羅玉琴，扶　雄，侯　軼

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

微生物絮凝劑BN-25的特性及其在甘蔗混合汁澄清工藝中的應(yīng)用

羅玉琴，扶雄，侯軼*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一種微生物絮凝劑BN-25的特性及化學(xué)成分進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)其絮凝活性物質(zhì)主要分布在發(fā)酵液中，具有良好的熱穩(wěn)定性，100℃下連續(xù)沸水浴30min，絮凝活性保持不變。紫外光譜（UV）、紅外光譜掃描（FTIR）和化學(xué)測定結(jié)果表明，微生物絮凝劑BN-25含有大量的氨基、羥基、羧基、硫酸根等有利于絮凝的基團(tuán)，多糖為其主要成分，含量達(dá)89.5%。通過正交實(shí)驗(yàn)和方差分析確定了微生物絮凝劑BN-25與聚丙烯酰胺（PAM）復(fù)配處理甘蔗混合汁的最佳工藝條件為中和pH6.8，二次加熱溫度100℃，BN-25添加量12mg/L，PAM添加量1.0mg/L。處理后蔗汁色值僅為273IU，濁度僅為84MAU，澄清效果明顯優(yōu)于PAM單獨(dú)應(yīng)用，并降低PAM的添加量75%以上，為微生物絮凝劑應(yīng)用于制糖行業(yè)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

微生物絮凝劑，熱穩(wěn)定性，多糖，PAM，甘蔗混合汁澄清

微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的有絮凝活性的代謝產(chǎn)物，其組成主要為蛋白質(zhì)、多糖、糖蛋白、核酸和脂類等，如Bacillus licheniformis CCRC 12826產(chǎn)生的絮凝劑為聚谷氨酸［1］，Corynebacterium glutamicum CCTCC M201005產(chǎn)生的絮凝劑REA-11為聚半乳糖醛酸［2］，Bacillus firmus產(chǎn)生的絮凝劑為酸性多糖［3］，Aspergillus flavus產(chǎn)生的絮凝劑IH-7為糖蛋白，由28.5%的蛋白質(zhì)和69.7%的多糖組成［4］，Rhodovulum sp產(chǎn)生的絮凝劑為核酸［5］，Zoogloea ramigera產(chǎn)生的絮凝劑為聚-β-羥丁酸［6］。

與傳統(tǒng)化學(xué)絮凝劑相比，微生物絮凝劑因具有安全無毒、無二次污染、易生物降解的優(yōu)點(diǎn)［7］，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，微生物絮凝劑已廣泛應(yīng)用于水處理、食品加工和發(fā)酵工業(yè)中，在制糖行業(yè)中的應(yīng)用，國內(nèi)外研究較少。李楠等［8］用篩選得到的富產(chǎn)絮凝劑菌株輪枝孢屬（Verticillium sp）處理蔗汁，蔗汁沉降實(shí)驗(yàn)的絮凝率為69.2%，清汁色值為87.4IU。吳春蘭等［9］用3種微生物絮凝劑在甘蔗糖業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)微生物絮凝劑能有效提高混合汁的沉降速度，壓縮濾泥體積并有脫色效果，但除濁效果不理想。本文研究了微生物絮凝劑BN-25的絮凝活性分布、熱穩(wěn)定性及化學(xué)成分分析，并以BN-25為主體，復(fù)配少量的聚丙烯酰胺（PAM），處理甘蔗混合汁，以期降低PAM的使用量而達(dá)到較好的澄清效果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

普通變形桿菌（Proteus vulgaris）N-25由本實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NO：M2014549；甘蔗混合汁pH5.1～5.6，錘度15～18°Bx，簡純度71%～74%，由廣東英德東橋糖業(yè)有限公司提供。

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Scientz-18N型冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；Scientz-18N型冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀NICOLET IS10美國熱電Thermo公司；WAY-Z型自動(dòng)阿貝折射儀、SGW-2型自動(dòng)旋光儀上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基及菌種培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基［10］：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7.4，121℃下滅菌30min。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基［11］：葡萄糖20g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L，（NH4）2SO40.2g/L，K2HPO45.0g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH7.0，115℃下滅菌20min。

從斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)菌種接入5mL種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)4d，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。

1.2.2絮凝物質(zhì)的分布發(fā)酵液7000r/min離心15min，將菌體沉淀用無菌水洗滌兩次稀釋至原來的體積，作為菌體懸濁液。分別測定發(fā)酵液、上清液和菌懸液對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝活性，研究絮凝活性物質(zhì)的分布。

1.2.3絮凝活性測定［12］準(zhǔn)確量取9.3mL質(zhì)量濃度為5g/L的高嶺土懸濁液，加入0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2溶液作助凝劑，同時(shí)加入0.2mL的微生物絮凝劑樣品，調(diào)pH至7.5，攪拌后靜置5min，用分光光度計(jì)測定上清液在波長550nm處的吸光度，同時(shí)以蒸餾水代替待測樣品作為對(duì)照，計(jì)算待測微生物絮凝劑樣品的絮凝率：

絮凝率（%）=（A-B）/A×100

其中：A為對(duì)照上清液在550nm處的吸光度，B為樣品上清液在550nm處的吸光度。

1.2.4微生物絮凝劑BN-25的提取參照Aljuboori AHR等［13］的方法，略有改動(dòng)，具體操作如下。將1L發(fā)酵液5000r/min離心30min去除菌體和雜質(zhì)，取上清液在45℃下旋蒸濃縮至原來體積的1/5，裝入3000u透析袋中透析48h，每6h更換蒸餾水，用苯酚-硫酸法檢測透析液中有無單糖存在。加入4倍體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢栌?℃靜置24h。離心（5000r/min，15min），收集沉淀。將沉淀重新溶于100mL蒸餾水中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化十六烷基吡啶（Cetylpyridinium Chloride，CPC），直至無沉淀析出，充分?jǐn)嚢瑁?h后收集CPC多糖復(fù)合沉淀。將沉淀溶于100mL 0.5mol/L的NaCl溶液中，加入2倍體積的無水乙醇，充分混合后靜置20min。用60%乙醇沖洗沉淀2次，-50℃下冷凍干燥24h，制成微生物絮凝劑BN-25成品。

1.2.5微生物絮凝劑BN-25熱穩(wěn)定性研究將微生物絮凝劑BN-25配成0.5g/L的溶液，取20mL于比色管中放入100℃水浴加熱，每隔5min測定BN-25溶液對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率。

1.2.6微生物絮凝劑BN-25成分分析將微生物絮凝劑BN-25分別用紫外光譜掃描分析是否有蛋白質(zhì)、核酸存在；苯酚-硫酸法測定多糖含量；Bradford法測定蛋白質(zhì)含量；用紅外光譜分析BN-25中的特征基團(tuán)。

1.2.7微生物絮凝劑BN-25與聚丙烯酰胺（PAM）復(fù)配處理甘蔗混合汁澄清工藝采用磷酸-亞硫酸澄清法，具體如下：取甘蔗混合汁500mL，加入85%的磷酸300mg/L，用石灰乳調(diào)至pH6.8，加熱攪拌至60℃后保溫2min。加入亞硫酸硫熏，硫熏量為1.8g/L，中和至一定pH，二次加熱后，快速加入微生物絮凝劑及PAM，攪拌均勻后靜置。記錄沉降250mL清汁所需時(shí)間。30min后測量泥底體積，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，分別測量過濾前后蔗汁的折光錘度及560nm處的吸光度，計(jì)算蔗汁的色值和濁度［14］：

A1和A2分別為過濾前和過濾后蔗汁在560nm處的吸光度，b為比色皿厚度（單位cm），E1、E2為過濾前和過濾后蔗汁的相對(duì)視密度，F(xiàn)1、F2為過濾前和過濾后蔗汁的折光錘度。

表1 因素水平表Table 1　Orthogonal design

1.2.8實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由于澄清工藝涉及中和pH、二次加熱溫度和絮凝劑添加量等因素，根據(jù)糖廠澄清工藝條件、多次預(yù)實(shí)驗(yàn)及以往相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)［15-16］，選擇工藝條件中的中和pH A、二次加熱溫度B、BN-25用量C（mg/L）和PAM用量D（mg/L）四因素按L9（34）安排正交實(shí)驗(yàn)［17］。見表1所示。

1.3數(shù)據(jù)分析處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.0和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1絮凝活性物質(zhì)的分布

測定發(fā)酵液、去菌體的上清液和菌體懸濁液的絮凝率，結(jié)果如圖1所示。菌體懸濁液的絮凝率僅為16.0%，而上清液的絮凝率為81.2%，占混合發(fā)酵液的95%。表明起絮凝作用的活性物質(zhì)主要分布在發(fā)酵液中，是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可通過乙醇沉淀法提取微生物絮凝劑［18］。

圖1　絮凝物質(zhì)的分布Fig.1　The distribution of flocculation activity

2.2微生物絮凝劑BN-25熱穩(wěn)定性研究

微生物絮凝劑BN-25在沸水浴中加熱0～30min，絮凝率變化情況如圖2所示。微生物絮凝劑BN-25的熱穩(wěn)定性很好，能耐受較長時(shí)間的高溫，絮凝活性基本無變化，只在較小范圍內(nèi)上下波動(dòng)，絮凝率均在81%以上。說明BN-25的活性成分不是對(duì)熱較為敏感易變性的蛋白質(zhì)，而可能是不易受熱影響的多糖類物質(zhì)。微生物絮凝劑BN-25的熱穩(wěn)定性具有重要意義，目前已有報(bào)道的大部分微生物絮凝劑在80℃以上高溫下容易失活［19］，絮凝性較差。而在蔗汁澄清工藝中，往往需要將蔗汁加熱到80℃以上。因此，微生物絮凝劑BN-25較好的熱穩(wěn)定性為其處理甘蔗混合汁提供了重要的理論依據(jù)。

圖2　微生物絮凝劑BN-25的熱穩(wěn)定性Fig.2　Thermal stability of bioflocculant BN-25

2.3微生物絮凝劑BN-25成分分析

冷凍干燥后得到微生物絮凝劑BN-25成品0.58g。將絮凝劑BN-25溶于蒸餾水中配成1mg/mL溶液在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，如圖3所示。在260nm處無核酸的吸收峰，280nm處有一微弱吸收峰，說明微生物絮凝劑BN-25中不含核酸，含有少量蛋白質(zhì)。經(jīng)苯酚-硫酸法和Bradford法分別測得BN-25的多糖含量和蛋白質(zhì)含量為89.5%和9.4%，說明BN-25的主要成分是多糖，這也是其具有較好熱穩(wěn)定性的主要原因。

圖3　微生物絮凝劑BN-25的紫外光譜圖Fig.3　UV scanning spectrum of bioflocculant BN-25

BN-25的紅外光譜圖如圖4所示，在3383、2924、2853、1653、1544、1455、1415、1378、1244、1079、1050cm-1處出現(xiàn)了多個(gè)吸收峰。3383cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)而寬的吸收峰為羥基和氨基的特征峰，2924cm-1和2853cm-1兩處較弱的吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)，1653cm-1處的吸收峰為CONH或CONH2基團(tuán)中C=O的伸縮振動(dòng)［20］，1544cm-1處吸收峰為氨基的彎曲振動(dòng)，1455cm-1處吸收峰為C-H的彎曲振動(dòng)，1415cm-1和1378cm-1處吸收峰為COOH基團(tuán)中C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)［11］，1244cm-1處吸收峰為S=O伸縮振動(dòng)［21］，說明BN-25中可能含有硫酸根基團(tuán)，1079cm-1和1050cm-1處較強(qiáng)吸收峰為C-O伸縮振動(dòng)引起。因此，根據(jù)紅外圖譜的分析結(jié)果可知，微生物絮凝劑BN-25中含氨基、羥基、羧基、硫酸根基團(tuán)，這些基團(tuán)在絮凝過程中會(huì)通過電離、電中和、吸附架橋等作用使懸浮物質(zhì)沉淀，達(dá)到較好的絮凝效果［22］。

圖4　微生物絮凝劑BN-25的紅外光譜圖Fig.4　FTIR scanning spectrum of bioflocculant BN-25

2.4微生物絮凝劑BN-25與PAM復(fù)配處理甘蔗混合汁

將微生物絮凝劑與目前糖廠常用的PAM復(fù)配處理甘蔗混合汁。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以色值和濁度為指標(biāo)進(jìn)行極差分析和方差分析，結(jié)果見表3和表4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　The results of orthogonal experiment

表3　各因素水平對(duì)色值和濁度的極差分析Table 3　Range analysis of effects on color and turbidity

表4　各因素水平對(duì)色值和濁度的方差分析Table 4　Variance analysis of effects on color and turbidity

由表3可以看出，各因素對(duì)色值影響的大小順序?yàn)镃＞A＞D＞B，優(yōu)水平為A1B2C2D3，對(duì)濁度的影響大小順序?yàn)锽＞D＞C＞A，優(yōu)水平為A3B3C3D2。由此可見，達(dá)到最大脫色效果時(shí)，不一定能達(dá)到最大除濁效果［15］，需要結(jié)合糖廠的實(shí)際情況選擇合適的工藝條件。由表4可以看出，中和pH和BN-25添加量對(duì)色值都有顯著影響，二次加熱溫度和PAM添加量對(duì)其沒有顯著影響。對(duì)濁度而言，二次加熱溫度對(duì)其有極顯著影響，PAM添加量和BN-25添加量對(duì)其也有顯著影響，而中和pH對(duì)其沒有顯著影響。綜合正交分析結(jié)果，確定微生物絮凝劑BN-25與PAM復(fù)配最佳工藝條件為：中和pH為6.8，二次加熱溫度為100℃，BN-25添加量為12mg/L，PAM添加量為1.0mg/L。

按復(fù)配條件的最佳工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并與單獨(dú)使用微生物絮凝劑BN-25及PAM的澄清效果對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。微生物絮凝劑BN-25和PAM單獨(dú)處理甘蔗混合汁的添加量分別為18、4mg/L（均為最佳添加量，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未列出）。圖5結(jié)果表明，微生物絮凝劑BN-25對(duì)蔗汁具有一定的澄清效果，單獨(dú)添加BN-25蔗汁色值去除率為40.1%，但濁度去除效果不及PAM，蔗汁仍具有較高的濁度，而單獨(dú)添加PAM雖然取得了較好的濁度去除效果，但色值仍高達(dá)428IU。而微生物絮凝劑BN-25和PAM在最佳復(fù)配條件下取得了較明顯的脫色和澄清效果，處理后蔗汁色值僅為273IU，濁度僅為84MAU。由此可見，微生物絮凝劑BN-25與PAM復(fù)配使用可同時(shí)達(dá)到較好的脫色和澄清效果，并且PAM的添加量可從4mg/L降至1mg/L，可大大降低蔗汁澄清工藝中PAM的用量，雖然PAM由于其較好的絮凝和助凝效果而廣泛用于水處理和部分食品工業(yè)，但PAM很難降解，并且其殘留單體丙烯酰胺具有致癌作用［23］，因此在食品工業(yè)中盡可能減少這類有機(jī)高分子物質(zhì)的應(yīng)用具有重要意義。

圖5 微生物絮凝劑BN-25與PAM復(fù)配、單獨(dú)添加PAM及單獨(dú)添加BN-25分別處理甘蔗混合汁效果對(duì)比Fig.5　Combination of bioflocculant BN-25 and PAM，addition PAM alone，and addition bioflocculant BN-25 alone in clarification process of sugarcane juice

3　結(jié)論

微生物絮凝劑是一種新型高效絮凝劑，本文研究了微生物絮凝劑BN-25的絮凝活性分布、熱穩(wěn)定性及其化學(xué)成分分析，并將其應(yīng)用于蔗汁澄清工藝，與PAM復(fù)配處理甘蔗混合汁。微生物絮凝劑BN-25的絮凝活性成分主要分布在發(fā)酵液中，絮凝率高達(dá)81.2%，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，100℃下連續(xù)沸水浴30min，絮凝活性保持不變，適合處理二次加熱后的甘蔗混合汁。微生物絮凝劑BN-25的主要成分為多糖，其含量達(dá)89.5%，且含有大量的氨基、羥基、羧基、硫酸根基團(tuán)等有利于絮凝的基團(tuán)。與PAM復(fù)配處理甘蔗混合汁，最佳復(fù)配條件為中和pH6.8，二次加熱溫度100℃，BN-25添加量12mg/L，PAM添加量1.0mg/L，處理后澄清效果明顯，蔗汁色值僅為273IU，濁度僅為84MAU，優(yōu)于單獨(dú)添加PAM，并降低PAM用量75%以上，表明微生物絮凝劑BN-25在制糖行業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。

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Study on characteristics of bioflocculant BN-25 and its application in clarification process of sugarcane juice

LUO Yu-qin，F(xiàn)U Xiong，HOU Yi*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Present study was aimed to assess the characteristics and chemical composition of bioflocculant BN-25.It was observed that active flocculation substances of bioflocculant BN-25 were found mainly in the fermentation broth.The flocculation activity of bioflocculant BN-25 exhibited thermal stability during continuous boiling on water bath for 30minutes.Ultraviolet（UV），F(xiàn)ourier transform infrared（FTIR）and content analysis revealed that bioflocculant BN-25 contained large amount of amino，hydroxyl，carboxyl，and sulfate groups which were favorable for flocculation.With ahigh content of 89.5%，polysaccharide was the main component of bioflocculant BN-25.During the clarification processing of sugarcane juice，bioflocculant BN-25 and polyacrylamide（PAM）were combined and the optimum conditions were pH of 6.8，secondheating temperature of 100℃，bioflocculant BN-25 dosage of 12mg/L，and PAM dosage of 1.0mg/L，which were determined by orthogonal experiment and variance analysis.After treatment by bioflocculant BN-25 and PAM，the color value of sugarcane juice was 273IU and the turbidity was 84MAU，which were superior to those of addition PAM alone.Present findings provided basic data and theoretical foundation for the application of bioflocculant BN-25 in the sugar industry.

bioflocculant；thermal stability；polysaccharide；PAM；clarification processing of sugarcane juice

TS244

B

1002-0306（2015）10-0205-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.034

2015－01－16

羅玉琴（1990-），女，碩士研究生，研究方向：功能碳水化合物。

侯軼（1973-），女，博士，高級(jí)工程師，研究方向：廢水生化處理。

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4500036）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B050500003）；廣東省領(lǐng)軍人才項(xiàng)目。