黃麗娜 程婷婷 王新繪 魏原杰 趙潔 李金耀 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

棉鈴蟲β-actin基因的克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備

黃麗娜 程婷婷 王新繪 魏原杰 趙潔 李金耀 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

克隆獲得了棉鈴蟲β-actin基因，生物信息學(xué)分析表明，基因序列長1 131 bp，編碼376個氨基酸，理論分子量為41.77 kD，理論等電點5.16。氨基酸序列與其他物種肌動蛋白比較有98%-99%的一致性，與鱗翅目的家蠶具有99%的一致性。分析棉鈴蟲β-actin和小家鼠β-actin的抗原決定簇位點，發(fā)現(xiàn)兩者抗原表位有70.63%的一致性。同時原核表達(dá)、純化了棉鈴蟲β-actin蛋白，Western-blot結(jié)果表明表達(dá)正確。將純化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后，小鼠抗血清效價最高可達(dá)388 800，并且能與天然棉鈴蟲蛋白特異性結(jié)合。

棉鈴蟲；β-actin；克?。辉吮磉_(dá)；多克隆抗體

肌動蛋白（Actin）作為一類高度保守的蛋白質(zhì)，在不同生物間肌動蛋白氨基酸序列的同源性高達(dá)70%-100%［1］。根據(jù)其等電點的不同分為α、β、γ三種形態(tài)。該蛋白在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等生理活動中發(fā)揮著重要作用［2］。β-actin因具有分布廣泛、mRNA表達(dá)量高而且不同物種內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定的特點，因此也被稱為管家基因（Housekeeping gene），廣泛應(yīng)用于生物進(jìn)化、基因表達(dá)規(guī)律等方面的研究［3］。

在基因表達(dá)差異的研究中，轉(zhuǎn)錄水平可以通過基因芯片、Northern印跡（Northern blotting）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等技術(shù)測定，蛋白水平可以通過Western印跡（Western blotting）等技術(shù)檢測。但是，對基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)差異的研究中，為了準(zhǔn)確測定基因的表達(dá)量，都需要一個穩(wěn)定表達(dá)的管家基因標(biāo)準(zhǔn)化未知總RNA和總蛋白的量［4］。在上百種管家基因中，最常用的管家基因有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）、β-actin、28S RNA和19S RNA［5］。

棉鈴蟲（Helicoverpa amigera）是一種世界性的農(nóng)作物害蟲，目前棉鈴蟲已表現(xiàn)出對多種殺蟲劑的抗性［6］，造成農(nóng)作物大面積的減產(chǎn)。隨著棉鈴蟲抗藥性的增強(qiáng)及其帶來的環(huán)境污染問題［7］，化學(xué)防治的局限性也隨之顯現(xiàn)，基于分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，人們對棉鈴蟲抗藥性的研究更加深入。Western印跡作為分子生物學(xué)中常用的技術(shù)之一，是檢測蛋白表達(dá)水平最快捷的方法之一，在用Western印跡比較不同條件下或者不同組織中目的蛋白表達(dá)量，上樣量的微小差別可能對結(jié)果產(chǎn)生較大影響。由于內(nèi)參基因的表達(dá)量在不同組織和細(xì)胞中相對恒定，因此常常用內(nèi)參校正實驗結(jié)果，使結(jié)果更為可信。同時內(nèi)參也可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western印跡顯色或者發(fā)光體系等是否正常［8］。

β-actin在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂等生理活動中發(fā)揮著重要作用，是檢測基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平實驗中最常用的內(nèi)參之一。因此棉鈴蟲β-actin抗體在棉鈴蟲分子生物學(xué)的研究中發(fā)揮重要的作用。但市面上的β-actin抗體不僅價格昂貴，而且與棉鈴蟲蛋白的結(jié)合特異性較弱，因此本研究通過對棉鈴蟲β-actin基因的克隆與異源表達(dá)、純化棉鈴蟲β-actin融合蛋白，獲得特異性較強(qiáng)的棉鈴蟲β-actin多克隆抗體抗，旨在為制備價格低廉和特異性較強(qiáng)的β-actin多克隆抗體提供前提條件，為棉鈴蟲不同基因蛋白表達(dá)水平的研究提供素材，為深入探究棉鈴蟲β-actin及棉鈴蟲體內(nèi)不同基因的表達(dá)規(guī)律提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲與質(zhì)粒 棉鈴蟲來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，于室內(nèi)用人工飼料長期飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：25℃，相對濕度為75%，光周期（L∶D）為16 h∶8 h。表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒由本實驗室保藏，為原核表達(dá)載體，卡那霉素（Kana）抗性；ICR小鼠購買于新疆醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院。

1.1.2 試劑與儀器 pMD18-T（simple）、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、Oligo d（T）15Primers、Reverse Transcriptase MMLV（RNase H-）、Recombinant Ribonuclease Inhibitor和dNTP（10 mmol/L）購于寶生物工程（大連）有限公司；RNA-Solv Reagent提取液為Omega Bio-tek公司產(chǎn)品，蛋白Marker購于Thermo Scientific、全式金公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；大腸桿菌 DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；一抗鼠抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自中衫金橋公司；醋酸纖維素膜購自Millipore公司產(chǎn)品；實驗引物合成來自上海生工生物有限公司；其余所用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。美國紫外/可見分光光度計（NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer）。

1.2 方法

1.2.1 棉鈴蟲總RNA提取及cDNA的合成 使用RNA-Solv Reagent提取液提取棉鈴蟲6齡幼蟲的總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外/可見分光光度計檢測總RNA的濃度（ng/μL）和純度（OD260/280）。當(dāng)制備的RNA較純且無蛋白質(zhì)污染時，取1 μg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板，Oligo d（T）15為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 棉鈴蟲β-actin基因的克隆 根據(jù)前期篩選得到的β-actin全長序列（登錄號：HM629442.1），設(shè)計合成了β-actin PCR擴(kuò)增所需的兩個引物β-actin-F和β-actin-R（表1），預(yù)期片段約為1 121 bp。以棉鈴蟲cDNA為模板擴(kuò)增β-actin基因全長序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，反應(yīng)35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后與pMD18-T（Simple）載體16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽性重組子，正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-β-actin，送至華大基因進(jìn)行測序。

表1 擴(kuò)增β-actin的引物序列

1.2.3 棉鈴蟲β-actin的生物信息學(xué)分析 對獲得的棉鈴蟲β-actin進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用DNAMAN軟件翻譯氨基酸順序，進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量、等電點預(yù)測；應(yīng)用ExPASy ScanProsite（http：//prosite.expasy. org/scanprosite/）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)簽名序列預(yù)測；在NCBI網(wǎng)站上BLAST分析棉鈴蟲β-actin與不同物種氨基酸序列的相似性；利用MEGA 5軟件對不同物種β-actin氨基酸序列進(jìn)行多重比對，通過NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAstar軟件進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)分析，抗原指數(shù)、表面概率結(jié)構(gòu)分析免疫原性；同時利用在線預(yù)測網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）進(jìn)行抗原決定簇位點分析。

1.2.4 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-β-actin的構(gòu)建 將pMD18-T-β-actin和pET-28a載體分別用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，目的片段與載體經(jīng)切膠回收試劑盒回收后16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-β-actin，送至華大基因進(jìn)行測序。

1.2.5 融合蛋白pET28a-β-actin的表達(dá)及Westernblot鑒定 將測序結(jié)果正確的陽性克隆轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)，將菌液PCR鑒定正確的陽性克隆活化到對數(shù)期后，加入終濃度為0.5 mmol/L的 IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)4 h后超聲破碎至相對透亮，并將上清和沉淀分開處理，以未誘導(dǎo)的菌液作對照，12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組蛋白的表達(dá)及可溶性。

通過Western-blot檢驗?zāi)康牡鞍自贐L21菌株中的正確表達(dá)。將未經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的融合蛋白pET28a-β-actin經(jīng)12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，使用Mini-PROTEAN 3 Trans-Blot系統(tǒng)將融合蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉；TBST沖洗3次，加入1∶5 000稀釋的抗His標(biāo)簽的抗體（一抗），室溫孵育2 h；TBST沖洗3次后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h；TBST沖洗3次后采用DAB法顯色后觀察。

1.2.6 抗原制備 將誘導(dǎo)后的蛋白與5×電泳加樣緩沖液混合，沸水浴煮沸10 min后12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后用0.25 mol/L氯化鉀染色，在分子量約為42 kD處可見較寬條帶，切取該條帶進(jìn)行研磨，用磷酸鹽緩沖液溶解出蛋白后12 000 r/min離心10 min，取上清并-20℃凍存。

1.2.7 動物免疫 將棉鈴蟲β-actin蛋白與完全弗氏佐劑充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只50 μg劑量免疫4只ICR小鼠。2周后將棉鈴蟲β-actin蛋白與不完全弗氏佐劑充分乳化，以相同劑量免疫小鼠。2周和4周后再以β-actin蛋白與不完全弗氏佐劑乳化后相同的方法免疫小鼠。每次免疫后對小鼠進(jìn)行眼眶采血法收集血清。

1.2.8 ELISA檢測小鼠抗β-actin抗體效價及其特異性結(jié)合 用濃度為10 μg/mL融合蛋白His-β-actin于4℃過夜包被ELISA板，次日用PBST緩沖液洗滌3次，5%的脫脂奶粉37℃封閉1.5 h。再用PBST緩沖液洗滌3次后加入不同稀釋濃度的小鼠血清，37℃孵育2 h。洗滌后以1∶2 000的稀釋比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5 h。PBST洗3次后加TMB底物顯色，避光顯色15 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測A450/655。未免疫前的血清為對照，其A450/655值為N；免疫后的A450/655值為P，以P/N＞2.1判斷為陽性。

將6齡棉鈴蟲總蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE，使用Mini-PROTEAN 3 Trans-Blot系統(tǒng)將融合蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉后，經(jīng)過小鼠抗棉鈴蟲β-actin血清和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG孵育后加DAB顯色5 min，顯色結(jié)果用掃描儀進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 棉鈴蟲β-actin的克隆及cDNA序列特征

用設(shè)計的特異性引物，以棉鈴蟲cDNA為模板PCR擴(kuò)增后獲得1 131 bp左右的片段，經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后與pMD18-T（simple）載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌液PCR篩選陽性重組子（圖1），經(jīng)華大基因測序后用DNAMAN軟件與棉鈴蟲β-actin序列比對，結(jié)果一致，說明獲得正確的目的基因。該基因全長1 121 bp，有完整的開放閱讀框及起始密碼子ATG，共編碼376個氨基酸（圖2-A）。理論分子量為41.767 kD，等電點為5.16。從氨基酸組成上分析，棉鈴蟲β-actin富含Ala（7.9%）、Glu（7.39%）、Gly（7.39%）和Leu（7.39%）。BLAST分析為肌動蛋白超家族，氨基酸序列與其他物種肌動蛋白比較一致性達(dá)98%-99%。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18-T-β-actin的菌液PCR

2.2 棉鈴蟲β-actin與其他物種β-actin的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI上用BLAST分析發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲β-actin與家蠶（Bombyx mori）、斑馬魚（Danio rerio）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、人類（Homo sapiens）、小家鼠 （Mus musculus）、意蜂（Apis mellifera）的氨基酸序列一致性達(dá)到98%以上。利用MEGA5軟件對不同物種的β-actin氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過NJ法重復(fù)1 000次，其他參數(shù)設(shè)置均采用默認(rèn)設(shè)置。分析結(jié)果（圖2-B）表明，不同物種間β-actin保守性較好，其中棉鈴蟲與家蠶β-actin的氨基酸保守性最為接近，達(dá)到99%。鱗翅目的昆蟲與雙翅目、膜翅目的昆蟲分為兩個小分支，表明三者起源于共同的祖先。同時昆蟲β-actin又與哺乳動物人類和小家鼠分為兩個大分支。

2.3 棉鈴蟲β-actin親水性分析

利用DNAstar軟件的Protean程序的Plot-kytedoolittle法預(yù)測棉鈴蟲β-actin的親水性。結(jié)果（圖3）顯示，膜蛋白的大部分區(qū)域處于正高分區(qū)域（坐標(biāo)正值越大，代表其親水性越強(qiáng)），說該蛋白有較好的親水性，為親水性蛋白。

2.4 棉鈴蟲β-actin與小家鼠β-actin抗原決定簇分析

利用DNAstar軟件Protean程序的Jomeson-Wolf法和Emini法預(yù)測分析棉鈴蟲β-actin與小家鼠β-actin的免疫原性，結(jié)果（圖4）顯示大部分的抗原峰值大于臨界值0，處于正分處（縱坐標(biāo)值越大，免疫原性越強(qiáng)），理論上有較好的免疫原性。表面概率預(yù)測結(jié)果顯示，棉鈴蟲β-actin與小家鼠β-actin蛋白質(zhì)上的氨基酸序列同時在116-122、336-340和361-368區(qū)域的表面概率最高，為最優(yōu)抗原決定簇位點。

利 用在 線 預(yù) 測 網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/BepiPred/）分析棉鈴蟲和小家鼠β-actin抗原決定簇位點，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲β-actin和小家鼠β-actin分別有126個和118個抗原表位，并且有89個抗原表位在棉鈴蟲和小家鼠β-actin中都存在，分別占棉鈴蟲和小家鼠抗原表位總數(shù)的70.63%和75.42%。說明兩者在蛋白序列和抗原決定簇位點兩方面都具有較高的一致性。

2.5 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-β-actin的構(gòu)建

將經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的pMD18-T-βactin的目的基因與原核表達(dá)載體pET28a連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，提取重組質(zhì)粒再用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，獲得約1 100 bp的目的條帶（圖5-A）。雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)華大基因測序后用DNAMAN軟件對氨基酸序列進(jìn)行分析表明，測序結(jié)果與棉鈴蟲β-actin氨基酸序列一致，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.6 融合蛋白pET28a-β-actin的表達(dá)及Western-blot鑒定

通過12%的SDS-PAGE檢測融合蛋白pET28aβ-actin的表達(dá)（圖5-B）顯示，重組pET28a-β-actin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后與誘導(dǎo)表達(dá)前相比，誘導(dǎo)表達(dá)后有一條明顯的蛋白質(zhì)增強(qiáng)條帶，表達(dá)載體分子量為45 kD左右，與預(yù)期的β-actin蛋白相對分子量相似，初步說明目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。超聲破碎后的菌體將上清和沉淀分別處理后經(jīng)12%的SDS-PAGE檢測顯示，表達(dá)的融合蛋白主要存在于沉淀中，說明該蛋白以包涵體形式存在。

圖2 棉鈴蟲β-actin基因的cDNA核苷酸序列、推導(dǎo)的氨基酸序列（A）及肌動蛋白超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（B）

對誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行Western-blot驗證，檢測結(jié)果（圖5-C）顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲后沉淀與誘導(dǎo)表達(dá)前相比，誘導(dǎo)表達(dá)、超聲沉淀均有一條45 kD明顯的條帶，說明目的蛋白表達(dá)正確。

圖3 棉鈴蟲β-actin的親疏水性預(yù)測

圖4 棉鈴蟲（A）及小家鼠（B）β-actin抗原指數(shù)及表面概率

圖5 重組質(zhì)粒DH5α-pET28a-β-actin雙酶切鑒定（A）、融合蛋白pET28a-β-actin的誘導(dǎo)表達(dá)（B）及Western-blot鑒定（C）

2.7 抗原制備

通過12%的SDS-PAGE檢測融合蛋白pET28aβ-actin切膠回收，結(jié)果（圖6-A）顯示回收的pET28a-β-actin蛋白稀釋5倍后在分子量45 kD左右有一條明顯且單一的蛋白質(zhì)條帶。利用Bradford法蛋白濃度定量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后，蛋白含量為0.6 mg/mL，說明該蛋白可用于免疫小鼠。

2.8 ELISA檢測小鼠抗β-actin抗體效價及其特異性結(jié)合

在β-actin蛋白單獨免疫4次后，用ELISA測定小鼠的血清效價。4只小鼠抗血清ELISA檢測的A450/655值與陰性對照相比均＞2.1，1號- 4號小鼠分別為7.1、3.2、2.7和2.1，由圖6-B可知，4次蛋白免疫后4只小鼠的血清效價均達(dá)到1∶76 800，其中1號小鼠血清效價達(dá)到1∶388 800，說明4只小鼠的抗體滴度均達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。繼而用Western-blot檢測抗體的特異性，結(jié)果（圖6-C）顯示，6齡棉鈴蟲總蛋白經(jīng)過小鼠抗棉鈴蟲β-actin血清和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG孵育顯色后，在理論大?。?1.77 kD）處有較明顯的條帶，說明蛋白免疫制備小鼠抗棉鈴蟲β-actin血清能與天然棉鈴蟲β-actin特異結(jié)合。

3 討論

實時熒光定量PCR和Western印跡已經(jīng)成為研究基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的重要方法。為了能夠準(zhǔn)確地測定基因在不同水平的表達(dá)量需要選取穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為內(nèi)參對照，借以矯正RNA產(chǎn)量、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、蛋白上樣量等帶來的實驗誤差［4，9］。

鑒于肌動蛋白的特點及其在分子生物學(xué)研究中的作用，同時也為今后進(jìn)一步研究肌動蛋白基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)分析提供基礎(chǔ)資料，克隆得到了棉鈴蟲β-actin基因，并將其構(gòu)建到pET28a載體上，誘導(dǎo)表達(dá)得到了棉鈴蟲β-actin蛋白，為制備棉鈴蟲β-actin抗體提供了前提條件。棉鈴蟲β-actin基因生物學(xué)分析結(jié)果顯示，基因序列長1 131 bp，編碼376個氨基酸，理論分子量為41.77 kD，理論等電點5.16。棉鈴蟲β-actin與小家鼠β-actin蛋白質(zhì)在理論上有較好的免疫原性，在線預(yù)測分析兩者抗原決定簇位點，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲β-actin和小家鼠β-actin的抗原表中，有89個抗原表位在棉鈴蟲β-actin和小家鼠β-actin中都存在，分別占棉鈴蟲和小家鼠抗原表位總數(shù)的70.63%和75.42%。

用切膠回收的蛋白對4只ICR小鼠進(jìn)行蛋白免疫，獲得了棉鈴蟲β-actin的鼠抗血清，用前期純化的His-β-actin融合蛋白作為抗原，經(jīng)ELISA實驗驗證免疫4次后抗體效價均達(dá)到76 800以上，其中1號小鼠血清效價達(dá)到388 800。Western blot檢測結(jié)果顯示該血清能與天然棉鈴蟲總蛋白結(jié)合，表明此血清有較好的特異性。

本課題組前期運(yùn)用電脈沖基因?qū)敕ㄒ勋@得特異性較好的棉鈴蟲相關(guān)蛋白抗血清［10，11］，但是將棉鈴蟲β-actin重組質(zhì)粒pCDNA3-β-actin注射到昆明白和Balb/c小鼠中制備β-actin多克隆抗體，都未獲得特異性較好的多克隆抗體。而通過體外異源表達(dá)純化的β-actin融合蛋白佐以弗氏佐劑來免疫小鼠，獲得了效價高、特異性強(qiáng)的棉鈴蟲β-actin多克隆抗體?？赡苡捎诿掴徬x與小鼠β-actin氨基酸序列和抗原決定簇位點間具較高的一致性，致使重組質(zhì)粒pCDNA3-β-actin免疫激起的免疫反應(yīng)較低甚至不能激起免疫反應(yīng)。而異源表達(dá)純化的β-actin融合蛋白在佐劑的協(xié)助下可在小鼠體內(nèi)激起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，最高的可達(dá)38萬多。覃林花等［12］在制備抗血清中發(fā)現(xiàn)抗體滴度水平上基因免疫制備明顯低于蛋白免疫。由于基因免疫激起的抗血清滴度低［13，14］，有時甚至需要通過蛋白免疫加強(qiáng)抗體滴度水平［15］。因此，蛋白免疫與基因免疫制備抗血清相比，雖然過程相對復(fù)雜，成本相對較高，但是具有免疫應(yīng)答快速［16］、血清滴度高的優(yōu)點。

β-actin作為應(yīng)用最廣泛的內(nèi)參基因，在分子生物學(xué)的實驗中仍存在障礙。市面上幾乎沒有售賣棉鈴蟲β-actin抗體，本課題組選擇同源性較高的小鼠β-actin單克隆抗體檢測棉鈴蟲總蛋白，但未能與棉鈴蟲蛋白特異性的結(jié)合。而肌動蛋白作為研究基因蛋白水平上表達(dá)規(guī)律的重要內(nèi)參之一，獲得β-actin多克隆抗體是檢測棉鈴蟲不同蛋白表達(dá)規(guī)律的前提條件。

4 結(jié)論

本研究克隆得到棉鈴蟲 β-actin 基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)獲得其融合蛋白。利用表達(dá)的融合蛋白免疫小鼠獲得針對棉鈴蟲β-actin特異性較高的多克隆抗體。

［1］王洪振， 程焉平. 細(xì)胞核內(nèi)肌動蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄的研究進(jìn)展［J］. 吉林師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2005， 26（2）：34-36.

［2］Pederson T. Half a century of “the nuclear matrix”［J］. Molecular Biology of the Cell， 2000， 11（3）：799-805.

［3］Suzuki T， Higgins PJ， Crawford DR. Control selection for RNA quantitation［J］. Biotechniques， 2000， 29（2）：332-337.

［4］關(guān)波， 張富春. 植物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析中內(nèi)參基因的選擇與應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報， 2011（7）：7-11.

［5］張艷君， 朱志峰， 陸融， 等. 基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析中內(nèi)參基因的選擇［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2007， 34（5）：546-550.

［6］ Zhang H， Tang T， Cheng YR， et al. Cloning and expression of cytochrome P450 CYP6B7 in fenvalerate-resistant and susceptible Helicoverpa armigera（Hübner）from China［J］. Journal of Applied Entomology， 2010， 134（9-10）：754-761.

［7］趙建周， 范云六. 轉(zhuǎn)雙基因抗蟲煙草延緩棉鈴蟲抗性的作用評價［J］. 科學(xué)通報， 1999， 44（15）：1635-1639.

［8］李曉明. 水稻內(nèi)參蛋白質(zhì)的選擇及鑒定［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

［9］唐婷， 柳峰松， 任國棟. 謝氏寬漠王 β-actin 基因 cDNA 克隆，序列分析及表達(dá)量檢測［J］. 昆蟲學(xué)報， 2009， 51（11）：1210-1215.

［10］朱燕， 張富春， 馬紀(jì)， 等. 核酸免疫制備鼠抗棉鈴蟲FK506結(jié)合蛋白的多克隆抗體［J］. 生物技術(shù)通報， 2014（12）：141-146.

［11］趙潔， 趙文博， 朱燕， 等. 活體電穿孔法輔助核酸免疫制備小鼠抗棉鈴蟲精氨酸激酶的抗體［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014， 30（10）：1054-1057.

［12］ 覃林花， 黃長暉. 基因免疫和蛋白免疫制備抗 P16 抗血清［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報：英文版， 1998， 30（4）：347-351.

［13］Leinonen J. Characterization of monoclonal antibodies against prostate specific antigen produced by genetic immunization［J］. Journal of Immunological Methods， 2004， 289（1-2）：157-167.

［14］Gurunathan S， Klinman DM， Seder RA. DNA vaccines：immunology， application， and optimization［J］. Annual Review of Immunology， 2000， 18（1）：927-974.

［15］彭海林， 宋凱， 葉賽， 等. 利用基因免疫進(jìn)行日本血吸蟲Sj22蛋白抗體制備的研究［J］. 中國生物工程雜志， 2007， 27（1）：6-10.

［16］季玉紅. DNA免疫制備單克隆抗體的研究進(jìn)展［J］. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志， 2000， 22（5）：304-307.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Cloning，Expression and Preparation of Polyclonal Antibody of β-actin Gene from Helicoverpa armigera

Huang Lina Cheng Tingting Wang Xinhui Wei Yuanjie Zhao Jie Li Jinyao Liu Xiaoning
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

As one of the important internal controls， β-actin plays an crucial role in maintaining cell structure， cell movement， and cell division of physiological activity. It is one of the widely used internal controls in the detection of gene transcription and protein level. In this study，β-actin gene was cloned from cotton bollworm. Bioinformatics analysis showed that the open reading frame of β-actin was 1 131 bp， encoding 376 amino acids， the theoretical molecular weight was 41.77 kD， and isoelectric point was 5.16. The similarity of amino acid between the β-actin of cotton bollworm and one of other species was 98%-99%， while 99% similarity with Bombyx mori. Analysis of β-actin antigenic determinant sites from cotton bollworm and Mus musculus indicated that their homology was 70.63%. Concurrently， β-actin protein from prokaryotic expression of the gene was purified， and Western blot analysis showed that the expression was correct. The purified protein was used to immunize ICR mouse 4 times， the titer of mouse antiserum β-actin reached 388 800 by ELISA assay. Moreover， the antiserum was able to specifically bind with the total protein of the cotton bollworm.

Helicoverpa armigera；β-actin；cloning；prokaryotic expression；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.020

2015-05-25

國家自然科學(xué)基金項目（31471781），國家級大學(xué)生實訓(xùn)項目（201410755025）

黃麗娜，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲分子毒理學(xué)；E-mail：huanglinaxju@163.com

劉小寧，女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治；E-mail：liuxn0103@sina.com