陳坤 徐軍 謝燦 周冬梅 楊彬 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523867）

基于HUVEC細胞表面ELAM-1表達的抗TNF-α抗體活性檢測方法

陳坤 徐軍 謝燦 周冬梅 楊彬 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523867）

旨在建立抗TNF-α單克隆抗體生物學活性測定的方法。腫瘤壞死因子TNF-α能刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC表達黏附分子ELAM-1，通過抗TNF-α抗體中和TNF-α來抑制這種表達，從而建立該抗體的生物學活性檢測方法，并進行驗證。結(jié)果表明，建立抗體活性檢測方法，驗證方法的特異性較好、回收率為92.1%-102.1%，方法重復12次，RSD為7.66%。在50%-150%的線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.99。該活性檢測方法適于抗體體外活性的檢測。

單克隆抗體；HUVEC細胞；ELAM-1；腫瘤壞死因子TNF-α

腫瘤壞死因子（Tumour necrosis factor，TNF），又叫惡病質(zhì)因子（Cachectin）［1］。TNF按其結(jié)構(gòu)分兩型：TNF-α和TNF-β。TNF-α參與的多種致病機制，包括內(nèi)皮細胞的激活、細胞因子的誘導、白細胞的聚集、破骨細胞的活化與軟骨的破壞等［2］導致炎癥反應持續(xù)發(fā)生、軟骨與骨的漸進性破壞［2-4］。黏附分子是一類介導細胞與細胞間或細胞與基質(zhì)間相互作用的分子。白細胞表面黏附分子（E-Selectin）、白細胞細胞間黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（Vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1）屬于免疫球蛋白超家族成員。研究認為，VCAM-1和ICAM-1在介導的炎癥發(fā)生過程中起到了極其重要的作用［5，6］，其中在病變形成早期和進展期，黏附分子促進內(nèi)皮黏附、遷移并與其他細胞作用，在整個病變過程中起到了關(guān)鍵性的作用［7.8］。

近些年來，針對TNF-α的藥物研究倍受關(guān)注，其中中和TNF-α的抗體生物藥成為研究熱點。生物藥結(jié)構(gòu)復雜，理化分析不能完全詮釋它的功能與活性，所以在研究生產(chǎn)中，建立簡單準確的活性分析方法十分必要。針對TNF-α抗體的常用活性分析方法為TNF-α誘導L929細胞毒性實驗，鑒于單抗生物藥的特殊性，單一檢測方法不夠科學，采用多種體外活性試驗方法評價生物藥的生物活性顯得越來越重要。雖然，國內(nèi)外有不少文獻資料［5-10］報道可以用HUVEC細胞檢測抗TNF-α抗體活性，但還沒有文章對該檢測方法有詳細、系統(tǒng)的描述。本研究采用TNF-α刺激HUVEC細胞產(chǎn)生白細胞黏附因子（ELAM-1），通過抗體抑制細胞表面ELAM-1的表達，建立抗TNF-α抗體的活性檢測方法，對其進行系統(tǒng)驗證，以期研究該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 抗TNF-α 單克隆抗體（美國雅培）、HUVEC細胞（ATCC CRL-1730）、F-12K培養(yǎng)液（GIBCO 21127022）、內(nèi)皮細胞生長因子、吐溫-20和肝素均來自SIGMA；胎牛血清、青霉素和鏈霉素溶液、胰蛋白酶溶液、DPBS溶液均采自HYCLONE；TNF-α凍干粉（GIBCO PHC3011）、戊二醛、鼠抗人ELAM-1和HRP標記的羊抗鼠IgG采自Abcam公司；TMB反應液（AB000802）來自廣州怡雅；PBS粉末來自博士德。

1.1.2 儀器 超凈工作臺（蘇凈安泰）、倒置顯微鏡（OLYMPUS IX71）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 150i）、酶標儀（Molecular Devices MD M2E）、洗板機（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細胞Elisa法檢測ELAM-1的方法建立 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，消化重懸計數(shù)并種植于96孔板中，100 μL/孔，每孔2 500個細胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培育貼壁。加TNF-α溶液，200 μL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育刺激，加戊二醛溶液固定細胞；PBS洗板后，加入3%BSA 37℃封閉；PBS洗板3次，加稀釋的鼠抗人ELAM-1單抗（一抗）50 μL/孔，37℃孵育；PBST洗板3次，加稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG（二抗），每孔100 μL，37℃孵育；PBST洗板3次，加TMB溶液100 μL/孔，37℃顯色；最后用1 mol/L硫酸終止反應，酶標儀450 nm讀取光密度值。

1.2.2 TNF-α刺激細胞濃度摸索實驗 將TNF-α干粉溶于1 mL全培養(yǎng)液中，配制90 ng/mL的TNF-α溶液。將上述的TNF-α溶液進行梯度倍比稀釋，得系列濃度的TNF-α溶液：0.35、0.70、1.40、2.81、5.62、11.25、22.50、45.00和90.00 ng/mL，各濃度設(shè)定3個復孔，設(shè)置細胞陰性對照孔，細胞Elisa法檢測ELAM-1的表達量。

1.2.3 抗TNF-α抗體活性測定方法建立 用一定濃度TNF-α和系列濃度抗體的混合溶液共同孵育貼壁后的HUVEC細胞，200 μL/孔?？贵w標準溶液為640 ng/mL，將其倍比稀釋，濃度范圍為：2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 ng/mL。設(shè)置細胞對照、TNF-α陽性對照、抗體對照及空白對照。各濃度均設(shè)3個復孔，依照1.2.1步驟通過細胞Elisa法檢測450 nm處的光密度值。數(shù)值以四參數(shù)擬合回歸方程Y=（A-D）/［1+（x/C）B］+D計算抗體與ELAM-1之間的劑量關(guān)系，得出抗體的生物學活性IC50值。

1.2.4 抗TNF-α抗體活性測定的驗證

1.2.4.1 方法特異性 分別配制系列濃度抗TNF-α抗體標準溶液和非抗TNF-α抗體樣品溶液，并將抗TNF-α抗體70℃高溫變性處理5 min、30 min、60 min。分別按1.2.3方法檢測各條件下溶液的IC50值。

1.2.4.2 線性及準確度 配制濃度為320 ng/mL（50%）、480 ng/mL（75%）、640 ng/mL（100%）、800 ng/mL（125%）、960 ng/mL（150%）的抗TNF-α抗體溶液，再按1.2.3實驗方法分別倍比稀釋并檢測ELAM-1的值。每濃度水平溶液平行測定3條曲線，并將理論水平相對實際水平作直線擬合，得出線性方程。

1.2.4.3 精密度和中間精密度 平行配制6份640 ng/mL的抗TNF-α抗體標準溶液，按1.2.3的抗體檢測方法檢測各份溶液的IC50值，計算得出抗體的活性。按抗體檢測IC50與100%濃度抗體IC50比值得出相對活性。另一實驗人員同樣平行配制6份抗TNF-α抗體標準溶液，檢測各份的IC50值，并同樣計算出相對活性值。

2 結(jié)果

2.1 細胞Elisa法檢測ELAM-1方法建立

逐一摸索細胞Elisa法檢測ELAM-1的條件：細胞種植密度2 500 個/孔，細胞培育24 h貼壁后進入對數(shù)期。由表1可知，5 h時ELAM-1表達量基本穩(wěn)定，此時信噪比最佳，故選擇TNF-α孵育時間為5 h。1%戊二醛固定30 min、3%BSA封閉1 h，一抗、二抗最佳稀釋比例分別為1∶1 500、1∶4 000（圖1），孵育時間依次為2 h和1 h，TMB顯色20 min，測定450 nm的光密度值。

表1 TNFα不同孵育時間的ELAM-1檢測結(jié)果

圖1 細胞Elisa實驗一抗（A）和二抗的稀釋優(yōu)化實驗（B）

2.2 TNF-α對HUVEC細胞刺激濃度的確定

根據(jù)1.2.2實驗摸索TNF-α的刺激濃度，結(jié)果如圖2所示，隨著TNF-α溶液濃度加大，細胞表面ELAM-1的表達量也呈現(xiàn)明顯增大。當其濃度達到22.5 ng/mL時，ELAM-1的量基本達到平臺，表明此條件下細胞表達達到飽和，因此在隨后的實驗中TNF-α刺激濃度被選擇為22.5 ng/mL。

圖2 不同濃度的TNF-α刺激細胞的ELAM-1表達

2.3 抗TNF-a抗體中和活性實驗建立

根據(jù)2.1、2.2的結(jié)果，確定了TNF-α濃度及刺激孵育細胞的時間，同時也確定了一抗、二抗的稀釋比例，由此建立了檢測ELAM-1的實驗方法。選擇抗體初始濃度為640 ng/mL，以3倍稀釋使終濃度為：2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 ng/mL，檢測結(jié)果（圖3）表明ELAM-1表達量與抗體濃度呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。報告檢測結(jié)果的絕對IC50值（38.5 ng/mL）體現(xiàn)抗體對TNF-α中和效力。

圖3 細胞Elisa法檢測抗體活性的劑效曲線

2.4 抗體生物學活性方法驗證

2.4.1 方法專屬性驗證 方法的專屬性結(jié)果（表2）表明，此方法只針對抗TNF-α抗體的活性檢測，對于非抗TNF-α抗體（陰性對照品為貝伐單抗）在TNF-α對照和貝伐抗體對照的孔中，OD值沒有任何變化，其結(jié)果曲線圖也無明顯劑效關(guān)系。此外，我們考察了高溫破壞對于該類抗體活性的影響，如表2所示抗體在70℃的高溫下，時間越久，活性降低越多，當加熱時間增至30 min時，抗體幾乎完全聚合變性而失活。

表2 抗體活性檢測專屬性

2.4.2 方法線性測定 如表3所示，實際水平即測定的相對活性，理論水平即配制濃度的相對比例。將5個實際水平平均值對理論水平做直線擬合，該方法在50%-150%之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性擬合方程為y=1.054 6x-0.076 2，R2=0.992 5。

圖3 抗體活性檢測線性曲線

表3 抗體活性檢測之準確度

2.4.3 抗體活性方法準確度檢測 將各濃度水平50%、75%、100%、125%和150%平行測定3條曲線，根據(jù)吸光度均值和對應濃度進行四參數(shù)擬合得到生物活性的實驗測得值、理論值并計算回收率。單個回收率在81%-110%之間，而15個檢測結(jié)果的平均回收率為96.76%。所有結(jié)果的95%置信區(qū)間在92%-101%。

2.4.4 抗體活性檢測方法精密度檢測 平行配制6份抗TNF-α抗體溶液，按抗體活性檢測方法測吸光度值并計算IC50值，得出生物活性（表4）。結(jié)果表明，6次平行的RSD%為9.25%。另一實驗員同樣方法另行配制檢測6份抗體溶液，得出生物活性，12份的RSD為7.66%。

表4 抗體活性檢測精密度結(jié)果

3 討論

該實驗方法在國內(nèi)外關(guān)于HUVEC細胞表面粘附分子研究的基礎(chǔ)上，利用抗TNF-a抗體可以抑制TNF-a刺激HUVEC細胞表達ELAM-1來檢測抗體的生物學活性。該方法的建立基于Thorne等首次闡明細胞因子（TNF-a和IL-1β）增加單核細胞-冠狀動脈平滑肌細胞黏附是通過ELAM-1、VCAM-1和ICAM-1機制。抗TNF-α藥物抑制介導內(nèi)皮細胞表面粘附分子的表達是控制細胞在血管壁積聚的關(guān)鍵調(diào)控點［5，10］。相比常規(guī)的細胞毒性實驗，該法結(jié)合了酶聯(lián)免疫的高度靈敏性及準確性特點，為實驗提供了更準確的結(jié)果。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC經(jīng)TNF-α處理后，細胞表面ELAM-1的表達有明顯增高，且細胞在孵育5 h時ELAM-1表達量達到穩(wěn)定。實驗中還發(fā)現(xiàn)細胞在正常生長條件下也會表達該黏附分子，只是量比較少，這一發(fā)現(xiàn)也與文獻報道相符。對于細胞表達ELAM-1因子的檢測，采用Elisa法，本實驗一抗的選擇在于保證實驗結(jié)果準確性，信噪比更高的情況下方法更穩(wěn)定，故以1∶1 500稀釋一抗。實驗中二抗則以1∶4 000稀釋比例得到最佳的劑量曲線。

在專屬性實驗中，抗體經(jīng)高溫破壞，活性明顯降低。猜測與抗體在高溫下迅速聚合有關(guān)，經(jīng)SEC（分子排阻色譜柱）分析實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)70℃處理超過5 min或更長時間時，抗體多聚體含量顯著提高，這與推測相符。由此說明，多聚體的產(chǎn)生對生物抗體藥物的活性會有明顯的影響。在方法準確度及線性實驗的驗證中，我們發(fā)現(xiàn)抗體濃度為50%時，單個點的回收率低于平均回收率，這可能與該法的缺陷有關(guān)，當抗體活性接近50%，即到達線性的最低點時，結(jié)果呈現(xiàn)不穩(wěn)定性。由ELAM-1因子的表達檢測抗體活性，我們嘗試以一定濃度TNF-α作用細胞，發(fā)現(xiàn)黏附分子ICAM-1、VCAM-1均有一定量的表達，而且，它們在孵育相同時間時，各自的表達量有一定的差別，據(jù)此方法條件摸索出各因子最佳表達時間，并對其分別檢測即可達到檢測抗體活性的更多方法。

4 結(jié)論

本實驗室通過建立細胞-酶聯(lián)免疫法檢測抗TNF-a抗體的活性，克服了常規(guī)單一方法檢測活性的局限性，開拓了該類抗體體外活性檢測的新思路。通過對該法進行完整的驗證，表明該法檢測抗體活性具有一定的科學性、準確性更能反映抗體活性的真實性。此外，該方法的建立也為通過其他兩個因子（ICAM-1和VCAM-1）檢測抗體活性提供了思路，可以依此建立更全面反映藥物體外活性的檢測手段，保證藥物研發(fā)生產(chǎn)中更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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（責任編輯 狄艷紅）

A Method for the Activity Assay of Anti-TNF-α Antibodies Expressed by ELAM-1 in HUVEC Surface

Chen Kun Xu Jun Xie Can Zhou Dongmei Yang Bin Suen Wenzheng
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523867）

This study is to develop a method to assay the biologic activity of anti-TNF-α（tumor necrosis factor-alpha）monoclonal antibodies. TNF-α stimulates the expression of adhesion molecules E-Selectin（ELAM-1）in human umbilical vein endothelial cells（HUVEC），whereas anti-TNF-αantibodies suppress the expression of ELAM-1 in HUVEC cells through neutralizing TNF-α. Based on this principle，we developed and validated a method for the bioactivity assay of the antibodies. The result showed that the assay method was established successfully， and the specificity of the method was validated to be feasible. The recovery rate was 92.1%-102.1%， and the RSD was ≦ 7.66% while repeated 12 times. The linear range in 50% to 150% was fine， and the correlation coefficient was 0.99. Conclusively， this method is well suited as an activity assay of antibodies in vitro.

monoclonal antibody；HUVEC cell；ELAM-1；TNF-α

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.010

2015-04-20

廣東省引進創(chuàng)新科研團隊計劃資助（201101Y0104990178）

陳坤，女，碩士研究生；研究方向：單抗生物藥研發(fā)；E-mail：chenkun@hecpharm.com

楊彬，男，碩士研究生，職稱：研究方向：生物制藥，單抗生物藥研發(fā)；E-mail：yangbin@hecpharm.com