張靖，姜華，陳昆山，李海波，蔣貽洲，林雀卿，李丹，黃曉明，肖湘生

·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·

經(jīng)眼動脈灌注治療兔成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤

張靖，姜華，陳昆山，李海波，蔣貽洲，林雀卿，李丹，黃曉明，肖湘生

目的評估兔成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）模型的建立及經(jīng)導(dǎo)管眼動脈灌注（selective ophthalmic arterial injection，SOAI）治療兔RB的可行性。方法HXO-Rb44RB細(xì)胞予中心細(xì)胞室培養(yǎng)，取對數(shù)生長期HXO-Rb44細(xì)胞，用PBS配成濃度為2.0×107個/ml的細(xì)胞懸液，抽取0.1 ml細(xì)胞懸液注射于6只SPF級新西蘭兔右眼視網(wǎng)膜間隙下。接種腫瘤細(xì)胞前3 d和注射后1個月臀部注射環(huán)孢素A 15 mg·kg-1·d-1，1個月后減量至10 mg·kg-1·d-1并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將RB兔分為對照組3只和實(shí)驗(yàn)組3只，對照組灌注0.9%氯化鈉溶液15 ml，實(shí)驗(yàn)組將美法侖2.5 mg用0.9%氯化鈉溶液稀釋至15 ml后灌注。術(shù)后分別于7、14 d比較兩組腫瘤生長情況。結(jié)果注射環(huán)孢素A期間，實(shí)驗(yàn)兔不良反應(yīng)輕微，6只均建模成功。7次插管中6次成功插至眼動脈。SOAI術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組腫瘤可見明顯縮小，2周后均消失。SOAI術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組僅1只見右眼輕度紅腫、流淚，1周后紅腫自行消退。結(jié)論SOAI治療RB兔具有可行性，為進(jìn)一步經(jīng)眼動脈灌注治療RB的基礎(chǔ)研究提供了參考。

成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；動物模型；經(jīng)眼動脈灌注術(shù)；美法侖

【Abstract】ObjectiveTo investigate the establishment of retinoblastoma model in experimental rabbits，and to evaluate the feasibility and success rate of selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan in treating retinoblastoma in experimental rabbits.MethodsThe human retinoblastoma HXO-Rb-44 cell line was cultured in the cell culture chamber with modified RPMI 1 640 medium containing 10%fetal bovine serum.The cell concentration in the suspension was 2.0×107cells/ml.The cell suspension of 0.1 ml was injected in the retinal gap of the right eye in six New Zealand rabbits.The rabbits were immuno-suppressed with daily intramuscular injection of cyclosporin A so as to prevent spontaneous tumor regression.The dosage schedule was 15 mg/kg per day for 3 days before cell inoculation and for 4 weeks thereafter，which was followed by 10 mg/kg per day for the last week of the experiment.The rabbits were randomly divided into study group（n=3）and control group（n=3）.Under general anesthesia selective ophthalmic arterial perfusion was performed in all the experimental rabbits.Melphalan（2.5 mg）was diluted with saline to prepare 15 ml solution and the solution was then injected in a pulse type into the rabbits of the experiment group，while only 15 ml saline was injected into the rabbits of the control group.The tumor growth condition at 7 and 14 days after the treatment was determined，and the results were compared between the two groups. ResultsDuring the period when the injection of cyclosporin A was used，the rabbits showed mild side effects.The retinoblastoma model was successfully established in all six experimental rabbits.Super-selectivecatheterization was performed 7 times，of which successful catheterization of ophthalmic artery was obtained in 6.One week after selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan the tumor size was significantly decreased，and the tumor disappeared within 2 weeks.In the control group，swelling and tears of the right eye was observed in one rabbit，which spontaneously disappeared in one week.ConclusionFor the treatment of retinoblastoma in rabbits，selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan is feasible.The results of this study provide useful reference for further research on ophthalmic arterial perfusion for retinoblastoma.（J Intervent Radiol，2015，24：146-149）

【Key words】retinoblastoma；animal model；selective ophthalmic arterial perfusion；melphalan

成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是兒童最常見的眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，全球發(fā)病率約為1/ 15 000～18 000，不治療的病死率高達(dá)100%［1-3］。近年來發(fā)達(dá)國家通過開展常規(guī)眼科篩查，早期診斷治療，RB患兒5年生存率已達(dá)87%～99%［4］。發(fā)展中國家RB患兒往往因發(fā)現(xiàn)明顯白瞳或斜視才就診，延誤了早期治療時機(jī)，病死率仍高達(dá)39%［5］。

2008年，Abramson等［6］使用微導(dǎo)管從股動脈穿刺進(jìn)入到眼動脈，直接將化療藥物灌注到眼動脈，取得了顯著的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，該法到達(dá)眼球內(nèi)的藥物濃度是經(jīng)靜脈進(jìn)入的10倍，且能夠有效地降低眼球摘除率和患者因腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的病死率［7-9］。隨著經(jīng)眼動脈灌注化療技術(shù)（SOAI）治療RB的應(yīng)用，使部分眼球避免了摘除，但術(shù)后視力恢復(fù)不佳，可能與治療后眼底血管病變有關(guān)。

動物模型是醫(yī)學(xué)研究的一個重要工具。20世紀(jì)90年代已有轉(zhuǎn)基因鼠的RB模型的報道［10］。但轉(zhuǎn)基因鼠與人的眼睛體積差距較大，而且其股動脈較細(xì)，無法在鼠RB模型上實(shí)施SOAI術(shù)。2011年，有學(xué)者成功建立了兔RB模型［11］，本研究參照該方法建立了模型，并經(jīng)眼動脈灌注美法侖治療兔RB，觀察SOAI技術(shù)用于動物模型的可行性，為進(jìn)一步SOAI治療RB的基礎(chǔ)研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料新西蘭兔6只由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級，雄性，體質(zhì)量1.4～1.6 kg，均具有健康合格證。HXO-Rb-44 RB細(xì)胞由湖南醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.2主要儀器及試劑CKX41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；311型恒溫CO2孵箱（美國Thermo）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化有限公司）；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DSA機(jī)（美國GE Innova 3100-IQ）。DMEM/F12培養(yǎng)液（批號NYF0890，Hyclone公司產(chǎn)品）；胎牛血清（批號91110002，GIBCO公司產(chǎn)品）；青/鏈霉素雙抗（批號13013202，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品）。

1.2方法

1.2.1兔RB模型的建立HXO-Rb-44 RB細(xì)胞由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞室培養(yǎng)。使用DMEM/ F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液加10%胎牛血清，培養(yǎng)皿中加入10 ml培養(yǎng)液。待細(xì)胞長至80%～90%融合時，棄去原培養(yǎng)液，PBS液洗滌2次，加入培養(yǎng)液，小心吹打細(xì)胞，1傳3，傳代細(xì)胞觀察3 d。

新西蘭兔于接種腫瘤細(xì)胞前3 d和注射后1個月均于臀部注射環(huán)孢素A 15 mg·kg-1·d-1，1個月后減量至10 mg·kg-1·d-1，并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。取對數(shù)生長期HXO-Rb44RB，用PBS配成濃度為2.0×107個/ml的細(xì)胞懸液，取0.1 ml細(xì)胞懸液注射6只新西蘭兔右眼視網(wǎng)膜間隙，四環(huán)素可的松眼藥膏涂眼。每日散瞳觀察腫瘤生長情況，2周后進(jìn)行超聲檢查。

1.2.2SOAI術(shù)治療兔RB隨機(jī)將RB實(shí)驗(yàn)動物分為對照組3只、實(shí)驗(yàn)組3只。于接種腫瘤細(xì)胞后2周，肌內(nèi)注射0.2～0.3 ml/kg速眠新，麻醉后仰臥位固定，兔右側(cè)股動脈根部皮膚常規(guī)脫毛消毒，切開皮膚分離暴露股動脈，行股動脈Seldinger穿刺，成功后置入4 F小兒血管鞘。在X線透視引導(dǎo)下，用4 F超滑Cobra導(dǎo)管（日本Terumo）選擇性插入右側(cè)頸內(nèi)動脈。增強(qiáng)器轉(zhuǎn)至90°，頭顱影像呈側(cè)位，采取人工手推對比劑（碘克沙醇）進(jìn)行頸內(nèi)動脈造影，眼動脈顯影后予以路圖，用ev3微導(dǎo)絲引導(dǎo)1.7 F ev3 45°微導(dǎo)管行眼動脈超選擇性插管，造影確認(rèn)后，行眼動脈灌注。對照組灌注0.9%氯化鈉溶液15 ml，實(shí)驗(yàn)組將美法侖2.5 mg用0.9%氯化鈉溶液稀釋至15 ml后灌注。術(shù)畢，撤管后拔動脈鞘，壓迫穿刺點(diǎn)5～10 min并依次縫合各層組織后用無菌紗布包扎，并預(yù)防性使用抗菌藥物3 d。術(shù)后分別于7、14 d觀察兩組腫瘤生長情況。

1.3統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

2.1兔RB模型的建立

實(shí)驗(yàn)兔在注射環(huán)孢素A期間主要的不良反應(yīng)為齒齦腫大、垂涎、體質(zhì)量下降，并至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。注射腫瘤細(xì)胞7 d后，6只實(shí)驗(yàn)兔均可見腫瘤生長并持續(xù)增大。其中2只呈外生性生長（圖1），將其分別納入實(shí)驗(yàn)組和對照組。其余4只用間接檢眼鏡及超聲檢查可見視網(wǎng)膜腫瘤塊狀生長。

圖1　腫瘤呈外生性生長

2.2SOAI術(shù)治療兔RB結(jié)果

SOAI術(shù)插管中，5只成功插至眼動脈（圖2），1只因眼動脈痙攣插管失敗，2 d后行左側(cè)股動脈穿刺并成功插至眼動脈。

圖2　頸內(nèi)動脈造影顯示RB兔的眼動脈

SOAI術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組腫瘤可見明顯縮小，2周后均消失（圖3、4）。對照組腫瘤持續(xù)生長，未見縮小。

SOAI術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組僅1只見右眼輕度紅腫、流淚，1周后紅腫自行消退。實(shí)驗(yàn)組3只RB兔SOAI術(shù)后2周體質(zhì)量由（1.5±0.2）kg下降至（1.2± 0.1）kg，對照組體質(zhì)量由（1.5±0.1）kg下降至（1.3± 0.3）kg，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3　超聲示腫瘤治療前后變化

圖4　外生性腫瘤治療前后變化

3　討論

隨著醫(yī)療水平的提高，RB的治療模式發(fā)生改變，由挽救生命轉(zhuǎn)向挽救患兒生命的同時保住眼球甚至視力，提高患兒的生活質(zhì)量［12］。全身化療聯(lián)合一種或多種局部治療（激光電凝術(shù)、冷凍、熱療）是近10余年來治療RB的模式，使RB保眼治療成為目標(biāo)。雖然使用全身化療聯(lián)合局部治療RB取得了良好的治療效果，但是很多研究證實(shí)，單純化療結(jié)合局部治療對于國際眼內(nèi)RB分級標(biāo)準(zhǔn)（IIRC）D-E期患兒的療效并不顯著［13-14］，而且化療的不良反應(yīng)也較大。眼內(nèi)期RB化療過程中可出現(xiàn)暫時性脊髓抑制，永久的聽力損傷和腎損害，加之潛在性的二次腫瘤的發(fā)生，尤其是白血?。?5-16］。SOAI治療RB有效，并發(fā)癥少，甚至可以改善視力，但對于眼內(nèi)晚期的RB，其保眼率依然達(dá)不到100%［17］，而且隨著美法侖的不斷應(yīng)用，其眼底血管的并發(fā)癥也越來越受到關(guān)注［18］。

2011年，兔RB模型的成功建立，使SOAI的動物基礎(chǔ)研究成為可能。因兔的眼睛與小兒眼睛的體積具有可比性，既往也有對兔VX2肝移植瘤進(jìn)行股動脈穿刺并經(jīng)肝動脈灌注栓塞化療的報道［19］，使超選擇兔眼動脈成為可能。本實(shí)驗(yàn)正是基于兔RB模型的建立，初步探討經(jīng)眼動脈灌注美法侖治療兔RB的可行性。

兔與裸鼠的區(qū)別在于兔具有自身免疫力，會影響RB腫瘤細(xì)胞的接種。為提高建模成功率，我們采用SPF級兔作為實(shí)驗(yàn)對象，其飼養(yǎng)環(huán)境干潔，對培養(yǎng)瘤種更適合，且肌注環(huán)孢素A，抑制了其自身免疫力，有利于腫瘤細(xì)胞的生長［20］。本實(shí)驗(yàn)中，兔RB模型的成功建立，其中有2只呈外生性生長，可能原因是未將腫瘤細(xì)胞種植于視網(wǎng)膜下，而是種植于鞏膜下所致，但經(jīng)SOAI術(shù)后腫瘤也發(fā)生消退，證明有藥物到達(dá)腫瘤供養(yǎng)的血管內(nèi)。

2004年，日本學(xué)者報道了SOAI治療RB的技術(shù)［21］。該技術(shù)使用球囊導(dǎo)管阻礙頸內(nèi)動脈穹窿上大腦供血，再經(jīng)導(dǎo)管于球囊近端灌注化療藥，迫使化療藥大部分直接進(jìn)入眼動脈，起到局部化療的作用。因其該技術(shù)致使藥物未能全部進(jìn)入眼動脈，影響了療效。2008年，超選擇直接灌注眼動脈法的出現(xiàn)，提高了治療效果。本實(shí)驗(yàn)，7次插管中6次成功。1只RB兔因眼動脈痙攣致使插管失敗，2 d后行左側(cè)股動脈穿刺并成功插至眼動脈。對此我們建議，應(yīng)由有血管介入經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行操作，動作要輕柔，以提高技術(shù)成功率。

本研究存在的不足之處是樣本量少，且腫瘤生長時間短，導(dǎo)致腫瘤體積小，所以只初步探討經(jīng)眼動脈灌注化療在動物模型的可行性，為進(jìn)一步深入的基礎(chǔ)研究提供參考。

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Selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan for retinoblastoma：an experimental study inrabbits

ZHANG Jing，JIANG Hua，CHEN Kun-shan，LI Hai-bo，JIANG Yi-zhou，LIN Que-qing，LI Dan，HUANG Xiao-ming，XIAO Xiang-sheng.Department of Radiology，Affiliated Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

XIAO Xiang-sheng，E-mail：cjr.xiaoxiangsheng@vip.163.com

R774.1；R739.72

A

1008-794X（2015）-02-0146-04

2014-08-03）

（本文編輯：李欣）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.02.014

廣州市科技和信息化局項目（2012J4100032）

200003上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院放射科（張靖、肖湘生）；廣州市婦女兒童醫(yī)療中心介入與血管瘤科（張靖、姜華、陳昆山、李海波、蔣貽洲、林雀卿、李丹、黃曉明）

肖湘生E-mail：cjr.xiaoxiangsheng@vip.163.com