馬普孫賽紅王玉芳李慧劉海映姜志強(qiáng)仇雪梅劉洋張濤王秀利

（1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023；3. 大連天正實(shí)業(yè)有限公司，大連 116011）

紅鰭東方鲀干擾素γ基因的原核表達(dá)

馬普1孫賽紅1王玉芳1李慧1劉海映2姜志強(qiáng)1仇雪梅1劉洋1張濤3王秀利1

（1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023；3. 大連天正實(shí)業(yè)有限公司，大連 116011）

旨在探究一種簡(jiǎn)單高效的獲取重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白的方法。提取紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）腎臟組織的總RNA，并以其為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增干擾素γ（IFNγ）基因序列。將IFNγ成熟肽序列與表達(dá)載體pET-32a（+）相連，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體PET-32a-IFNγ。將其轉(zhuǎn)化入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后獲得了重組表達(dá)IFNγ的基因工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，pET-32a-IFNγ在BL21中得到了表達(dá)。通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示紅鰭東方鲀IFNγ基因在大腸桿菌中的表達(dá)準(zhǔn)確，且目的蛋白表達(dá)量較高。

紅鰭東方鲀；干擾素γ；原核表達(dá)

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是近海底層肉食性魚(yú)類(lèi)，其生殖腺和肝臟等內(nèi)臟中產(chǎn)生的河豚毒具有潛在的醫(yī)藥開(kāi)發(fā)價(jià)值，在臨床上具有廣闊的前景［1］。紅鰭東方鲀是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，但水環(huán)境中存在的大量細(xì)菌和病毒使魚(yú)類(lèi)的皮膚和黏膜不斷受到侵襲，特別是弧菌、愛(ài)德華氏菌等的感染給紅鰭東方鲀的大規(guī)模養(yǎng)殖造成嚴(yán)重?fù)p失。干擾素（Interferon，IFN）在1957年首次被Isaacs提出，干擾素系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物抵抗病原體侵害的天然防御系統(tǒng)之一，在先天性免疫應(yīng)答中能夠有效廣泛地抑制感染的傳播［2］。IFNs 是一個(gè)蛋白家族，由3種主要類(lèi)型組成：Ⅰ型干擾素（IFN-α、-β和-ω），Ⅱ型干擾素（IFN-γ）和Ⅲ型干擾素（IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，又分別被稱(chēng)為IL-29、IL-28A和IL-28B），IFNs 對(duì)很多生物反應(yīng)有影響，包括對(duì)病原體的防御機(jī)制、對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中效應(yīng)細(xì)胞的管理和抗腫瘤效應(yīng)［3］。IFNs 通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。另外，IFNs 還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)抗病毒能力，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化也有很重要的調(diào)節(jié)活性［4-6］。

IFNγ主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，對(duì)抵抗病毒感染和胞內(nèi)細(xì)菌感染至關(guān)重要，能夠直接增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，激發(fā)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的免疫應(yīng)答［7-9］。IFNγ在免疫系統(tǒng)中的重要性除了其直接抑制病毒復(fù)制的能力外，更重要的是源于它對(duì)免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)的影響，而且還能夠直接或間接地上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（MHCⅠ和MHCⅡ）的抗原提呈作用［10］。IFNγ同時(shí)還是巨噬細(xì)胞的激活劑，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺死細(xì)菌、原生動(dòng)物和病毒性病原體的能力［11］。哺乳動(dòng)物的IFNγ能夠保護(hù)宿主抵抗胞內(nèi)病原體，如利什曼原蟲(chóng)、李斯特單核細(xì)胞增生菌和結(jié)核分枝桿菌等的侵染，這使得IFNγ在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗菌反應(yīng)中的作用更為明顯［12］。IFNγ基因已經(jīng)在許多魚(yú)類(lèi)中被克隆出來(lái)。斑點(diǎn)叉尾鮰（Channel catfish）能夠產(chǎn)生兩種IFNγ mRNAs（IFN-γ1和IFN-γ2），這兩個(gè)mRNA在不同的組織和細(xì)胞類(lèi)型中有不同的表達(dá)形式，牙鲆（Paralichthys olivaceus）同樣有兩種IFNγ轉(zhuǎn)錄本（IFN-γ1和IFN-γ2），這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本非常相似，僅有3個(gè)核苷酸不同［13］。紅鰭東方鲀的IFNγ基因在2004年首次被Zou［14］克隆出來(lái)。

在國(guó)內(nèi)，應(yīng)用于禽、豬、牛、犬等的基因工程干擾素抗病毒制劑已得到廣泛發(fā)展［15］。徐正中等［16］通過(guò)原核表達(dá)得到的重組牛IFNγ蛋白，有較高的抵抗病毒的能力。代麗等［17］克隆了雞IFNγ基因，并通過(guò)原核表達(dá)得到該重組蛋白，利用雞成纖維細(xì)胞—新城疫（CEF-NDV）系統(tǒng)檢測(cè)該重組蛋白的抗病毒活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)稀釋后的重組蛋白能有效抵抗病毒的攻擊。崔然［18］構(gòu)建了豬IFNγ基因的原核表達(dá)載體，并純化出該重組蛋白，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromt virus，PRRSV）和水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virtes，VSV）的能力。張海玲等［19］構(gòu)建了北極狐IFNγ的原核表達(dá)載體，并以包涵體的形式成功表達(dá)了該目的蛋白的成熟肽。活性測(cè)定表明，在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）和犬腎細(xì)胞（MDCK）細(xì)胞中復(fù)性后的重組北極狐IFNγ蛋白能夠抑制VSV病毒的繁殖。然而，有關(guān)魚(yú)類(lèi)基因工程干擾素制劑的研究并不是很多，本研究通過(guò)基因重組技術(shù)將紅鰭東方鲀IFNγ基因連接到表達(dá)載體pET-32a（+），并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，得到重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白，旨在為進(jìn)一步深入研究重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白活性及其在紅鰭東方鲀健康養(yǎng)殖上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用健康紅鰭東方鲀采自大連天正實(shí)業(yè)有限公司。采集紅鰭東方鲀腎臟組織并迅速凍存于液氮中，存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取-80℃冰箱中凍存的紅鰭東方鲀腎臟組織約0.1 g，按照RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa公司）的方法提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅鰭東方鲀干擾素γ基因的擴(kuò)增 根據(jù)已發(fā)表在GenBank上的紅鰭東方鲀IFNγ基因（AJ616216.2）序列，利用生物信息學(xué)軟件Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)引物為：IFN-F：5'-CATGCCATGGG CTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3'（下劃線(xiàn)部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）；IFN-R：5'-CCGCTCGAGATGACC TCGAATCGACATCT-3'（下劃線(xiàn)部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。

將實(shí)驗(yàn)提取的RNA利用PrimeScript RT reagent kit Perfect Real Time 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以該cDNA為模板用引物IFN-F/IFN-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增IFNγ基因。將擴(kuò)增片段與pMD19-T載體相連并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）篩選、挑取單克隆菌落，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 IFNγ蛋白的生物信息學(xué)分析 選取紅鰭東方鲀（T. rubripes，CAE82301.2）、斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides，AFM31242.1）、綠河鲀（Tetraodon nigroviridis，AHZ62714.1）、大西洋大比目魚(yú)（Hippoglossus hippoglossus，ADP55200.1），大西洋鮭（Salmo salar，NP_001165275.1）、 虹 鱒（Oncorhynchus mykiss，NP_001118092.1）、大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua，ACN41957.1）、原鴿（Columba livia，EMC77-410.1），美洲旱獺（Marmota monax，AAP80574.1）和馬（Equus caballus，ABS28998.1）的IFNγ氨基酸序列，利用ClustalW和MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 原核表達(dá)載體pET-32a-IFNγ的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD19-T-IFNγ為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后進(jìn)行膠回收，將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a（+）（本實(shí)驗(yàn)室保存）分別進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后用T4 DNA Ligase 連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定為陽(yáng)性后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-IFNγ。

1.2.5 原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá) 測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-IFNγ轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存），37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基（含Amp）震蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600=0.6左右時(shí)以1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h，取1 mL菌液離心棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，加入25 μL上樣緩沖液煮沸10 min后SDSPAGE電泳，鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 目的融合蛋白的分離純化及Western blotting鑒定 將100 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液6 000×g 離心10 min，棄上清，用20 mL PBS重懸菌體；然后對(duì)其超聲波破碎（工作9 s間歇9 s），12 000×g離心20 min；將上清和沉淀分別過(guò)ProteinIsoTMNi-NTA Resin（全式金生物技術(shù)有限公司）純化目的融合蛋白；將收集的洗脫液轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，在 0.5 mol/L、 pH為8.0 的Tris-HCl緩沖液中透析過(guò)夜；將透析產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

將純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE，100 mA、1.5 h轉(zhuǎn)印至NC膜上。然后將NC膜置于封閉液中浸泡30 min，加入His-tag抗體（天根生化科技有限公司）孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（天根生化科技有限公司）孵育30 min。以上各步驟之間用PBS緩沖液清洗3次，每次10 min。將NC膜放入避光處加顯色液，10 min之后在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果

利用 RNAiso plus提取紅鰭東方鲀腎臟總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，在凝膠成像儀下觀察，檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，28S和18S條帶清晰，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

圖1 紅鰭東方鲀總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 IFNγ基因的擴(kuò)增結(jié)果

將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后用于IFNγ基因成熟肽序列的PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）表明，在約522 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致，因此初步判斷該基因的成熟肽序列已被擴(kuò)增出來(lái)。

2.3 IFNγ氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化分析

經(jīng)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，T. rubripes IFNγ的氨基酸序列與T. nigroviridis一致性為62%，同源性較高，與E. coioides和H. hippoglossus的相似性分別為47%和43%，同源性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖3）表明，T. rubripes與T. nigroviridis聚為一支，親緣關(guān)系最近。

圖2 IFNγ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 IFNγ的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 原核表達(dá)載體pET-32a-IFNγ的鑒定

圖4顯示，重組表達(dá)載體pET-32a-IFNγ經(jīng)雙酶切后在522 bp處出現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明IFNγ基因已連入pET-32a（+）載體。將經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證的重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明已成功將IFNγ基因連接到原核表達(dá)載體pET-32a（+），重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 pET-32a-IFNγ質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.5 原核表達(dá)載體在BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET-32a-IFNγ導(dǎo)入表達(dá)宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖5）表明，與pET-32a空載相比重組質(zhì)粒pET-32a-IFNγ在BL21（DE3）中表達(dá)的蛋白圖譜中明顯多出一條特異的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，大小在37.8 kD左右，與預(yù)期大小一致，故初步判斷已誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白。進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)pET-32a-IFNγ在IPTG濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)6 h，誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)表達(dá)量最多（圖6），而誘導(dǎo)時(shí)間增加到8 h時(shí)相比6 h的表達(dá)量并無(wú)增加。

圖5 重組表達(dá)載體pET-32a-IFNγ的表達(dá)分析

2.6 融合蛋白的純化和Western blotting 分析結(jié)果

用Ni柱分別對(duì)IFNγ融合蛋白進(jìn)行破碎后沉淀和上清的純化發(fā)現(xiàn)，在破碎后的沉淀中純化得到以包涵體形式存在的IFNγ融合蛋白。Western blotting檢測(cè)（圖7）表明，在37.8 kD處出現(xiàn)一條單一條帶，帶有His標(biāo)簽的重組蛋白得到表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明純化得到的蛋白即為重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白。

3 討論

近年來(lái)，紅鰭東方鲀的病害不斷增多，對(duì)其病害的防治除了提供良好的養(yǎng)殖環(huán)境和進(jìn)行藥物治療等措施外，還需提高魚(yú)體自身的免疫能力。已有的研究表明，干擾素作為一種細(xì)胞因子在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面具有重要的作用。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中，重組的IFN-α/β已被廣泛用于腫瘤的治療和病毒性疾病的研究，一些魚(yú)類(lèi)重組干擾素的活性已通過(guò)ZF4細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，該細(xì)胞來(lái)源于斑馬魚(yú)的胚胎細(xì)胞［20］。實(shí)驗(yàn)證明加入了重組IFN的ZF4細(xì)胞能夠增強(qiáng)對(duì)黑魚(yú)彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）的抵抗能力，重組的鮭魚(yú)和鯰魚(yú)IFNs能夠保護(hù)TO細(xì)胞免受傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）的侵染和CCO細(xì)胞免受斑點(diǎn)叉尾鮰皰疹病毒（Channel catfish herpesvirus，CCV）的侵染［21，22］。重組的牙鲆IFNγ能夠增強(qiáng)牙鲆抵抗愛(ài)德華氏菌的能力［23］。

圖6 不同條件下pET-32a-IFNγ在BL21（DE3）細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖7 純化的IFNγ融合蛋白及Western blotting檢測(cè)結(jié)果

本研究通過(guò)克隆紅鰭東方鲀干擾素γ基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體，在大腸桿菌細(xì)胞中得到了融合表達(dá)的IFNγ。但在對(duì)重組載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)未加IPTG誘導(dǎo)的菌體和含有pET-32a空載體的菌體均出現(xiàn)少量與目的蛋白大小相似的蛋白條帶，這可能是由于菌體中含有與目的蛋白大小相似的其他蛋白造成的。另外，pET表達(dá)系統(tǒng)中存在目的蛋白的本底表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致未加誘導(dǎo)劑的情況下同樣有目的蛋白表達(dá)的情況。為了進(jìn)一步證明目的蛋白得到正確表達(dá)，本研究進(jìn)行了Western blotting檢測(cè)。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選用的是pET-32a構(gòu)建表達(dá)載體，所表達(dá)的目的蛋白是帶有His標(biāo)簽的融合蛋白，因此采用His標(biāo)簽抗體對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了Western blotting檢測(cè)，表明該蛋白能夠與抗His標(biāo)簽的單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng)，His標(biāo)簽得到正確表達(dá)，同時(shí)也表明載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達(dá)出目的蛋白。因此，本研究通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到的蛋白不僅大小與預(yù)期一致而且?guī)в蠬is標(biāo)簽，而這種情況只有目的蛋白具有，可以說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白即為重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白。在原核表達(dá)中除了目的基因本身序列對(duì)表達(dá)量有影響之外，誘導(dǎo)表達(dá)的條件對(duì)目的基因表達(dá)量同樣具有重要影響。在本研究中通過(guò)調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑的濃度，對(duì)重組載體的最佳表達(dá)條件進(jìn)行了探索，最終確定了重組紅鰭東方鲀IFNγ蛋白在IPTG為1 mmol/L，37℃條件下誘導(dǎo)6 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，為今后重組紅鰭東方鲀IFNγ的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆并獲得了紅鰭東方鲀干擾素γ（IFNγ）成熟肽的基因序列，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a-IFNγ，經(jīng)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)，重組體在大腸桿菌E. coli BL21（DE3）細(xì)胞中得以表達(dá)。利用Ni柱分離和純化得到的融合蛋白經(jīng)Western blotting分析，證明為重組的紅鰭東方鲀IFNγ。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Prokaryotic Expression of Recombinant IFNγ from Takifugu rubripes

Ma Pu1Sun Saihong1Wang Yufang1Li Hui1Liu Haiying2Jiang Zhiqiang1Qiu Xuemei1Liu Yang1Zhang Tao3Wang Xiuli1
（1. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023；2. College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian 116023；3. Dalian Tianzheng Industrial Corporation Limited，Dalian 116011）

The aim is to provide a simple and efficient method to acquire recombinant fusion proteins of IFNγ of T. rubripes. In this study，total RNA was extracted from the kidney tissue of T. rubripes， and used as a template to amplify gene sequences of interferon γ（IFNγ）by RT-PCR. The recombinant DNA pET-32a-IFNγ was constructed by ligating the mature peptide sequences of IFNγ and prokaryotic expression vector pET-32a（+）. The genetic engineering bacteria of recombinant expressed IFNγ were obtained by transforming pET-32a-IFNγ into the competent cells of Escherichia coli BL21（DE3）. The fusion proteins were obtained under the induction of IPTG. By purifying the express products and Western blotting test， the results showed the high-efficiency expression of recombinant pET-32a-IFNγ in E. coli and the accurate target protein.

Takifugu rubripes；interferon γ；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.025

2015-04-21

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201405003-2），大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B11NC091）

馬普，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物基因工程；E-mail：mapu88824@sina.com

王秀利，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物基因工程；E-mail：xlwang@dlou.edu.cn