北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（100039）都姣嬌

河北省石家莊市第四醫(yī)院（050011）蘇紅寧

河北工程大學附屬醫(yī)院（056002）齊淑靜

附子是毛茛科植物烏頭Aconitum Carmicheali Debx的子根，該植物全株有毒，并以根頭最毒。生藥中的毒性成分主要為烏頭堿(Aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)、次烏頭堿(hypaconitine)等雙酯型二萜類生物堿。其中以次烏頭堿含量最高，次烏頭堿的小鼠半數(shù)致死量為1.8mg/kg（口服）和0.308mg/kg（腹膜內(nèi)給藥）[1]，而對于人口服0.12mg即可出現(xiàn)毒性反應，3～4mg可致人死亡。主要表現(xiàn)為神經(jīng)和心臟毒性[2]。因此，次烏頭堿的毒性影響著臨床用藥的安全和療效。體外培養(yǎng)的心肌細胞可保持結(jié)構(gòu)及功能上的某些特點，并具有自發(fā)性節(jié)律搏動，且心肌細胞的培養(yǎng)具有定量、重復性好以及不受神經(jīng)體液因素影響等特點，故在探索具有心血管系統(tǒng)藥物的毒性作用機制方面具有重要的意義。本文主要研究附子的主要毒性成分次烏頭堿對大鼠體外心肌細胞的毒性作用及其作用機制，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 動物、試劑及儀器

Wistar大鼠，雄性，購入時體重140～180g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。次烏頭堿標準品(HA，中國藥品生物制品檢定所，純度>98%)；胰蛋白酶、二甲亞砜(DMSO)(Amresco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、I型膠原酶、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、5-溴脫氧尿核苷(Roche公司)；丙二醛測定試劑盒(南京建成生物制品有限公司)。CJT型超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化設備有限公司）；RCO-3000T-5V型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國G.S.公司），DMIL HC倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；400R低溫離心機（德國Heraeus公司）；HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 大鼠心肌細胞制備 將大鼠在無菌條件下開胸取出心臟，去除心房組織。將心室肌迅速放入冷的D-Hank’s中清洗3～4次，洗去心臟表面及血管中殘留的紅細胞，清除大血管。在西林瓶中將心臟組織剪成1mm3大小的組織碎塊，加入3倍體積消化酶（終濃度0.04%的胰酶和終濃度0.04%的膠原酶II型的混合液），放入37℃，40轉(zhuǎn)/min空氣浴振蕩20min，反復至消化完全，收集上清液加入等體積含10%胎牛血清終止消化。于4℃，1000rpm離心10min收集細胞，加入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打成單細胞懸液，用150目篩網(wǎng)過濾除去未消化的組織塊。接種于25cm2的卡式培養(yǎng)瓶中5%CO2、37℃培養(yǎng)2h，除去貼壁的成纖維細胞，將細胞濃度調(diào)至3×105個/ml，0.4%臺盼藍染色，計數(shù)活細胞比率；在細胞懸液中加入0.1mmol/L的5-溴脫氧尿苷，按每孔50μl接種至96孔培養(yǎng)板，每孔1ml接種于24孔培養(yǎng)板，48h換液1次，連續(xù)培養(yǎng)5d。

附表1 次烏頭堿對大鼠心肌細胞活性的影響

附表1 次烏頭堿對大鼠心肌細胞活性的影響

注：Compared with DMSO group:*P<0.01。

hypaconitine/μg/ml A490 12h 24h 48h DMSO 0.4309±0.0235 0.4501±0.0821 0.4639±0.1004 0.1 0.4265±0.0861* 0.4382±0.0873* 0.3985±0.0146*1.0 0.4010±0.0632* 0.3824±0.0612* 0.3722±0.0341*10.0 0.3723±0.0894* 0.3544±0.0921* 0.3296±0.0721*100.0 0.3301±0.687* 0.3134±0.0124* 0.2956±0.0643*

附表2 MDA的測定結(jié)果（n=8，

附表2 MDA的測定結(jié)果（n=8，

注：Compared with DMSO group:*P<0.01。

MDA/mmol/ml 12h 24h 48h DMSO 2.6813±0.0054 2.5214±0.0024 2.2467±0.0091 0.1 2.9843±0.0023* 3.0144±0.0075* 3.1001±0.0056*1.0 3.1052±0.0042* 3.1286±0.0035* 3.6973±0.0093*10.0 3.8731±0.0057* 3.9267±0.0031* 4.0101±0.0066*100.0 4.0341±0.0037* 4.1754±0.0022* 4.3561±0.0027*hypaconitine/μg/ml

2.2 實驗分組設定 將次烏頭堿溶于DMSO中，再按照1:200的比例將DMSO溶于DMEM/F12培養(yǎng)液中。原代培養(yǎng)5d后，將96孔板中的心肌細胞隨機分為5組，分別給予HA終濃度為100.0、10.0、1.0、0.1μg/ml的含藥培養(yǎng)基，同時設DMSO溶劑對照，培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h。

2.3 心肌細胞存活率測定 在給藥12h、24h、48h后分別進行細胞存活率測定。在96孔板中每孔加入20μlMTT溶液（5g/L），37℃孵育4h，加入150μlDMSO溶液，200rpm振蕩15min后，酶標儀測定各孔490nm處的吸光度，重復2次。

2.4 MDA測定 將接種于24孔板的心肌細胞培養(yǎng)5d后，隨機分為4組。分別給予次烏頭堿終濃度100.0、10.0、1.0μg/ml的含藥培養(yǎng)基，同時設DMSO為溶劑對照組。加藥后培養(yǎng)12h、24h、48h，利用超聲細胞破碎法破碎細胞后，按試劑盒說明進行MDA的測定。

2.5 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)經(jīng)核對后用Epidata3.0錄入，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，兩組計數(shù)資料采用t檢驗；兩組計數(shù)資料采用x2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 心肌細胞初始存活率 實驗中采用的大鼠心肌細胞培養(yǎng)技術，心肌細胞存活率≥90%。

3.2 給藥前心肌細胞形態(tài)學觀察 在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的心肌細胞尚未貼壁，呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。36～48hrs換培養(yǎng)液時，心肌細胞已全部貼壁生長，細胞核突出明顯，貼壁后細胞為菱形、梭形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成放射狀排列的細胞簇，可出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性搏動。

3.3 給藥后心肌形態(tài)和搏動頻率的變化 倒置顯微鏡下對心肌細胞自發(fā)搏動頻率進行觀察統(tǒng)計，正常培養(yǎng)5d后，心肌細胞自發(fā)搏動頻率為50～70次/分。加藥后，次烏頭堿1.0、0.1μg/ml劑量組細胞貼壁及生長狀態(tài)基本良好，搏動情況與溶劑對照組相似。100.0、10.0μg/ml劑量組心肌細胞皺縮變圓，偽足減少，細胞搏動減少，且搏動頻率30～180次/分，節(jié)律性差，并出現(xiàn)部分懸浮死細胞。

3.4 給藥后細胞存活率結(jié)果 給藥后12h、24h、48hMTT法測定細胞存活率，與溶劑對照組相比，次烏頭堿100.0、10.0、1.0μg/ml3個濃度組細胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見附表1)。

3.5 MDA的測定結(jié)果 給藥后12h、24h、48h測定。各濃度組MDA測定值均隨次烏頭堿給藥濃度的增加而升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。48hMDA測定值較24h高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(附表2)。

4 討論

次烏頭堿是附子的主要有毒成分之一。劉芳等采用HPLC分析方法研究發(fā)現(xiàn)生附片中次烏頭堿的含量為0.635mg/g。使用相同的方法檢測熟附片、鹽附片、黑順片等10種附子炮制品，發(fā)現(xiàn)多數(shù)炮制品中只有烏頭堿與次烏頭堿少量存在，而后者的含量是前者的1～12倍。有研究顯示烏頭類中毒大鼠的90d、180d的長期毒性試驗中發(fā)現(xiàn)各給藥組動物心臟有不同程度的損傷。綜合體內(nèi)體外試驗結(jié)果，說明附子及其主要成分次烏頭堿具有心臟毒性，致毒機理可能為細胞毒性和氧化損傷作用。

在附子心臟毒性的報道中，次烏頭堿還可引起心肌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高。另外，心律失常也是附子中毒的主要表現(xiàn)之一，以心動過緩和室性期前收縮最為常見。目前國內(nèi)外對雙酯型生物堿的毒性研究大多局限于心肌細胞損傷及心肌細胞離子通道檢測等方面，但對毒物靶器官心室肌細胞群毒性作用的分子毒理學機制，特別是雙酯型生物堿對心肌細胞之間信息傳遞的影響機制、基因表達調(diào)控機制尚不明確。隨著分子毒理學研究技術的不斷發(fā)展，可進一步從附子的心肌毒作用及調(diào)控機制的蛋白組學方面深入研究，為挖掘我國傳統(tǒng)藥用毒物所具有的重要藥用價值、臨床合理有效用藥、烏頭堿中毒的臨床確診與科學救治，以及法醫(yī)毒理學研究、法醫(yī)學鑒定提供科學支撐和理論依據(jù)。