屈建航尹伊焦國(guó)寶丁長(zhǎng)河張倩屈凌波劉仲敏

（1. 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，澠池 472400）

酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件研究

屈建航1尹伊1焦國(guó)寶2丁長(zhǎng)河1張倩1屈凌波1劉仲敏2

（1. 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，澠池 472400）

自淀粉廠周邊土壤分離篩選到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3，初步鑒定為酵母菌，發(fā)酵粗酶pH范圍3.8-8.0，最適作用pH5.0，該酶在80℃下仍有酶活，最適作用溫度50℃。經(jīng)單因素發(fā)酵條件的研究與優(yōu)化，最適溫度37℃，培養(yǎng)基初始pH5.0，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨為氮源，200 mL裝液量。正交試驗(yàn)確定最佳產(chǎn)酶條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，該條件下酶活力為96.8 U/mg。

耐酸α-淀粉酶；菌株篩選；發(fā)酵條件；工藝優(yōu)化；酵母菌

α-淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部切開(kāi)α-1，4 糖苷鍵，生成糊精和還原糖，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、制藥、紡織及石油開(kāi)采等諸多領(lǐng)域，在工業(yè)生產(chǎn)中有極其重要的地位，是目前用途較廣泛的一種酶制劑［1，2］。目前工業(yè)應(yīng)用的α-淀粉酶主要來(lái)源于細(xì)菌和絲狀真菌［3，4］，在原始菌株中，真菌來(lái)源的α-淀粉酶被發(fā)現(xiàn)比細(xì)菌更穩(wěn)定［5］。國(guó)外對(duì)酸性α-淀粉酶的研究起步較早，1963年日本Yasuji等［6］發(fā)現(xiàn)可用真菌生產(chǎn)酸性α-淀粉酶。在酵母菌中也發(fā)現(xiàn)了部分能產(chǎn)生高酶活α-淀粉酶的菌株［7］。我國(guó)對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶菌株的研究起步較晚，尤其是耐酸性α-淀粉酶。目前，國(guó)際上一些大的酶制劑公司生產(chǎn)耐酸α-淀粉酶的菌種50%是基因工程菌［8］。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)十株優(yōu)良產(chǎn)α-淀粉酶菌，包括耶魯維亞酵母（Yarrowia）、類(lèi)酵母（Aureobasidium）、畢赤氏酵母（Pichia）、假絲酵母（Candida）、紅酵母（Rhotolorula）等［9］，對(duì)酵母菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶有了進(jìn)一步推動(dòng)［10］。本研究篩選出一株耐酸性α-淀粉酶酵母菌株，研究且優(yōu)化其發(fā)酵條件，旨在為工業(yè)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 河南省偃師某面粉廠污水排出口處采集土壤樣品。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基（g/L）［1］：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 10，瓊脂粉 15，pH 5.0。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）［11］：胰蛋白胨5，可溶性淀粉10，（NH4）2SO42.5，KH2PO43，CaCl20.2，pH調(diào)至5.0。

1.2 方法

1.2.1 酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選 初篩：土壤樣品，10倍梯度稀釋法涂布于篩選培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)。滴加碘液，記錄有透明圈的菌株。復(fù)篩：將初篩有透明圈的菌株，接種種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min，上清為粗酶液，測(cè)定酶活［1］。

1.2.2 淀粉酶活力測(cè)定方法 Yoo酶活測(cè)定法［12，13］稍加改進(jìn)：2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液與2.5 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH5.0）50℃恒溫水浴鍋預(yù)熱10 min，加入酶液0.5 mL，50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入5 mL 0.1 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，取上述混合液0.5 mL與5 mL碘液混勻，660 nm測(cè)定吸光度值R（以2.5 mL蒸餾水代替可溶性淀粉溶液，其余條件相同作為空白）。在上述反應(yīng)條件下，以0.5 mL的緩沖液代替0.5 mL酶液，測(cè)定吸光度值R0［11］。

酶活定義：50℃、pH5.0條件下，10 min水解1 mg淀粉所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

酶活公式：待測(cè)酶活（U/mg）=100*D*（R0-R）/R

其中，D：稀釋倍數(shù)，R0：對(duì)照吸光值，R：酶液的吸光值，100：轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.2.3 菌種ITS序列鑒定

1.2.3.1 分子試劑及引物 Taq mix（TaKaRa）、ITS4引物5'-3'：ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5引物5'-3'：TCCTCCgCTTATTgATATgC。

1.2.3.2 基因系統(tǒng)發(fā)育鑒定 基因組總DNA的提取參考文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。ITS序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Taq mix 12.5 μL，ITS4 0.5 μL，ITS5 0.5 μL，ddH2O 9 μL，基因組DNA模板2.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)過(guò)程：95℃ 5 min，30次循環(huán)（94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物測(cè)定核苷酸序列，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)完成BLAST比對(duì)。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究 37℃、200 r/min培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖條件，分別測(cè)定酶活以確定pH范圍。設(shè)置30、37、45、50、55、60、70和80℃溫度條件測(cè)定酶活以確定溫度耐受性。

1.2.5 產(chǎn)酶發(fā)酵條件研究

1.2.5.1 菌株產(chǎn)酶曲線 種子液10 mL接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，從3 h開(kāi)始每小時(shí)測(cè)定酶活，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酶曲線。

1.2.5.2 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 以5%的接種量將種子液接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，分別28、37、40℃振蕩培養(yǎng)，從產(chǎn)酶高峰期開(kāi)始每小時(shí)測(cè)定酶活。

1.2.5.3 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0，接入5%種子液，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產(chǎn)酶高峰期取樣，測(cè)定酶活。

1.2.5.4 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 分別以0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源，5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產(chǎn)酶高峰期測(cè)定酶活［15］。

1.2.5.5 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 分別以0.5%蛋白胨、棉籽餅、黃豆餅、牛肉膏作為氮源，5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產(chǎn)酶高峰期測(cè)定酶活。

1.2.5.6 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 在500 mL三角瓶中分別裝入50、100、150、200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5%的種子液，37℃、200 r/min培養(yǎng)，在產(chǎn)酶高峰期測(cè)定酶活。

1.2.6 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)碳源、氮源、溫度和pH，經(jīng)SPSS軟件設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)［16］。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

共篩選出產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株24株，部分篩選結(jié)果見(jiàn)表1，其中初篩SH3菌株，透明圈/菌落直徑比最大，D/d為5，選其作為實(shí)驗(yàn)菌株。

表1 菌種初篩結(jié)果

2.2 菌種鑒定

PCR擴(kuò)增菌株18S ITS基因片段，測(cè)序后GenBank序列比對(duì)，結(jié)果與紅酵母屬（Rhodotorula sp.）的序列同源性最高，為97%（AM901697）-98%（NR073315），基本確定為酵母菌。

2.3 產(chǎn)酶曲線

產(chǎn)酶曲線見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)酶活先上升后下降，在14 h酶活達(dá)到91.4 U/mg，此后酶活迅速下降，12-15 h是高酶活時(shí)期。

圖1 SH3菌株產(chǎn)酶曲線圖

2.4 酶的pH和溫度范圍

50℃、不同pH下測(cè)定菌株SH3的α-淀粉酶活力，結(jié)果如表2所示。SH3所產(chǎn)淀粉酶活力受酸堿度影響較大，該酶在pH3.8-8.0之間均有酶活，在偏酸性條件下酶活力較高，pH5.0為酶反應(yīng)最適pH，酶活為79.8 U/mg。

表2 酶的pH耐受范圍

pH5.0、不同溫度下測(cè)定SH3酶活力，結(jié)果由表3可知，該酶在30℃-80℃均有酶活，30℃-50℃酶活力隨溫度升高而升高，最適作用溫度為50℃，酶活力為74.2 U/mg。

表3 酶的溫度作用范圍

2.5 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 28℃、37℃、40℃發(fā)酵條件下研究溫度對(duì)菌株SH3產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖2）表明，37℃和40℃酶活均是先上升后下降，37℃酶活14 h達(dá)到最高91.6 U/mg，40℃酶活與37℃相比上升較快，13 h達(dá)到最高91.3 U/mg，但下降也較快。28℃菌體生長(zhǎng)緩慢，高活性酶活出現(xiàn)較晚?？赡茈S溫度升高生長(zhǎng)代謝加快，產(chǎn)酶高峰期提前。選取37℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖2 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5.2 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，在發(fā)酵高峰期，相同時(shí)間內(nèi)200 mL裝液量的發(fā)酵酶活最高，14 h時(shí)達(dá)到最高88.2 U/mg。

2.5.3 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 選取pH4.5、5.0、5.5、6.0的初始培養(yǎng)條件，分別測(cè)定SH3酶活力，結(jié)果（圖4）表明，pH4.5-6.0條件下菌體均能生長(zhǎng)，發(fā)酵14 h時(shí)測(cè)定酶活，pH5.0發(fā)酵條件下酶活最高，為89.7 U/mg，依次高于pH5.5、6.0和4.5，其中pH4.5發(fā)酵條件下酶活相對(duì)最低，為33.4 U/mg。

圖3 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶影響

圖4 初始培養(yǎng)基pH條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5.4 碳源和氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由表4可知，可溶性淀粉作為培養(yǎng)基碳源時(shí)酶活最高，為87.95 U/mg，葡萄糖作碳源時(shí)酶活最低。而氮源中蛋白胨為最佳氮源，酶活最高達(dá)到93.39 U/mg，棉籽餅作氮源時(shí)酶活最低，為53.82 U/mg。

表4 碳源和氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.6 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上，對(duì)可溶性淀粉、蛋白胨、初始溫度與pH四因素作三水平正交試驗(yàn)（表5）。由表6可知，最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，對(duì)應(yīng)酶活最高為96.8 U/mg。極差分析結(jié)果可看出，碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響最大，影響程度依次為：可溶性淀粉＞蛋白胨＞pH＞溫度。

表5 四因素三水平表

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果

3 討論

酶α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生產(chǎn)產(chǎn)品過(guò)程中使用的主要糖酶，在全球酶制劑產(chǎn)業(yè)中占30%左右［17，18］。傳統(tǒng)α-淀粉酶最適作用pH值為5.8-6.2，而淀粉乳偏酸性（pH3.2-4.5），進(jìn)一步糖化也是在酸性條件（pH4.2-4.5）下進(jìn)行，即液化前后需兩次調(diào)pH，影響產(chǎn)品提取，不利于節(jié)能減排。耐酸耐高溫α-淀粉酶可有效解決這一問(wèn)題，需求量越來(lái)越大，已在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家得到廣泛應(yīng)用，但菌種選育等核心技術(shù)也被國(guó)外跨國(guó)公司所壟斷。我國(guó)缺乏高產(chǎn)菌株，尚不能自主生產(chǎn)。

現(xiàn)階段篩選得到的產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株主要是芽孢桿菌和曲霉［20，21，22］，普遍存在產(chǎn)酶水平較低的問(wèn)題，仍需在自然界篩選高酶活菌株，并進(jìn)一步優(yōu)化耐酸、耐高溫性能。采用基因工程技術(shù)對(duì)功能基因進(jìn)行定向改造，構(gòu)建工程菌，是選育高產(chǎn)、高性能菌株的重要途徑［19］。

4 結(jié)論

從土壤樣品中分離到一株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株SH3，該菌18S ITS序列與紅酵母菌相似性97%。其酶活性最適作用pH5.0，最適作用溫度50℃。最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，對(duì)應(yīng)酶活力96.8 U/mg。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition

Qu Jianhang1Yin Yi1Jiao Guobao2Ding Changhe1Zhang Qian1Qu Lingbo1Liu Zhongmin2
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450000；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Company，Mianchi 472400）

A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory. It was preliminarily identified as yeast. The pH range of crude enzyme reaction was 3. 8-8. 0 with the optimum of 5. 0， and the activity of the enzyme was still available in the temperature of 80℃ with the optimum of 50℃. The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme production was 37℃， pH 5. 0， soluble starch as carbon source， peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume. Orthogonal test showed that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L， peptone of 30 g/L， 37℃ and pH4. 5， under which the enzyme activity was 96.8 U/mg.

acid-stable α-amylase；strain screening；fermentation condition；process optimization；yeast

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028

2014-11-25

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102101），國(guó)家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（31370147），河南省高校青年骨干教師資助計(jì)劃（2013GGJS-077），河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)（15IRTSTHN019）

屈建航，女，博士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：qjh_bata@163.com