，通過(guò)利用4種生物信息學(xué)軟件（TargetScan、PicTar、miRBase和RNAhybrid）預(yù)測(cè)出牙鲆emx2 是pol-miR-26a 和pol-miR-26b 的潛在靶基因，pol-miR-26a和-26b與emx2 結(jié)合位點(diǎn)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 牙鲆信使RNA（mRNA）emx2 的序列鑒定

2.2 靶標(biāo)3'UTR區(qū)克隆結(jié)果

采用RT-PCR 法從牙鲆成魚(yú)精卵巢混合組織中成功擴(kuò)增出emx2 3'UTR長(zhǎng)為1 027 bp 的特異性擴(kuò)增條帶（圖2）。與pMD19-T 克隆載體連接后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定并進(jìn)行DNA 測(cè)序，結(jié)果顯示，測(cè)序所得序列與已知序列一致。

圖2 牙鲆emx2 3'UTR的克隆

2.3 野生型和突變型重組報(bào)告載體的鑒定

將構(gòu)建的野生型psiCHECK-emx2-3'UTR和突變型psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR重組報(bào)告載體，用 Xho I/Not I雙酶切陽(yáng)性克隆，得到線性質(zhì)粒和emx2 3'UTR區(qū)基因片段，經(jīng)電泳分析（圖3）顯示，大小分別約為6 000 bp 和1 000 bp，與空質(zhì)粒和牙鲆emx2 3'UTR 基因大小一致。而圖4的泳道1（大小位于6 000-7 000 bp之間）與圖3泳道1大小接近，表明野生型和突變型重組報(bào)告載體均構(gòu)建成功。

圖3 野生型重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

圖4 突變型重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證

2.4 定點(diǎn)突變結(jié)果

野生型和突變型質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明定點(diǎn)突變成功，即emx2 3'UTR區(qū)miRNA識(shí)別“種子序列”GACTTGA突變?yōu)锳GTCCAG。

3 討論

miRNA通過(guò)與其靶基因結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。一些miRNAs通過(guò)下調(diào)它們作用的靶基因而在哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，例如已有報(bào)道稱miR-26b通過(guò)直接下調(diào)其靶基因ATM可在體外誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡；而且miR-26b的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，在miR-26b的mimic轉(zhuǎn)染組中顆粒細(xì)胞的DNA斷裂顯著上升［11］。同樣，在老鼠的卵巢中，mmu-miR-124與精巢發(fā)育重要基因SOX9直接結(jié)合。在原發(fā)性性腺細(xì)胞培養(yǎng)中mmu-miR-124的過(guò)表達(dá)可抑制SOX9基因的表達(dá)［19］。Lin等已詳細(xì)闡述了pol-miR-26是性腺差異表達(dá)的miRNA［10，11，20］，而Pellegrini等發(fā)現(xiàn)EMX2調(diào)控哺乳動(dòng)物性腺的發(fā)育［17，18，21］。為了研究在牙鲆性腺發(fā)育中pol-miR-26a、-26b與 emx2之間的相互關(guān)系，本研究利用TargetScan、PicTar等軟件成功預(yù)測(cè)了pol-miR-26a、-26b的靶基因并從中選取了性腺發(fā)育相關(guān)基因emx2，同時(shí)預(yù)測(cè)出pol-miR-26a、-26b與emx2的結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，本研究成功克隆了牙鲆emx2 3'UTR區(qū)，對(duì)其與pol-miR-26a、-26b的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，從而構(gòu)建了其野生型和突變型的靶標(biāo)報(bào)告載體。

根據(jù)羅師平等［22］的報(bào)道，盒式突變法、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變法及重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)定點(diǎn)突變法等是比較常用的定點(diǎn)突變法。但與此同時(shí)這些方法操作復(fù)雜，非特異性突變較多等，使定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)受到一定阻力。本研究中采用了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)的基因定點(diǎn)突變的方法。它非常巧妙地抓住了甲基化的模板質(zhì)粒對(duì)Dpn I酶十分敏感，而合成的突變質(zhì)粒對(duì)Dpn I酶切不敏感這一特性，通過(guò)酶切去除模板質(zhì)粒，只得到突變質(zhì)粒，使之操作準(zhǔn)確無(wú)誤。此外，本研究所采用的KOD Plus neo DNA Polymerase是公認(rèn)最好的高保真高效率高速的PCR酶之一（保真性約為Taq酶的80倍），能快速高效的避免延伸過(guò)程中不必要的錯(cuò)配。本研究采用低次數(shù)的循環(huán)延伸而非聚合酶鏈反應(yīng)，有助于減少無(wú)意錯(cuò)配。整個(gè)突變只需20個(gè)循環(huán)、1次Dpn I酶切和1次轉(zhuǎn)化就完成了定點(diǎn)突變，突變成功率較高，尤其適于DH5α來(lái)源的DNA。無(wú)需進(jìn)行亞克隆，也無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端處理等，大大減少了上述傳統(tǒng)點(diǎn)突變的工作量，因而本研究通過(guò)該種定點(diǎn)突變，成功將emx2 3'UTR區(qū)miRNA識(shí)別“種子序列”GACTTGA突變?yōu)锳GTCCAG。

圖5 野生型與突變型質(zhì)粒的比對(duì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用的靶標(biāo)克隆載體psiCHECK-2載體［23］是目前使用較多的靶標(biāo)克隆載體，它可將RNAi與熒光素酶發(fā)光相偶聯(lián)，如本研究中將RNAi的靶片段（emx2 3'UTR區(qū)）插入到海腎熒光素酶hRluc下游的多克隆位點(diǎn)中；當(dāng)RNAi有效時(shí)，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA被降解，無(wú)發(fā)光反應(yīng)；當(dāng)RNAi無(wú)效時(shí)，轉(zhuǎn)錄的熒光素酶RNA被翻譯成熒光素并參與發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光即可反應(yīng)RNAi的效果。雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通常一個(gè)報(bào)告基因用于內(nèi)對(duì)照，使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化。此前使用螢火蟲(chóng)熒光素酶可結(jié)合β-半乳糖苷酶（β-Gal）、葡萄醛酸糖苷酶（GUS）或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）等作為雙報(bào)告基因，但β-Gal、CAT等檢測(cè)方式復(fù)雜、可檢測(cè)范圍和靈敏度均較差，不是理想的內(nèi)參。本研究應(yīng)用的psiCHECK-2載體，以海腎熒光素酶作為主要報(bào)告基因，還引入一個(gè)螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)歸一化，二者反應(yīng)都為發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)方式一致、檢測(cè)范圍和靈敏度相近，且二者發(fā)光反應(yīng)的底物不同，不會(huì)相互影響，是目前理想的雙報(bào)告基因系統(tǒng)。此外，psiCHECK-2載體含有單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子（HSV-TK）、多聚腺苷酸加尾信號(hào)［SV40 Late poly（A）］和質(zhì)粒所需的其他組成部分，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)外源插入片段，是目前研究miRNA與mRNA功能較為理想的表達(dá)載體。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用RT-PCR、基因重組和定點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建了牙鲆emx2基因的野生型（psiCHECK-emx2-3'UTR）和突變型（psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR）雙熒光素酶報(bào)告載體，為檢測(cè)牙鲆emx2基因與miRNA間的作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Construction and Identification of Dual-luciferase Reporter Plasmids Used in miRNA Target Detection

Yin Cui Zhang Junling Shi Zhiyi Sun Wenhui Sun Jinjin
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Taking Paralichthys olivaceus empty spiracles homeobox 2（emx2）as an example， we constructed the wild-type and mutant luciferase reporter plasmids containing emx2 3'UTR region for being utilized in miRNA target detection. The total RNA was extracted from the mixtures of testis and ovarian in adult fish with Trizol. Using previously-cloned cDNA sequences of emx2 as a reference， a pair of specific primers for emx2 3'UTR fragment were designed and synthetized， then amplified genes by RT-PCR and psiCHECK-2 vector were treated with double restriction enzyme digestion， and then ligated with T4 DNA Ligase. The ligated fragment was transformed into the competent cells of DH5α， then the wild-type recombinant plasmid were obtained by screening. In vitro site-directed mutagenesis of emx2 was carried out， and a site-directed mutant plasmid was generated by the same methods. The results indicated that the emx2 3'UTR of P. olivaceus was successfully cloned， and GACTTGA， the sequence of miRNA target sites in it was mutated to AGTCCAG. The wild-type and mutant luciferase reporter plasmids used in miRNA target detection were constructed successfully. In conclusion， with the techniques of RT-PCR， gene recombination and site-directed mutagenesis， the wild-type luciferase reporter plasmids psiCHECK-emx2-3'UTR and mutant one of psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR used in miRNA target detection were successfully constructed， which lays the foundation for further researches on identification and function of miRNA target emx2.

Paralichthys olivaceus；miRNA；emx2；site-directed mutagenesis；psiCHECK-emx2-3'UTR；psiCHECK-mutatedemx2-3'UTR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.026

2015-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（41306128），國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30271017）

印翠，女，碩士研究生，研究方向：牙鲆生殖與發(fā)育；E-mail：yincui082@163.com

施志儀，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：魚(yú)類發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zyshi@shou.edu.cn