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        龍眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

        2015-10-28 01:29:22唐福才姚敦琛關(guān)天旺陳亞蘭黃思敏潘龍馮藝帆梁雁喻麗紅
        食品研究與開發(fā) 2015年12期
        關(guān)鍵詞:龍眼濾液提取物

        唐福才,姚敦琛,關(guān)天旺,陳亞蘭,黃思敏,潘龍,馮藝帆,梁雁,喻麗紅,*

        (1.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,廣東廣州510182;2.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院,廣東廣州510182;3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院,廣東廣州510182;4.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州510182)

        龍眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

        唐福才1,姚敦琛2,關(guān)天旺3,陳亞蘭1,黃思敏4,潘龍2,馮藝帆4,梁雁1,喻麗紅4,*

        (1.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,廣東廣州510182;2.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院,廣東廣州510182;3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院,廣東廣州510182;4.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州510182)

        采用溶劑萃取、超聲輔助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚,比較萃取率以及其抗氧化活性的差異。分別采用溶劑萃?。ɑ亓鞣ê徒岱ǎ⒊曒o助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚,采用Folin-Ciocalteus法測(cè)定多酚含量并計(jì)算提取率;測(cè)定并比較多酚的總抗氧化能力、對(duì)羥自由基和DPPH自由基的體外抗氧化能力。不同方法提取多酚含量差異明顯,微波、回流、浸提和超聲的提取率分別是(13.60±0.46)%、(9.85±0.76)%、(8.65±0.43)%、(12.04±1.69)%。不同方法提取的龍眼核多酚抗氧化活性各樣差異,但總抗氧化能力大小差異不明顯。龍眼核多酚對(duì)·OH清除能力依次為:IC50超聲

        龍眼核;多酚;超聲法;微波法;抗氧化

        龍眼核的重量占龍眼果實(shí)鮮重的17%,中國(guó)是世界龍眼生產(chǎn)大國(guó)[1],全國(guó)每年被廢棄的龍眼核高達(dá)2萬(wàn)t以上。龍眼核中含有多種化合物,包括萜類、脂類、脂肪酸、酚類等,其中多酚類物質(zhì)含量豐富。Soong和Barlow[2-3]證實(shí)龍眼核中含有十三種多酚物質(zhì),并發(fā)現(xiàn)龍眼核多酚的抗氧化活性與含量呈正比。

        多酚即多羥基苯,如苯二酚、苯三酚等,是植物及微生物中產(chǎn)生的酚類次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、抗凝血、與金屬離子的絡(luò)合等特性[1]。多酚作為天然抗氧化劑,具有抗衰老、抗輻射、清體自由基等功能,對(duì)心腦血管疾病的防治,如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、腦血栓等方面具有良好功效。但目前,管理的不合理、體系的不完善、工藝的落后等對(duì)龍眼核多酚的發(fā)展仍然有著極大的制約。因此,如何能夠充分、合理、科學(xué)地利用龍眼核,對(duì)龍眼核的綜合開發(fā)與利用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        本文采用溶劑萃取、超聲輔助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚,測(cè)定不同萃取法提取龍眼核中多酚的含量以及其的總抗氧化能力、對(duì)羥自由基和DPPH自由基的體外抗氧化能力的差異。研究不同提取方法得到的多酚抗氧化活性的差別,為龍眼核的廢物利用及多酚的提取開辟了新的思路。

        1材料與方法

        1.1材料、試劑與儀器

        龍眼核:(購(gòu)于樂(lè)購(gòu)超市,產(chǎn)地高州)無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、沒(méi)食子酸、酚試劑(均為分析純,購(gòu)買于百靈威科技有限公司)、SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵:鞏義市英予華儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52C:鞏儀市予華儀器有限責(zé)任公司;微波發(fā)生器MAS-Ⅱ:新儀微波化學(xué)科技有限公司;KQ-500VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;202-1A型電熱恒溫干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;BS-124S電子天平:SartoriusAG,Sartorius;722S可見(jiàn)分光光度計(jì):上海菁華科技;DFT-250手提式中藥粉碎機(jī):貴州三陽(yáng)包裝設(shè)備有限公司。

        1.2材料預(yù)處理

        將新鮮的龍眼核放置于60℃的恒溫干燥箱中,干燥至恒重。取出后用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩,裝入棕色廣口瓶中備用。

        1.3方法

        1.3.1龍眼核多酚的提取

        1.3.1.1微波輔助萃取法

        稱取龍眼核粗粉2 g,料液比為1∶20,分別加入75%的乙醇溶液,300 W微波3 min取出攪拌均勻后抽濾,收集濾液。提取完成后,取出燒杯慢慢攪拌,放置2 min~3 min后,用真空泵將原料與溶劑減壓抽濾分離,濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次,收集濾液,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾回收乙醇,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干,稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

        1.3.1.2超聲波輔助萃取法

        稱取龍眼核粗粉2 g,料液比為1∶20,分別加入75%的乙醇溶液,在超聲清洗器功率比99%,溫度60℃,提取30 min,取出攪拌均勻后抽濾,收集濾液。用布氏漏斗減壓過(guò)濾,濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干,稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

        1.3.1.3乙醇浸提萃取法

        稱取龍眼核粗粉2 g,料液比為1∶20,分別加入75%的乙醇溶液,在溫度60℃的恒溫水浴箱中,浸提6 h,取出攪拌均勻后減壓過(guò)濾,收集濾液。同樣的條件重復(fù)提取2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干,稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

        1.3.1.4乙醇回流萃取法

        稱取龍眼核粗粉2 g,料液比為1∶20,分別加入75%的乙醇溶液,采用蒸餾回流提取裝置,提取4 h,取出攪拌均勻后抽濾,收集濾液。用布氏漏斗減壓過(guò)濾,濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干,稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容50 mL備用。

        1.3.2龍眼核多酚提取物的含量測(cè)定

        1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

        多酚含量采用Folin-Ciocalteus法[4](簡(jiǎn)稱FC法)測(cè)定,以沒(méi)食子酸為對(duì)照品。參照李靜等[5]的方法,以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品多酚的含量。準(zhǔn)確稱取300 mg沒(méi)食子酸,先加入少量蒸餾水待沒(méi)食子酸完全溶解后,加入蒸餾水定容至500 mL,混合均勻得濃度為0.6 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。常溫下分別移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL到10 mL比色管,蒸餾水補(bǔ)足2 mL,加入福林酚甲試劑5 mL搖勻,反應(yīng)10 min后再加入福林乙試劑0.5 mL,振蕩后放置在25℃條件下靜置30 min,于750 nm[6]下測(cè)定吸光度,以沒(méi)加沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液為空白對(duì)照,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.2.2龍眼核多酚提取物的含量測(cè)定

        取龍眼核多酚提取物備用液,參照1.3.2.1方法,配制樣品液,在750 nm處測(cè)其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品濃度,并按下面公式(1)計(jì)算提取率。

        式中:c為樣品的濃度(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出),(mg/ mL);v為樣品稀釋后的體積,mL;n為稀釋的倍數(shù);m為粗提取物質(zhì)量,mg。

        1.3.3龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測(cè)定

        將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋,配制濃度為:0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL,采用總抗氧化能力試劑盒測(cè)定,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測(cè)定??寡趸芰挝欢x為:在37℃下,每分鐘每毫升測(cè)定液使反應(yīng)體系吸光度增加0.01為一個(gè)總抗氧化能力單位(U/mL)。

        1.3.4龍眼核多酚提取物對(duì)羥自由基清除能力測(cè)定

        將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋,配制濃度為:0、0.02、0.16、0.24、0.32、0.48 mg/mL和0.64 mg/mL,采用羥自由基測(cè)定試劑盒法,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)龍眼核多酚提取物的羥自由基清除能力測(cè)定。

        1.3.5龍眼核多酚提取物對(duì)DPPH·的清除測(cè)定[7]

        將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋,配制濃度為:0、0.001、0.004、0.008、0.012、0.016和0.032 mg/mL的系列質(zhì)量濃度,各取2 mL分別加入2 mL無(wú)水乙醇,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(Aj);另取上述系列濃度的提取液各2 mL,分別加入2×10-4mol/mL DPPH·溶液2 mL,混合均勻,30 min后在同樣條件下測(cè)定其吸光度(Ai);并在同樣條件下測(cè)定2×10-4mol/mLDPPH·溶液的吸光度度(A0),用同樣濃度系列的VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式(2)計(jì)算龍眼核提取液對(duì)DPPH·的抑制率。

        1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:利用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,組間數(shù)據(jù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),(使用SPSS17軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,顯著性檢驗(yàn)為t檢驗(yàn),顯著性水平為P<0.05,極顯著性水平為P<0.01。

        2結(jié)果

        2.1龍眼核多酚提取物的含量測(cè)定

        按1.2.1的方法制作沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的回歸方程為y=5.264 3x+0.020 8,R2=0.982 3,在1 μg/mL~7 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)分別采用微波萃取法、超聲萃取提法、乙醇浸提法和回流法從龍眼核中提取多酚物質(zhì),4種方法得到龍眼核多酚含量,提取率分別是(13.60±0.46)%、(9.85±0.76)%、(8.65±0.43)%、(12.04±1.69)%。微波和超聲波萃取法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法和回流法,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.05。

        表1 不同方法提取龍眼核多酚得率Table 1The extracted rates of polyphenol from Lengan seeds

        2.2龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測(cè)定(FRAP法)

        還原力的測(cè)定可檢驗(yàn)化合物是否為良好的電子供應(yīng)體,它所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+,從而使體系溶液顏色改變,即反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變。體系溶液吸光值越大,則表示被測(cè)物還原力越強(qiáng),抗氧化效果越佳。從圖1可知,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),微波、回流、浸提以及超聲提取的多酚的總抗氧化能力分別為:(30.03±3.72)、(35.67±1.61)、(39.75± 4.34)、(38.65±1.61)U/mg,不同方法提取的多酚總抗氧化能力無(wú)明顯差異,p>0.05。均明顯低于VC總抗氧化能力:(200.52±4.21)U/mg。

        圖1 龍眼核多酚的總抗氧化能力Fig.1Total antioxidant capacity of polyphenol from Lengan seeds

        2.3龍眼核多酚提取物對(duì)羥自由基清除能力測(cè)定

        ·OH是活性氧中最活潑的氧自由基之一,它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng),可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化,蛋白質(zhì)解聚、聚合,核酸斷裂和多糖裂解等生化過(guò)程,引發(fā)組織細(xì)胞病變、導(dǎo)致各種疾病發(fā)生、加速機(jī)體衰老。減少此類自由基可預(yù)防衰老、心血管疾病等,并具有防癌抗癌的作用。

        不同方法提取的龍眼核多酚對(duì)·OH清除能力如圖2所示。

        不同方法提取的龍眼核多酚對(duì)·OH表現(xiàn)出良好地清除能力,IC50VC<IC50超聲<IC50微波

        圖2 龍眼核多酚提取物對(duì)·OH清除能力Fig.2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on hydroxyl radical

        2.4龍眼核多酚提取物對(duì)DPPH·的清除測(cè)定

        DPPH·自由基是一種合成的有機(jī)自由基,常用來(lái)研究酚類抗氧化劑的構(gòu)效關(guān)系,是近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外普遍重視的一種分析抗氧化活性的方法。它是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基,其乙醇溶液呈紫色,并在波長(zhǎng)517 nm處有強(qiáng)烈吸收。在有自由基清除劑存在時(shí),自由基清除劑提供1個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)而使其褪色,褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系,在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度變小,其變化程度與DPPH自由基清除程度呈線性關(guān)系。

        表2 龍眼核多酚提取物對(duì)DPPH·的清除能力Table 2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on DPPH radical

        由表2可知,四種方法提取的多酚對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力,微波、超聲浸提以及回流提取的多酚清除DPPH自由基的IC50分別為0.007 87± 0.000 372、0.009 68±0.000 614、0.010 7±0.000 261、0.007 92±0.000 301。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基的清除作用呈現(xiàn)出良好的濃度效應(yīng)關(guān)系,并且濃度越大,龍眼核多酚的清除DPPH自由基能力呈上升趨勢(shì),并逐漸達(dá)到飽和狀態(tài),變化也逐漸趨于緩慢。

        3結(jié)論與討論

        本實(shí)驗(yàn)采取微波、超聲、浸提和回流提取龍眼核中多酚,結(jié)果顯示,微波萃取法較超聲萃取法提取效果好,微波和超聲波萃取法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法和回流法,即W微波>W超聲>W回流>W乙醇。其原因可能在于微波提取過(guò)程中,微波輻射導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收微波能,產(chǎn)生大量熱量,使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化所產(chǎn)生的壓力在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上形成微小孔洞,使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),溶解并釋放出胞內(nèi)物質(zhì),并且由于多酚具有一定的極性,便在微波電磁場(chǎng)作用下產(chǎn)生瞬時(shí)極化,從而產(chǎn)生鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子之間的相互摩擦、碰撞,促進(jìn)分子活性部分(極性部分)更好地接觸和反應(yīng)[8-9]。這一方法有效的減少了植物多酚在高溫環(huán)境下的氧化,提高了植物多酚的提取質(zhì)量,且短時(shí)微波提取對(duì)植物多酚幾乎沒(méi)有破壞。該方法提取龍眼核多酚提取率最高。超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和物化作用打破植物細(xì)胞壁,并利用超聲的清洗作用加快細(xì)胞內(nèi)含物的釋放,提高了提取效率,縮短了時(shí)間,避免了高溫對(duì)提取成分的影響,但純度不高,故該方法龍眼核多酚提取率次于微波法。作為傳統(tǒng)提取方法,回流和浸提法提取周期較長(zhǎng),提取率較低,溶劑極性、溶劑pH、料液比、提取溫度均會(huì)影響多酚活性和多酚提取率。

        同時(shí),試驗(yàn)通過(guò)測(cè)量總抗氧化能力、清除DPPH能力和羥基自由基能力來(lái)評(píng)價(jià)龍眼核多酚的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,四種方法提取所得龍眼核多酚均有較好的體外抗氧化能力。其作用機(jī)理可能在于多酚類化合物酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化,且對(duì)活性氧等自由基有較強(qiáng)的捕捉能力,使其具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力[10]。但四種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異。不同方法提取的多酚總抗氧化能力無(wú)明顯差異。龍眼核多酚對(duì)·OH清除能力為:龍眼核多酚對(duì)DPPH清除能力為:不同方法提取龍眼核多酚的抗氧化能力存在差異。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過(guò)程的差異及與上述方法評(píng)價(jià)抗氧化活性的機(jī)制造成[11]。因此,需同時(shí)結(jié)合此四種方法對(duì)龍眼核多酚抗氧化作用進(jìn)行客觀、全面評(píng)價(jià)。通過(guò)綜合評(píng)估,微波提取龍眼核多酚抗氧化效果最佳,能有效的清除羥自由基和DPPH自由基,在一定范圍內(nèi)清除自由基能力和濃度成線性關(guān)系。

        綜上,龍眼核多酚可作為抗氧化物質(zhì)潛在資源,不同提取方法龍眼核多酚抗氧化能力具有差異,具有較高的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。本文為下一步深入研究龍眼核的抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考,并為龍眼核多酚資源的充分利用奠定基礎(chǔ)。

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        Study of the Extraction and Antioxidant Capactity of Ployphenol from Longan Seeds

        TANG Fu-cai1,YAO Dun-chen2,GUAN Tian-wang3,CHEN Ya-lan1,HUANG Si-min4,PAN Long2,F(xiàn)ENG Yi-fan4,LIANG Yan1,YU Li-hong4,*
        (1.The First Clinical College of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,China;2.The Third Clinical College of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,China;3.The Second Clinical College of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,China;4.The Medicine college of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,China)

        Polyphenols were extracted from longan seeds by using solvent extraction,ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted extraction respectively.The content of polyphenols was detemined by the Folin-Ciocalteus method,and the extracted rates were calculated.The antioxidant activity of extracts were evaluated by total reducing power,superoxide anion radical and DPPH free radical scavenging activities.The extracted rates of polyphenol were(13.60±0.46)%,(9.85±0.76)%,(8.65±0.43)%,(12.04±1.69)% respectively.It was revealed that there were significant differences among these methods.The most radical scavenging activity against superoxide anion radical and DPPH free radical was microwave-assisted extract.In conclusion,the best result was obtained from microwave-assisted extraction.It was a linear relationship between concentrations and free radical scavenging abilities within a certain range.

        longan seed;ployphenol;ultrasonic;microwave;antioxidant

        10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.002

        2015-01-03

        2012-2013年度廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目2013A0008;2014年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目201410570014;2015年度廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培訓(xùn)專項(xiàng)資金立項(xiàng)項(xiàng)目

        唐福才(1991—),男(漢),在讀本科生,從事天然藥物、心血管方向研究。

        喻麗紅,女(漢),實(shí)驗(yàn)員,主要從事藥物化學(xué)的研究工作。

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