王海波鄒竹榮龔明

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，曲靖 655011）

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息學(xué)分析和功能初步驗(yàn)證

王海波1，2鄒竹榮1龔明1

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，曲靖 655011）

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用機(jī)制及其相關(guān)抗冷基因工程的應(yīng)用?？寺×诵⊥┳蛹〈及肴樘擒蘸铣擅讣易宄蓡T3基因（JcGS3）的全長cDNA，序列長1 053 bp，包含完整的開放閱讀框1 008 bp，編碼由335個氨基酸組成的酶蛋白（理論分子量為38 kD、等電點(diǎn)為5.44，含有典型的DxD基序）。對其相應(yīng)基因組序列中啟動子區(qū)域進(jìn)行分析，鑒定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低溫響應(yīng)元件以及ABA應(yīng)答元件等。進(jìn)一步將其在酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)能夠顯著提高其重組酵母菌的低溫抵抗能力。

小桐子；肌醇半乳糖苷合成酶3；cDNA克??；生物信息學(xué)分析；酵母表達(dá)

小桐子（Jatropha curcas L.）屬大戟科麻瘋樹屬能源植物［1，2］，原產(chǎn)美洲，現(xiàn)廣泛分布于全球的熱帶地區(qū)，在中國主要集中在四川、云南、廣西、海南、福建等省區(qū)［3］。小桐子種子油含量高達(dá)40%-60%，流動性好，品質(zhì)優(yōu)良，是理想的柴油替代品［4，5］。同時，小桐子還是干熱河谷地區(qū)保水固土、防止沙化、增加有機(jī)質(zhì)、構(gòu)建防護(hù)林的優(yōu)良樹種［6］，極具開發(fā)與利用價值。

在植物中，棉子糖系列寡糖（Raffinose family oligosaccharides，RFO）是由不同數(shù)量的半乳糖基通過α-1，6-糖苷鍵連接到蔗糖中葡萄糖基的6位羥基上形成的，根據(jù)連接半乳糖基的數(shù)量不同，主要包括：棉子糖（含1個半乳糖基）、水蘇糖（含2個半乳糖基）和毛蕊花糖（含3個半乳糖基）。近年來的研究表明棉子糖系列寡糖的代謝在植物生長發(fā)育、逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，尤其在種子成熟脫水過程中可以維持多種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，更為重要的是寡糖可以促進(jìn)種子細(xì)胞的玻璃化、避免脫水對細(xì)胞的傷害［7］。同時，棉子糖系列寡糖在植物冷馴化中也起到重要作用，很多研究已經(jīng)證實(shí)低溫導(dǎo)致植物葉片和種子中淀粉含量下降，而蔗糖和棉子糖系列寡糖含量升高。棉子糖系列寡糖的積累，特別是位于葉綠體外的寡糖，其通過儲存碳源、滲透調(diào)節(jié)以及為植物提供低溫保護(hù)劑等功能，對于植物抵抗低溫環(huán)境有著重要幫助［8］。在棉子糖系列寡糖合成途徑中，肌醇半乳糖苷（Galaetinol）是目前所知的唯一的半乳糖基供體，肌醇半乳糖苷合成酶（Galaetinol synthase，GS，EC 2.4.l.123）催化肌醇半乳糖苷的合成，被認(rèn)為是棉子糖系列寡糖合成的關(guān)鍵酶，其催化反應(yīng)是寡糖積累的限速步驟。我們先前通過RNA-Seq技術(shù)獲得了小桐子低溫鍛煉下的轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從中篩選到在低溫鍛煉過程中差異表達(dá)變化非常顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因［9，10］。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步克隆其全長cDNA序列，并對其進(jìn)行比較完整的生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)基因酵母的抗冷性功能初步驗(yàn)證，以期為研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理 供試小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，用1.5% CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中吸漲24 h［11］。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水濕潤濾紙的白磁盤中，于相對濕度（RH）75%、26/20℃、16/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中，并于同樣設(shè)置條件下的恒溫培養(yǎng)箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水潤濕培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于相對濕度（RH）75%、12℃、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫鍛煉處理，分別取低溫鍛煉12、24和48 h與對照（正常培養(yǎng)）的第2片真葉，用鋁箔紙包好，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

1.1.2 菌株與主要試劑 大腸桿菌Trans1-T1（DH-5α）、BL21（DE3）及酵母菌INVSc1菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；TransZol Up、DNase I、TransStart Taq DNA Polymerase、氨芐青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、2× Easy Taq PCR SuperMix（+dye）、TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1 Cloning Kit、pEASY-E1 Expression Kit、Trans 2K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BamH I、Xho I限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司；引物合成和測序由深圳華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用TransZol Up試劑提取小桐子12℃低溫鍛煉24 h葉片的總RNA，并利用DNase I消化RNA中的基因組DNA，得到純化的總RNA。以Anchored Oligo（dT）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix合成第一鏈cDNA。

1.2.2 小桐子JcGS3基因全長cDNA的克隆 我們先前獲得了小桐子低溫鍛煉轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從中發(fā)現(xiàn)低溫下差異表達(dá)變化非常顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因（CL2440.Contig2_ JC-CK_1A）［9］。該基因序列長1 463 bp，包含完整ORF編碼框（1 008 bp）。以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物（上游F：5'-TTCTTCTTTCCAAACTCG-3'；下游R：5'-TATAATCCACAACCACAT-3'），并送深圳華大基因公司合成。

以1.2.1反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用熱啟動雙封閉DNA聚合酶TransStart Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50.7℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠回收目的基因條帶（1 053 bp）。將目的基因片段與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂LB抗性平板（LB+Amp+IPTG+X-gal），過夜生長，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑克隆，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為pEASY-T1-JcGS3，送深圳華大基因公司利用pEASY-T1質(zhì)粒上的M13F與M13R通用引物進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 小桐子JcGS3基因的生物信息學(xué)分析 對于小桐子JcGS3基因的推導(dǎo)蛋白，利用在線工具ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)；利用WolfSport在線軟件對蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測；利用SignalP 3.0 Server分析蛋白質(zhì)信號肽序列；利用在線工具TMHMM與Proscale檢測其跨膜結(jié)構(gòu)與親水/疏水特性；利用NCBI CDD工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域與功能元件的鑒定；利用Swiss-Model與Phyre2進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模，利用VMD軟件顯示其三維空間結(jié)構(gòu)，并結(jié)合Ramachandram圖驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。從NCBI下載其它物種的GS氨基酸序列，利用ClustalX進(jìn)行序列相似性比對，然后用MEGA4.0軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用泊松法進(jìn)行檢驗(yàn)。利用Spidey軟件將克隆的JcGS3 cDNA序列與其對應(yīng)基因組序列（小桐子基因組數(shù)據(jù)庫http：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）進(jìn)行比對以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，同時利用在線軟件PlantCARE與PLACE進(jìn)行啟動子順式作用元件的分析。

1.2.4 小桐子JcGS3基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及功能驗(yàn)證 利用BamH I與Xho I雙酶切質(zhì)粒pEASY-T1-JcGS3與酵母表達(dá)載體pYES2，切膠回收J(rèn)cGS3片段與pYES2的酶切大片段，T4 DNA連接酶22℃連接5 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂LB+Amp平板，過夜生長，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證的陽性克隆命名為pYES2-JcGS3。提取重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2-JcGS3，轉(zhuǎn)化釀酒酵母野生型菌株INVSc1，命名為INVSc1-pYES2-JcGS3；同時將對照空載體pYES2質(zhì)粒也轉(zhuǎn)化INVSc1，命名為INVSc1-pYES2；通過酵母菌落PCR驗(yàn)證以確定陽性克隆。

分別挑取重組酵母INVSc1-pYES2-JcGS3及對照INVSc1-pYES2單菌落，接種于15 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)。用YPD培養(yǎng)基調(diào)至OD600=0.4-0.6，取20 mL菌液于8 000 r/min離心1 min，棄上清，用20 mL YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，30℃誘導(dǎo)表達(dá)24-36 h至OD600＞2.0。取誘導(dǎo)表達(dá)菌液2 mL至60 mL YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)菌液OD600=0.2，在正常30℃條件下或18℃低溫條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每3 h間隔取樣，測定樣品的OD600值。以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制酵母菌的生長曲線，比較重組酵母菌與對照酵母菌在正常和低溫條件下的生長差異。

2 結(jié)果

2.1 小桐子JcGS3基因全長cDNA的克隆

以小桐子12℃低溫鍛煉24 h的葉片材料提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，利用JcGS3上下游引物擴(kuò)增JcGS3基因的全長cDNA。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物約1.1 kb，與預(yù)期大小一致（圖1-A）。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并經(jīng)菌落PCR鑒定（圖1-B），陽性克隆命名為pEASY-T1-JcGS3，接菌提取其質(zhì)粒DNA（圖1-C）。

2.2 小桐子JcGS3基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)過測序，克隆的JcGS3基因cDNA序列全長為1 053 bp，已提交至NCBI GenBank（登錄號KJ670151.1）。利用NCBI ORFfinder分析表明其包含完整的開放閱讀框（ORF）1 008 bp，編碼一個由335個氨基酸（aa）組成的蛋白（圖2），其理論分子量推測為38 kD、等電點(diǎn)為5.44。SOPM服務(wù)器分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋109 aa，占32.54%；β-折疊76 aa，占22.69%；β-轉(zhuǎn)角33 aa，占9.85%；無規(guī)則卷曲117 aa，占34.93%。預(yù)測分析該蛋白質(zhì)沒有信號肽、疏水區(qū)域及跨膜區(qū)的存在，說明該蛋白質(zhì)屬于可溶性胞質(zhì)蛋白，這與PSORT預(yù)測該蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中相一致。

利用克隆得到的JcGS3 cDNA序列，對小桐子基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.kazusa.or.jp/jatropha/）進(jìn)行在線Blast檢索，得到其對應(yīng)的基因組序列，發(fā)現(xiàn)JcGS3基因包含4個外顯子與3個內(nèi)含子。同時，也獲取了該基因ORF上游1 000 bp的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE與PLACE對其進(jìn)行了順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)較多，調(diào)控特性也很復(fù)雜（圖3）。具備多個TATA-box，TATA-box是RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn)，保證轉(zhuǎn)錄的精確起始，并調(diào)控上游激活蛋白的作用；同時，其上游還包含多個CAAT-box，CAAT-box主要控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。以上兩個順式作用元件是啟動子、增強(qiáng)子區(qū)域常見的作用元件，小桐子JcGS3基因均具有。另外，還鑒定到植物特有的CRT/DRE冷響應(yīng)元件（CCGAC），以及脫落酸（ABA）應(yīng)答元件，如ABRE（PyCGTGGC）、MYB（PyAACT/GC）和MYC（CANNTG）。除此以外，還鑒定出的元件，包括ASF、CCAAT-box、GATA-box、W-box等順式作用元件。以上充分說明小桐子JcGS3基因是受多重信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

圖1 小桐子JcGS3基因的cDNA克隆

圖2 小桐子JcGS3 cDNA與推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 小桐子JcGS3基因啟動子的順式作用元件

通過與NCBI中不同植物GS氨基酸序列進(jìn)行比對分析（圖4-A）發(fā)現(xiàn)，GS氨基酸序列在N端和C端變化差異較大，而中間部位與C末端（PSAA）的氨基酸殘基則較為保守。小桐子GS3中存在一個DxD基序（DGD，Asp121-Gly122-Asp123位），該基序是此類蛋白質(zhì)的共同基序，也是Ca2+、Mn2+的結(jié)合位點(diǎn)（Asp121、Asp123、His258）。在N端還發(fā)現(xiàn)一個β-α-β超二級結(jié)構(gòu)（圖4中用M標(biāo)識），這也是該類蛋白催化所必須的。進(jìn)一步通過CDD工具進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析（圖4-B）發(fā)現(xiàn)，JcGS3酶蛋白包含RfaJ結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有脂多糖的合成活性及葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，同時還鑒定到GAT結(jié)構(gòu)域。小桐子JcGS3屬于GT8糖基轉(zhuǎn)移酶家族，該家族中除了轉(zhuǎn)移葡萄糖殘基外，還可以轉(zhuǎn)移半乳糖殘基，另外具有糖鏈分支的能力，負(fù)責(zé)形成脂多糖、寡聚糖等。通過CDD比對已經(jīng)測定結(jié)構(gòu)的GS3蛋白，推測小桐子GS3蛋白的催化活性中心由19個氨基酸殘基組成（圖4中用*號標(biāo)注），與文獻(xiàn)報道的一致。

為了進(jìn)一步闡明植物GS的進(jìn)化關(guān)系，通過ClustalW軟件對不同植物GS氨基酸序列進(jìn)行了更廣泛的多重比對分析，并使用MEGA軟件以鄰接法構(gòu)建了其系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。生成的進(jìn)化樹分成兩大主要分支：在分支I中，單子葉植物與雙子葉植物都有；而在分支II中，全部是雙子葉植物，小桐子JcGS3蛋白也歸為II類。部分物種GS家族中的不同成員出現(xiàn)在不同大分支中，如：擬南芥在兩種類型中基本數(shù)量一致，而與小桐子在進(jìn)化上較近的毛果楊，有很大一部分分布于I類型中。這些結(jié)果說明植物GS在進(jìn)化過程中不是平行漸進(jìn)分化的，而是表現(xiàn)出不同程度的跳躍進(jìn)化。

根據(jù)已經(jīng)測定的人類GS蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行小桐子GS3蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源建模，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)不僅在一級氨基酸序列非常保守，而且在空間結(jié)構(gòu)上更加保守：核心7條基本平行的β-折疊構(gòu)成一個保守結(jié)構(gòu)域，周圍則由5段進(jìn)化上不太保守但不可或缺的α-螺旋圍繞形成（圖6-A）。在β-折疊片層的中間凹陷部位被認(rèn)為是該酶的催化中心部位，也是結(jié)合半乳糖與蔗糖的活性中心。

Ramachandran plots 是反映立體化學(xué)質(zhì)量（Stereochemical quality）的參數(shù)。通過分析φ角和ψ角的分布方式對模擬的三維結(jié)構(gòu)是否與自然結(jié)構(gòu)趨勢相同進(jìn)行評估，藍(lán)線區(qū)域是最理想的φ 角和ψ角分布區(qū)域，而藍(lán)線區(qū)域外部則為不合理區(qū)域。如果預(yù)測的蛋白質(zhì)殘基的二面角有90%以上位于藍(lán)線區(qū)域，則表明其有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。圖6-B顯示，構(gòu)建的小桐子GS3 蛋白三維結(jié)構(gòu)的φ角和ψ角有95.8%位于Ramachandran 圖中能量穩(wěn)定區(qū)域，表明該結(jié)構(gòu)是可靠的。

2.3 通過酵母表達(dá)初步驗(yàn)證小桐子JcGS3的功能

將小桐子JcGS3基因通過BamH I與Xho I雙酶切克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2中，獲得其重組酵母表達(dá)載體pYES2-JcGS3（圖7）。隨后將其轉(zhuǎn)化酵母菌INVSc1，利用JcGS3上下游引物進(jìn)行酵母菌落PCR鑒定，結(jié)果（圖8）表明該重組酵母表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化酵母。

通過比較重組酵母菌INVSc1-pYES2-JcGS3與對照酵母菌INVSc1-pYES2的生長曲線（圖9）發(fā)現(xiàn)，在無脅迫條件下，兩者的生長速率基本相似，且?guī)缀醪淮嬖谕诙苯舆M(jìn)入對數(shù)生長期，在27 h時基本進(jìn)入穩(wěn)定平臺期，這表明正常條件下JcGS3基因的表達(dá)對酵母菌生長幾乎沒有影響（圖9-A）。在18℃低溫脅迫條件下，JcGS3重組酵母菌與對照酵母菌剛開始都出現(xiàn)了約3 h的生長停滯期，之后逐漸進(jìn)入對數(shù)生長期；與對照相比，JcGS3重組酵母菌在生長的前6 h生長速率基本相同，之后到進(jìn)入平臺期的24 h內(nèi)，JcGS3重組酵母菌的生長速率明顯快于對照（圖9-B）。另外，JcGS3重組酵母菌在進(jìn)入平臺期后，對照酵母菌雖受低溫脅迫，但仍保持生長的趨勢，進(jìn)入平臺期的時間要稍晚3-6 h。該結(jié)果清楚表明JcGS3基因在酵母中過量表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)酵母菌的低溫抵抗能力，與抗冷性直接相關(guān)。

3 討論

圖4 小桐子JcGS3推導(dǎo)氨基酸序列與其它植物GS的多重序列比對（A）及其CDD預(yù)測（B）

圖5 通過ClustalW序列比對和MEGA4.0鄰接法構(gòu)建的植物GS3進(jìn)化樹

植物在低溫脅迫下，碳素同化總量下降，但可溶性糖增加，這樣可以降低植物細(xì)胞的滲透勢以抵抗逆境［12，13］。此過程不僅在于可溶性糖參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用，更重要的原因可能在于許多可溶性糖是植物適應(yīng)環(huán)境的信號物質(zhì)［14］。淀粉分解與棉子糖系列寡糖合成代謝是諸多可溶性糖積累的樞紐。在擬南芥中，Kaplan等［15］通過代謝動力學(xué)研究表明，低溫脅迫下第一個含量直接增加的碳水化合物是由淀粉經(jīng)β-淀粉酶水解而來的麥芽糖和麥芽三糖，緊接著是6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖，接下來是蔗糖、以及葡萄糖和果糖。另外，肌醇半乳糖、海藻糖、棉子糖以及水蘇糖等低聚糖在之后的滲透調(diào)節(jié)中起更重要的作用［12］。而作為棉子糖系列寡糖合成中半乳糖基供體的肌醇半乳糖苷是此類低聚糖合成的關(guān)鍵底物，催化它生成的肌醇半乳糖苷合成酶（GS）已被認(rèn)為是此代謝途徑的限速關(guān)鍵酶。已報道的GS為分子量在36-38 kD的單體蛋白，活性最適pH為7-8，且活性可進(jìn)一步被DDT（二硫蘇糖醇）和低濃度的MnCl2增強(qiáng)。GS對其底物UDP-半乳糖和肌醇的米氏常數(shù)分別為0.16-1.8 mmol/L和4.0-6.5 mmol/L，對UDP-半乳糖和肌醇具有很強(qiáng)的專一性，而對ADP-Gal、GDP-Gal等糖類或肌醇的差向異構(gòu)體均無作用［16］。

圖6 同源建模得到的小桐子JcGS3蛋白三維空間結(jié)構(gòu)

圖7 pYES2-JcGS3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖8 轉(zhuǎn)pYES2-JcGS3重組酵母INVSc1的菌落PCR驗(yàn)證

肌醇半乳糖苷合成酶屬于多基因家族，已經(jīng)報道在擬南芥［17］、紫花苜蓿［18］、番茄［19］、玉米［20］等植物中克隆到GS基因40多個。目前，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了10個編碼GS的基因，其中有3個基因產(chǎn)物只存在于成熟后的種子中，AtGS1與AtGS2受干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，但對低溫沒有響應(yīng)，而AtGS3只在低溫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)［17］。玉米基因組分析表明它含有3個GS基因，主要在種子成熟組織中表達(dá)［20］。低溫脅迫下，匍匐筋骨草的葉肉細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞中GS1與GS2表達(dá)上調(diào)，很大程度上提高了其抗冷性［21］。Cunningham等［18］從紫花苜蓿（Medicago sativa）宿根中克隆得到一條長度為1 326 bp的GS全長cDNA，編碼325個氨基酸。實(shí)驗(yàn)表明，未經(jīng)低溫處理的紫花苜蓿宿根中沒有GS基因表達(dá)，而將植株轉(zhuǎn)移至低溫環(huán)境則開始轉(zhuǎn)錄，并且在2℃下持續(xù)2 d后達(dá)到最大表達(dá)量，轉(zhuǎn)移至常溫后，轉(zhuǎn)錄量再次減少直至消失。我們最近通過數(shù)字基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因（CL2440.Contig2_JC-CK_1A）在12℃低溫鍛煉12 h后表達(dá)上調(diào)近467.88倍［9］，本研究中該基因JcGS3在酵母中過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)重組酵母菌的低溫抵抗能力，推測該酶能在酵母中催化合成一系列起滲透調(diào)節(jié)作用的低聚糖類物質(zhì)從而提高酵母的抗冷性。這些研究事實(shí)充分表明，GS與植物抗冷性密切相關(guān)。但是，植物GS作為一個大家族，只有部分GS基因的表達(dá)直接參與植物抗冷性形成，很多與之相關(guān)的抗逆性存在交叉性，即不同的GS基因可以被不同的逆境條件所誘導(dǎo)，同一逆境又可以同時誘導(dǎo)多種GS基因的表達(dá)，所以對于小桐子JcGS3基因進(jìn)行交叉抗逆性及差異表達(dá)特性研究進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因小桐子株系是未來的研究方向。

圖9 重組酵母菌INVSc1-pYES2-JcGS3與對照酵母菌INVSc1-pYES2在無脅迫（A）與18℃低溫脅迫（B）條件下的生長曲線

4 結(jié)論

本研究基于我們獲得的小桐子低溫鍛煉下的轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選到低溫下差異表達(dá)變化較顯著的小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3基因JcGS3，并利用RT-PCR技術(shù)成功克隆到該基因。序列分析表明，其包含1 008 bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸，理論分子量為38 kD，等電點(diǎn)為5.44。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，該蛋白質(zhì)沒有信號肽、疏水區(qū)域及跨膜區(qū)的存在，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中；啟動子序列中鑒定到了多個TATA框、CAAT框、CRT/ DRE冷響應(yīng)元件、脫落酸（ABA）應(yīng)答元件；包含GT8糖基轉(zhuǎn)移酶家族的典型RfaJ與GAT結(jié)構(gòu)域。將JcGS3基因構(gòu)建了酵母表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)能夠顯著提高其重組酵母菌的低溫抵抗能力。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Gene Cloning，Bioinformatic Analysis and Preliminary Functional Characterization of Gene Encoding Galactinol Synthase 3 in Jatropha curcas

Wang Haibo1，2Zou Zhurong1Gong Ming1
（1. School of Life Sciences of Yunnan Normal University，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy of Ministry of Education，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Kunming 650500；2. College of Biological Resource and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing 655011）

It was to study the roles of soluble sugars in the cold-tolerance of Jatropha curcas and their related applications in genetic engineering. The full length cDNA of J. curcas， a gene member of such enzyme family（JcGS3）was cloned herein， with a size of 1 053 bp covering the entire open reading frame（ORF）of 1 008 bp. This ORF encoded a polypeptide of 335 amino acids， with theoretical molecular weight of 38 kD， pI value of 5.44， and the typical DxD motif. Further promoter analysis of the genomic sequence of JcGS3 indicated the occurrence of TATA-box， CAAT-box， cold responsive elements of CRT/DRE， and ABA responsive elements. In addition， JcGS3 was characterized with a significant effect on improving the cold-tolerance of the recombinant yeast strain.

Jatropha curcas；galactinol synthase 3；cDNA cloning；bioinformatic analysis；yeast expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.014

2014-11-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260064，31460059，31460179），云南省教育廳科研基金重大專項(xiàng)項(xiàng)目（ZD2010004）

王海波，男，博士研究生，研究方向：植物逆境生物學(xué)；E-mail：bocai0406@163.com

龔明，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物逆境生物學(xué)；E-mail：gongming63@163.com