楊曉倩 李桂蘭 劉晨光 董秋平 張鍇 喬亞科
(河北科技師范學(xué)院 生命科技學(xué)院,昌黎 066600)
農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)影響因素的研究
楊曉倩 李桂蘭 劉晨光 董秋平 張鍇 喬亞科
(河北科技師范學(xué)院 生命科技學(xué)院,昌黎 066600)
為提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的方法,以大豆子葉節(jié)為外植體,研究共培養(yǎng)階段浸染液濃度及外界培養(yǎng)條件(共培養(yǎng)溫度和天數(shù))和培養(yǎng)基添加物對(duì)轉(zhuǎn)化效率和芽誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果顯示,浸染液OD600=0.5的誘導(dǎo)率最高,共培養(yǎng)溫度為24℃,共培養(yǎng)天數(shù)為10 d具有較高轉(zhuǎn)化效率,共培養(yǎng)基中加入一定濃度的單壁碳納米管(Single-wall carbon nanotube,NM)對(duì)誘導(dǎo)卡那霉素抗性不定芽有促進(jìn)作用。PCR檢測(cè)表明PHR1基因已整合到T1代大豆基因組中,初步證明可在大豆基因組中穩(wěn)定遺傳。
農(nóng)桿菌介導(dǎo);大豆子葉節(jié);共培養(yǎng);單壁碳納米管
大豆富含蛋白質(zhì)和油脂,是我國極重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物[1]。通過基因工程改良大豆育種是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。第一例轉(zhuǎn)基因植物就是采用的就是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,通過這一方法已獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因植物總數(shù)4/5,已成為植物基因轉(zhuǎn)化首選方法[2]。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)日趨成熟,但有很多瓶頸問題急需優(yōu)化改良,轉(zhuǎn)化效率低,重復(fù)性差,轉(zhuǎn)化周期很長等,目前提高轉(zhuǎn)化效率和相對(duì)穩(wěn)定性依然是現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因研究的重點(diǎn)[3-5]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變?nèi)藗兩畹耐瑫r(shí),轉(zhuǎn)基因植物生物安全性受到社會(huì)各界關(guān)注,其中最主要的問題是選擇標(biāo)記,目前切除選擇性標(biāo)記的方法包括共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、同源重組、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)等[6-8]。Cre/loxp 標(biāo)記去除(位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng))具有較高的可控性,是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用廣泛較理想的標(biāo)記去除方法。
本研究以4個(gè)栽培品種豫豆22、冀豆16、中黃13、吉林35為轉(zhuǎn)化受體材料,探究共培養(yǎng)天數(shù)、共培養(yǎng)溫度、單壁碳納米管(NM)對(duì)誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化效率的影響,以期為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化提供參考,獲得的AtPHR1轉(zhuǎn)化植株,以期為耐低磷大豆培育提供基礎(chǔ)材料。
1.1 供試材料
1.1.1 大豆品種 豫豆22、冀豆16、中黃13、吉林35。
1.1.2 菌株和質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌菌株為LBA4404,質(zhì)粒為PX6-PHR1(圖1),含AtPHR1基因(南開大學(xué)李明剛教授提供)。
圖1 質(zhì)粒的T-DNA區(qū)
1.1.3 主要培養(yǎng)基,見表1。
表1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中的主要培養(yǎng)基
1.2 方法
1.2.1 轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化
1.2.1.1 菌液制備 從4℃保存的平板上挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)OD600=0.6-0.8時(shí)取1 mL菌液轉(zhuǎn)入新鮮LB培養(yǎng)基中二次活化,培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8,5 000 r/min,離心10 min,去上清液,菌體重懸于共培養(yǎng)液體中調(diào)整OD600=0.3-0.5。
1.2.1.2 共培養(yǎng) 將無菌苗制備的子葉節(jié)放入上述制備好的菌體懸浮液中,侵染30-60 min后近軸面朝下接種到共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本研究在共培養(yǎng)階段設(shè)置了以豫豆22無菌苗的子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化外植體的3個(gè)單因素試驗(yàn)。(1)共培養(yǎng)溫度試驗(yàn):培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為19、22、24和25℃;(2)共培養(yǎng)天數(shù):設(shè)置了共培養(yǎng)時(shí)間分別為7、10和13 d的單因素試驗(yàn),每個(gè)處理接種200個(gè)外植體;(3)單壁碳納米管分散液(NM)對(duì)外植體芽誘導(dǎo)率的影響:選取3個(gè)大豆品種(豫豆22、中黃13、吉林35)的子葉節(jié)為外植體放入含0和40 mg/L NM的不含km、carb、cef的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,選出芽誘導(dǎo)率最高的品種;(4)含40 mg/L NM浸染液對(duì)誘導(dǎo)率的影響:以豫豆22子葉節(jié)為試驗(yàn)材料,OD600=0.5的菌液離心后重懸于含40 mg/L NM的共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中作為浸染液,以無任何添加物的浸染液做對(duì)照,比較兩種浸染液對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響;(5)含不同濃度NM對(duì)外植體芽誘導(dǎo)率的影響:以豫豆22子葉節(jié)為試驗(yàn)材料,在共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中加入單壁碳納米管,設(shè)置4各處理,濃度分別為0、20、40和60 mg/L,每個(gè)處理接種150個(gè)外植體;(6)以豫豆22子葉節(jié)為試驗(yàn)材料,在共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入40 mg/L NM,同時(shí)在固體培養(yǎng)基中加入20 mg/L NM,以無添加的培養(yǎng)基為對(duì)照,統(tǒng)計(jì)兩種試驗(yàn)條件下芽誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化效率的差異。
1.2.1.3 植株再生 共培養(yǎng)后的子葉節(jié)用無菌水沖洗后接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每15 d繼代一次。經(jīng)過兩次繼代后將長出的抗性芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中,待抗性芽生長至2-4 cm后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,根系健壯,煉苗3-5 d后移栽到草炭土∶蛭石=3∶1的營養(yǎng)土中。
1.2.2 轉(zhuǎn)PHR1基因植株的檢測(cè) 選用SDS法提取卡那霉素抗性植株葉片的基因組DNA,進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)。擴(kuò)增設(shè)計(jì)的引物為:P1:5'-CCATCTCCACTGACGTAAGGGAT-3';P2:5'-CTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGT-3'。P3:5'-CTGGACACAGTGCCCGTGTCGGA-3';P4:5'-ACAGCCTCAACAAAAGCCTCGTG-3'。PHR1:5'-CCTCACACGCACTTCTTCAA-3';PHR2:5'-GCTCTTTCACTACCGCCAAG-3'其中P1/P2為載體擴(kuò)增引物,P1在G10-90處,P2在第一個(gè)Loxp site下游,片段長度是653 bp;P3設(shè)計(jì)在Cre上游,P4在第二個(gè)Loxp site下游的基因內(nèi)部,P3/P4片段長度為1.3 kb。PHR1/PHR2為ATPHR1基因內(nèi)部特異性引物,擴(kuò)增片段長度為710 bp。
1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
芽誘導(dǎo)率(%)=出芽外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%。
陽性率(%)=PCR陽性株數(shù)/總外植體數(shù)×100%。
2.1 轉(zhuǎn)AtPHR1植株的獲得
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將AtPHR1基因分別轉(zhuǎn)入豫豆22、冀豆16和中黃35中,設(shè)計(jì)P1/P2、P3/P4和PHR1/PHR2引物(1.2.2方法)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。P1/P2擴(kuò)增結(jié)果(圖2)如預(yù)期大小,目的片段長度約為650 bp,P3/P4擴(kuò)增(圖3)片段長度為1.3 kb,符合預(yù)期大小。PHR1/ PHR2擴(kuò)增結(jié)果(圖4)符合預(yù)期大小,片段長度約為710 bp。
圖2 部分轉(zhuǎn)基因植株以P1/P2引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果
2.2 不同浸染液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
本實(shí)驗(yàn)以豫豆22為材料,設(shè)計(jì)浸染菌液濃度分別為OD600=0.2、0.3、0.4、0.5、0.6,將子葉節(jié)外植體分別浸染在不同的菌液濃度中,研究不同浸染菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果(表2)顯示,隨菌液和侵染液濃度的增加,轉(zhuǎn)化陽性率的變化較大,當(dāng)浸染液OD600=0.5時(shí),轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高,達(dá)10.4%。故本研究其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用菌液濃度OD600=0.5,侵染液濃度OD600=0.5 的組合進(jìn)行處理。
圖3 部分T1轉(zhuǎn)基因植株以P3/P4引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖4 部分T1轉(zhuǎn)基因植株以PHR1/PHR2引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果
表2 不同菌液濃度和侵染液濃度對(duì)陽性率的影響
2.3 遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)階段影響因素
2.3.1 適宜的共培養(yǎng)時(shí)間 不同共培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)后的陽性轉(zhuǎn)化率,以共培養(yǎng)10 d的轉(zhuǎn)化率是最高的,達(dá)8.06%,共培養(yǎng)7 d和13 d的轉(zhuǎn)化效率則分別是3.01%和3.39%(圖5),表明適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為10 d。
2.3.2 適宜的共培養(yǎng)溫度 當(dāng)共培養(yǎng)溫度為19℃和22℃時(shí)的轉(zhuǎn)化效率偏低,僅為1.45%和1.73%,而共培養(yǎng)溫度為24℃時(shí)培養(yǎng)的外植體有最高轉(zhuǎn)化效率,為4.12%,當(dāng)溫度繼續(xù)升高至26℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率又有降低趨勢(shì)(圖6),結(jié)果表明共培養(yǎng)24℃時(shí)更有利于提高轉(zhuǎn)化效率。
圖5 共培養(yǎng)天數(shù)對(duì)陽性率的影響
圖6 不同共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
2.4 NM對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響
2.4.1 單壁碳納米管分散液對(duì)不同品種的出芽率的影響 以中黃13、吉林35、豫豆22為實(shí)驗(yàn)材料,在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入40 mg/L的NM,結(jié)果見表1,吉林35子葉節(jié)外植體的40 mg/L NM處理的芽誘導(dǎo)率比對(duì)照低24.9%,而其他兩個(gè)品種的芽誘導(dǎo)率都高于對(duì)照,其中豫豆22芽誘導(dǎo)率比對(duì)照高124.5%,效果最明顯,試驗(yàn)表明在豫豆22中添加40 mg/L的NM明顯促進(jìn)子葉節(jié)分化,后續(xù)NM探究實(shí)驗(yàn)均使用豫豆22為實(shí)驗(yàn)材料。
2.4.2 浸染液添加 NM對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響 以豫豆22子葉節(jié)為實(shí)驗(yàn)材料,OD600=0.5的菌液離心后重懸于含40 mg/L NM的共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中作為浸染液,以無任何添加物的浸染液做對(duì)照,統(tǒng)計(jì)兩種浸染液對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果(表4)顯示,加入40 mg/L NM的浸染液芽誘導(dǎo)率為18.8%,對(duì)照為4.4%,相比對(duì)照的芽誘導(dǎo)率高337.3%,實(shí)驗(yàn)表明共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基添加40 mg/L NM對(duì)芽誘導(dǎo)率有促進(jìn)作用。
表3 40 mg/L的NM對(duì)不同品種出芽率的影響
2.4.3 共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基添加 NM對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響 在共培養(yǎng)階段加入不同濃度的NM對(duì)卡那霉素抗性不定芽的誘導(dǎo)(圖5),加入20 mg/L NM后芽誘導(dǎo)率(14.18%)比對(duì)照高81.8%,NM濃度升高至40 mg/L后,芽誘導(dǎo)率降到6.19%低于對(duì)照,NM加至60 mg/L后,芽誘導(dǎo)率為9.20%與對(duì)照相近,。說明加入20 mg/L NM后的共培養(yǎng)基有利于抗性不定芽的誘導(dǎo)分化。
2.4.4 共培養(yǎng)基與浸染液中分別添加適宜濃度NM對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 以豫豆22子葉節(jié)為試驗(yàn)材料,在共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中加入40 mg/L NM,同時(shí)在固體培養(yǎng)基中加入20 mg/L NM,以無添加的培養(yǎng)基為對(duì)照,統(tǒng)計(jì)兩種實(shí)驗(yàn)條件下芽誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化效率的差異。結(jié)果(表4)顯示,加入適宜濃度的NM處理后的芽誘導(dǎo)率與對(duì)照相差不多,但陽性率比對(duì)照低,說明在固體和液體培養(yǎng)基中都加NM對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化無促進(jìn)作用。
表4 共培養(yǎng)基中加入NM對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響
本研究在參考前人對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的優(yōu)化改良經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究了重要影響因素浸染液濃度、共培養(yǎng)天數(shù)、共培養(yǎng)溫度和單壁碳納米管液對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響。
農(nóng)桿菌侵染效率是影響植物轉(zhuǎn)化效率的重要因素,主要與菌株種類、菌液濃度、侵染液濃度和侵染時(shí)間有關(guān)[9]。其中,農(nóng)桿菌菌液濃度代表著菌液生長時(shí)期,而處于對(duì)數(shù)生長期的菌液被認(rèn)為是侵染能力最強(qiáng)、侵染效率最高的狀態(tài)。侵染液濃度代表著一定體積內(nèi)菌體的含量,濃度過低則沒有足夠的外源DNA進(jìn)入外植體,侵染效果差,而侵染液濃度過高,則會(huì)使多余的菌體附著在外植體傷口周圍,導(dǎo)致后期農(nóng)桿菌生長旺盛、難以抑制,對(duì)植物細(xì)胞造成毒害。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),以菌液和浸染液的OD600=0.5的抗性芽誘導(dǎo)率最高,處理效果最佳,武小霞等[10]研究顯示浸染液的OD600=0.5的芽誘導(dǎo)率最高,與本研究結(jié)果一致。
圖7 不同NM濃度對(duì)抗性芽誘導(dǎo)率的影響
共培養(yǎng)階段是建立高效轉(zhuǎn)化體系的重要參數(shù),在此階段是子葉節(jié)和農(nóng)桿菌共生時(shí)期,所涉及到的因素都是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。合適的共培養(yǎng)溫度能使農(nóng)桿菌和外植體均處于遺傳轉(zhuǎn)化的最佳狀態(tài),共培養(yǎng)溫度過低或過高都直接影響了外植體的轉(zhuǎn)化效果,關(guān)于這方面的研究仍然不斷進(jìn)行,但結(jié)果不盡相同[11]。本研究顯示共培養(yǎng)溫度為24℃,轉(zhuǎn)化效率最好,是農(nóng)桿菌與外植體均處于適宜的轉(zhuǎn)化狀態(tài)的溫度,使二者都能達(dá)到較理想的轉(zhuǎn)化狀態(tài)。共培養(yǎng)天數(shù)同樣是共培養(yǎng)階段極重要的轉(zhuǎn)化效率影響因子,理論上講隨共培養(yǎng)時(shí)間增長,農(nóng)桿菌繁殖越多,轉(zhuǎn)化就越容易完成,但是農(nóng)桿菌的過量繁殖反而會(huì)對(duì)子葉節(jié)造成毒害,降低轉(zhuǎn)化效率[12]。目前普遍認(rèn)為以大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的最佳共培養(yǎng)天數(shù)為3-5 d[12-14],本研究就共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行探究,結(jié)果顯示共培養(yǎng)10 d的陽性率更高,7 d和13 d的轉(zhuǎn)化效果不及10 d,可能是由于共培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí),影響了T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的幾率,而共培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí)農(nóng)桿菌的過量繁殖對(duì)子葉節(jié)外植體造成影響,子葉節(jié)受到毒害,使轉(zhuǎn)化效率降低,而且共培養(yǎng)后期農(nóng)桿菌抑制困難,本研究中取得最優(yōu)轉(zhuǎn)化效率的共培養(yǎng)天數(shù)為10 d。
納米材料尺寸為1-100 nm,在電子機(jī)械、農(nóng)業(yè)化工、生物醫(yī)藥等方面都應(yīng)用廣泛,人工納米材料伴隨科技發(fā)展引起人們高度關(guān)注[15]。目前納米材料對(duì)植物生長發(fā)育或促進(jìn)或抑制或無影響的作用都有報(bào)道[16],但都尚在起步階段。關(guān)于人工納米材料可以促進(jìn)大豆萌發(fā)[17],提高光合反應(yīng)效率[18],增加某些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[19],制成納米增效肥料等時(shí)有報(bào)道,綜合發(fā)現(xiàn)納米材料對(duì)植物生長的影響與納米材料的種類、濃度、形態(tài)以及植物的類型有關(guān)。納米材料最主要的特點(diǎn)是尺寸小,處于單個(gè)原子或分子與宏觀粒子交界的過渡區(qū)域,納米材料有小尺寸效應(yīng),粒子無周邊邊界,使其產(chǎn)生的磁場(chǎng)與植物本身的磁場(chǎng)具有宏觀量子隧道的主動(dòng)靶向性,將會(huì)攜帶大量的養(yǎng)分離子進(jìn)入植物體內(nèi),因此相應(yīng)地提高了植物吸收養(yǎng)分和水分的能力。本研究將單壁碳納米管分散液加入共培養(yǎng)基中,探究其對(duì)大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明不同品種的子葉節(jié)外植體在中添加40 mg/L NM[20]誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的效果不同,本研究中豫豆22和中黃13的誘導(dǎo)率比對(duì)照高,吉林35低于對(duì)照;在浸染液中添加40 mg/L NM和固體培養(yǎng)基中加入的20 mg/L NM可提高芽誘導(dǎo)率,可能原因是NM的小尺寸效應(yīng)。
本研究應(yīng)用的載體具有Cre/loxp系統(tǒng),可刪除除卡那抗性標(biāo)記。PHR1基因是耐低磷相關(guān)的正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因,是高等植物中的磷信號(hào)調(diào)控體系核心轉(zhuǎn)錄因子,參與植物磷素運(yùn)輸和再利用[21,22]P1/P2、P3/P4和PHR1/PHR2引物擴(kuò)增結(jié)果說明啟動(dòng)子G10-90、Cre/loxp系統(tǒng)及AtPHR1基因完整的整合進(jìn)大豆基因組中,為進(jìn)一步獲得刪除卡那抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)PHR1基因大豆奠定材料基礎(chǔ)。
本研究探討的農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)影響因素結(jié)果顯示菌液和浸染液OD600=0.5,共培養(yǎng)溫度為24℃,共培養(yǎng)10 d的轉(zhuǎn)化效率最高,誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基中加入NM可提高芽誘導(dǎo)率。
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(責(zé)任編輯 狄艷紅)
The Factors Affecting Genetic Transformation of Soybean Cotyledon Node Mediated by Agrobacterium tumefacions
Yang Xiaoqian Li Guilan Liu Chenguang Dong Qiuping Zhang Kai Qiao Yake
(Life Science and Technology Institute,Hebei Normal University of Technology,Changli 066600)
It was to improve the efficiency of soybean genetic transformation, we used the soybean cotyledon node as explants via Agrobactium-mediated transformation method, and investigated the effect of bacterial concentration, co-culture temperature and time on the transformation efficiency and the rate of bud induction. The results showed that under the OD600= 0.5 of infection solution concentration, and induction rate was the highest. The conversion efficiency was higher under the environment of co-culture temperature being 24℃ for 10 days. The single-wall carbon nanotubes added to culture medium improved the induction of the adventitious bud with kanamycin-resistance. Moreover, the PCR results indicated that PHR1 gene was integrated into T1 genome generation, preliminarily proving that the heredity of gene in the soybean genome was stable.
Agrobactium-mediated;soybean cotyledon node;co-culture;single-wall carbon nanotube
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.013
2015-03-28
轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX0800404B)
楊曉倩,女,碩士研究生,研究方向:作物遺傳育種;E-mail:18330381190@163.com
喬亞科,男,碩士,教授,研究方向:大豆遺傳資源;E-mail:qiaoyake@126.com