宋艷敏石麗敏徐瑗聰許文濤，3黃嵐梁志宏

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學信息與電氣工程學院，北京 100083；3.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083）

利用實時定量PCR快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標的方法研究

宋艷敏1石麗敏1徐瑗聰1許文濤1，3黃嵐2梁志宏1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學信息與電氣工程學院，北京 100083；3.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083）

目前冷鮮豬肉新鮮度指標檢測繁瑣，探索快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標新技術成為研究熱點。利用國標法檢測發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，平板培養(yǎng)法和實時定量PCR技術分別檢測腐敗微生物數(shù)量。結果顯示，冷鮮豬肉在4℃條件下，隨儲藏時間延長，微生物的菌落總數(shù)和TVB-N逐漸增加且呈線性相關，與豬肉品的腐敗程度呈正相關；丙酮-氯仿法提取的細菌基因組條帶清晰，提取效果好；基于SYBER GreenⅠ的實時定量PCR技術檢測的菌落數(shù)量與平板培養(yǎng)測得菌落總數(shù)利用單因素方差分析結果沒有顯著性差異（P=0.7190），一致性較好；實時定量PCR方法縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度。微生物是冷鮮豬肉新鮮度評價的重要指標，實時定量PCR可以作為一種快速高效檢測冷鮮豬肉新鮮度指標的新技術。

冷鮮豬肉；實時定量PCR；微生物；TVB-N

冷鮮肉又稱冷卻肉，是指在屠宰、加工和銷售過程中一直處于4℃低溫而不凍結的肉，目前，冷鏈銷售是一種國內(nèi)外廣泛應用的生鮮肉類銷售模式［1］。由于冷鮮肉的貨架期較短，各地儲藏銷售冷鏈系統(tǒng)參差不齊，所以對冷鮮肉的安全檢測和新鮮度評價就不可或缺。

根據(jù)我國對冷鮮肉的衛(wèi)生標準規(guī)定［2］，肉的新鮮度評價主要采用感官標準、微生物和理化標準相結合的方法。但由于其主觀因素較大、耗時耗力、檢測成本較高等缺點，所以專家們在不斷探索快速無損檢測方法［3］。2009年畢松等［4］通過分析細菌菌斑變化與揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）間的關系來檢測肉的新鮮度；2012年王麗等［5］運用近紅外光譜技術快速無損地檢測豬肉的新鮮度；2012年Tian等［6］利用電子鼻分析檢測豬肉的新鮮度，研究中建立主要成分分析（Principal component analysis，PCA）模型并得出結果：當豬肉中的TVB-N ≤ 15 mg/100 g 或細菌總數(shù)≤ 106CFU/g為新鮮肉；當TVB-N≥15 mg/100 g或細菌總數(shù)≥106CFU/g視為腐敗肉。此外，還有電子舌、超生波技術、計算機視覺技術［7］等。微生物是導致冷鮮肉腐敗變質(zhì)的因素之一，主要有腐敗微生物和病原微生物兩種，其中假單胞菌是冷鮮豬肉的主要致腐菌［8，9］。

傳統(tǒng)微生物檢測方法操作繁瑣，測量周期長，在實際應用中有一定局限性；聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、速度快等特點［10］。但是普通PCR只能定性不能定量檢測，而實時定量PCR技術可定量檢測微生物，這種技術不需要瓊脂糖凝膠電泳，不僅縮短了檢測時間，而且簡化了操作步驟，具有較高的應用價值。但實時定量PCR在冷鮮豬肉新鮮度指標檢測方面的研究尚少。本研究通過分析細菌總數(shù)和TVB-N間的關系，旨在探索熒光實時定量PCR法作為一種快速靈敏的檢測手段在冷鮮豬肉細菌總數(shù)的檢測中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料肉 超市冷鮮肉，4℃用PE塑料保鮮膜封好并避光保藏。

1.1.2 主要試劑與設備

1.1.2.1 主要試劑 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas selective agar，PSA），鹽酸，硼酸，甲基紅和次甲基藍指示劑，丙酮，無水乙醇，氯仿，異戊醇，所用試劑均為分析純。

1.1.2.2 主要設備 美國ABI公司的ABI-2720 PCR儀；ABI-7500 熒光定量PCR儀；北京市六一儀器廠的DYCZ-24 D垂直板電泳槽；美國生物基因系統(tǒng)公司的CHEMI- SMART3000 WL/ LC 熒光化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)；北京毅新興業(yè)公司的Midrop100微量分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 肉樣的處理 取豬后臀尖為樣品，將購買的新鮮豬肉直接切割成200 g，隨機分成9份，用PE塑料保鮮膜封住，貼上標簽，在4℃條件下，避光冷藏。每份分為3組，分別在標簽上標記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中Ⅰ組用于TVB-N的測定，Ⅱ組用于平板計數(shù)培養(yǎng)，Ⅲ組用于實時定量PCR檢測。

1.2.2 TVB-N的測定 TVB-N具有揮發(fā)性，在測定時遇到弱堿性溶液即可以游離而被蒸餾出來，蒸餾出來的氨被H3BO3吸收，生成（NH4）2B4O7。使吸收液從酸性變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色，然后用鹽酸標準溶液滴定，使混合指示劑再由綠色變?yōu)樗{綠色即為滴定終點。然后根據(jù)鹽酸標準溶液的消耗量計算TVB-N含量［11］。

1.2.3 微生物指標的檢測 將4℃條件下冷藏的豬肉放置在超凈工作臺中并在酒精燈火焰上將表面灼燒2-3 s，用高壓滅菌的剪刀隨機剪取豬肉50 g左右，放入已使用酒精棉消毒的無菌絞肉機中絞碎2次，無菌稱取25 g轉移到裝有225 mL生理鹽水的滅菌三角瓶中，搖勻，必要時可在漩渦震蕩器上進行震蕩混勻，然后對樣品依次進行10倍梯度稀釋，選取適當?shù)奶荻冗M行細菌培養(yǎng)，每組3個平行。細菌的計數(shù)按照國標進行。

1.2.3.1 菌落總數(shù) 參照 GB4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)》［12］，假單胞桿菌屬需氧型革蘭陰性菌，是腐敗豬肉中的優(yōu)勢菌［9］，另外還有大腸桿菌等需氧菌，所以用平板計數(shù)法培養(yǎng)。但也存在少量的乳酸菌等厭氧菌，培養(yǎng)時易鑲嵌在培養(yǎng)基底層或內(nèi)部，均計入結果。

1.2.3.2 假單胞桿菌 選用假單胞選擇性培養(yǎng)基（PSA）進行平板培養(yǎng)法，并計數(shù)［13］。

1.2.4 DNA提取方法 丙酮-氯仿快速提取法，參照文獻［14］。

1.2.5 實時定量PCR標準曲線的制作

1.2.5.1 提取假單胞菌的DNA 將標準銅綠假單胞菌接種于LB溶液中培養(yǎng)12 h，使其增殖，渾濁可使用提取DNA。提取前將菌液混勻，無菌槍小心吸取1 mL液體于無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，再加入1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。

1.2.5.2 進行實時定量PCR 測定提取DNA濃度，用水稀釋調(diào)整DNA濃度到20 ng/μL，保證CT值在18-30之間，進行10倍梯度稀釋4次，得到10倍梯度的樣液。細菌的16S rRNA 基因具有高度的保守性，不同科、屬、種間的同源性達97%［15，16］。采用細菌通用引物usu對提取的DNA樣品進行PCR 擴增，總細菌引物序列［17］為usu-F：5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3'；usu-R：5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。產(chǎn)物片段長度為370 bp，反應體系為：2.5×SYBR Green Mix 2 11.25 μL，usu-F（10 μmol/L） 和usu-R（10 μmol/L） 各0.3 μL，模板DNA 5.0 μL，超純水 13.15 μL。實時定量PCR反應條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán)。

1.2.5.3 標準曲線制作 以Lg（起始拷貝數(shù)/g）為橫坐標，以CT值為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.6 定量PCR檢測 用丙酮氯仿快速提取法提取豬肉中細菌基因組DNA，-20℃儲藏備用并對肉中提取的DNA進行定量檢測，根據(jù)標準曲線的范圍可以適當調(diào)整模板濃度。將測定的CT值帶入標準曲線中，即可得到對應的DNA的濃度，再計算得出起始拷貝數(shù)（即初始細菌總數(shù)）。同時用國標法測定TVB-N含量，每天測一次，3次平行測定，求平均值。

2 結果

2.1 微生物生長與TVB-N變化之間的關系

圖1顯示，隨著冷鮮肉儲藏時間的延長，TVB-N和菌落總數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢，表明TVB-N和菌落總數(shù)均與豬肉的腐敗程度正相關。根據(jù)圖2菌落總數(shù)與TVB-N之間的線性關系可看出，微生物的菌落總數(shù)與TVB-N線性相關，線性方程式為：y=3.4750x-3.0954，R2=0.9636。

圖1 冷鮮豬肉揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和菌落總數(shù)的變化

圖2 菌落總數(shù)和TVB-N的關系

2.2 豬肉中細菌DNA的提取結果

圖3中顯示，丙酮-氯仿法提取的冷鮮肉中細菌DNA條帶清晰，沒有雜條帶，紫外分光光度計測定的260 nm和280 nm光波下的紫外吸收值為1.754±0.145，提取效果比較好，可以用于后續(xù)實驗。

圖3 冷鮮豬肉DNA提取結果

2.3 實時定量PCR的標準曲線制作

熔解曲線是用來驗證以SYBR Green Ⅰ為熒光染料的定量PCR擴增的特異性，圖4顯示，細菌通用引物usu擴增PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值為87.98℃，峰型銳利，熔解溫度較為均勻。說明本研究所使用的引物擴增產(chǎn)物有較強的特異性。利用已知起始濃度的假單胞桿菌DNA標準品，經(jīng)實時定量PCR反應得到有關CT值與細菌DNA質(zhì)量關系的標準曲線方程。使用dsDNA copy number calculator軟件，將測得的細菌DNA質(zhì)量轉化為Lg（目的基因拷貝數(shù)/g）得到CT值與Lg（起始拷貝數(shù)/g）的標準曲線，曲線方程為 CT=-3.372 Lg（起始拷貝數(shù)/ g）+41.000，R2=0.999。

圖4 標準曲線實時定量PCR檢測結果

2.4 實時定量PCR測定豬肉腐敗過程中DNA含量實驗結果

將冷鮮肉腐敗過程中測得的CT結果記入表1，實時定量PCR得到的熔解曲線和擴增曲線，如圖5所示。

表1 CT值（x-±s，n=3）

圖5與表1結合可以看出，隨著儲藏時間的延長CT呈現(xiàn)減小的趨勢，而根據(jù)標準曲線CT與起始拷貝數(shù)的對數(shù)成負相關，可以判斷細菌DNA起始拷貝數(shù)逐漸增加，并能夠得到細菌DNA起始拷貝數(shù)的具體數(shù)值，由此看出實時定量PCR可以判斷冷鮮肉是趨向腐敗的，同時與TVB-N和平板法檢測的菌落總數(shù)進行比較，結果見表2。

圖5 冷鮮豬肉腐敗過程細菌DNA的定量檢測結果

在TVB-N一致的情況下，運用SPSS軟件對表2中數(shù)據(jù)進行單因素方差分析比較兩者間差異，結果顯示，P=0.7190 ＞＞ 0.05，表明傳統(tǒng)法測得細菌菌落總數(shù)與實時定量PCR方法測得細菌DNA起始拷貝數(shù)（即為初始菌落數(shù)）之間無顯著性差異，并且兩者在數(shù)量級上一致。

表2 TVB-N的量和Log10（細菌菌落總數(shù)）、Log10（目的基因拷貝數(shù)/g濕重）（x-±s，n=3）

3 討論

肉品新鮮度通常用TVB-N含量來評價，TVB-N的產(chǎn)生是指動物性產(chǎn)品的蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)，微生物是導致TVB-N產(chǎn)生的因素之一［18］。微生物的增殖是肉品質(zhì)產(chǎn)生安全問題的本質(zhì)因素，微生物侵染肉品后大量繁殖，消耗分解肉中的蛋白質(zhì)、脂類和糖類等營養(yǎng)成分導致的，會產(chǎn)生不悅風味，品質(zhì)下降并可能產(chǎn)毒，對食用者造成危害。Tang等［19］預測冷鮮豬肉貨架期時發(fā)現(xiàn)，當微生物的數(shù)量達到107CFU/g時的豬肉已經(jīng)變成了腐敗肉。但是傳統(tǒng)微生物指標檢測方法耗時長，操作繁瑣，受環(huán)境因素影響較大。而實時定量PCR作為一種生物檢測技術已應用到魚肉和牛肉的新鮮度檢測方面［20，21］，該方法檢測速度快，靈敏性高且特異性好，成功克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的缺點。豬肉同魚肉和牛肉有很多相似之處，它們水分多、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，都是一種高度易腐的產(chǎn)品。Margot等［22］和Delibato等［23］用實時定量PCR檢測豬肉中沙門氏菌的數(shù)量，結果精確度高，并且可以確定沙門氏菌檢測限量。Ye等［24］利用反轉錄定量PCR檢測冷鮮豬肉中的單增李斯特菌，結果可以粗略地預測豬肉的污染程度。

目前研究中利用實時定量PCR技術僅對牛肉和魚肉等其他肉品的新鮮度進行評價，或只對豬肉中的特定微生物進行定性和定量檢測，并沒有對冷鮮豬肉新鮮度指標進行評價。本研究在已有研究的基礎上進一步拓展了研究范圍，主要以超市的冷鮮豬肉為研究對象，應用實時定量PCR技術檢測冷鮮肉的細菌總數(shù)，既達到了定量的目的又避免了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時的缺點，而且檢測靈敏度高，所以通過實時定量PCR方法代替平板培養(yǎng)法對冷鮮豬肉的新鮮度、微生物指標進行評定是可行的。并且定量PCR技術可應用到未來肉制品及其他方面的檢測中，也可以深入研究確定冷鮮肉新鮮度指標的檢測限量。本研究主要針對冷鮮豬肉展開實驗研究，預實驗中對生產(chǎn)加工單位和超市的冷鮮肉都做了研究，最后考慮到食品安全受眾問題，選擇超市冷鮮肉作為研究材料，在后續(xù)的研究中會將該方法應用到食品生產(chǎn)廠家的安全監(jiān)督檢測中。

4 結論

本研究驗證了微生物菌落總數(shù)與TVB-N呈線性相關性，因此可以根據(jù)細菌菌落總數(shù)的數(shù)量級確定判斷冷鮮肉新鮮度。將用傳統(tǒng)平板計數(shù)法測得的菌落總數(shù)與實時定量PCR方法得到的初始拷貝數(shù)進行對照發(fā)現(xiàn)，在TVB-N相近的條件下，傳統(tǒng)方法測得的細菌菌落總數(shù)與實時定量PCR法測定的初始拷貝數(shù)在數(shù)量級上是一致的。但實時定量PCR檢測時間短，靈敏度高，縮短了實驗周期，降低了實驗成本。

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（責任編輯 馬鑫）

Fast Detection of Freshness of Chilled Pork by Real-time Quantitative PCR

Song Yanmin1Shi Limin1Xu Yuancong1Xu Wentao1，3Huang Lan2Liang Zhihong1
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. College of Information and Electrical Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；3. Beijing Food Quality and Safety Laboratory，Beijing 100083）

The current detection techniques for freshness of chilled pork are complex， so exploring fast detection techniques becomes hotspot. In this study Total Volatile Basic Nitrogen（TVB-N）was detected by the method defined in national standard， and Plate Culture Method（PCM）and real-time quantitative PCR were used to count the total amount of microorganisms causing spoilage of chilled pork. With the extension of storage time of the chilled pork at 4℃， the total number of microorganism colony and TVB-N had the linear correlation， and the level of spoilage of chilled pork behaved the positive correlation. The extracted bacterial genome by acetone-chloroform had the clear bands and showed the fine extraction result. Single-factor analysis of variance revealed that there was no significant difference of total number of colony（P=0. 7190）between by real-time quantitative PCR based on SYBER Green I and by counting in PCM， i. e. ， consistency was quite solid. The detection time was reduced by real-time quantitative PCR with higher detection sensitivity. The amount of microorganisms is a crucial index to evaluate the freshness of chilled pork， and real-time quantitative PCR can be a new technology for quickly checking the freshness of chilled pork.

chilled pork；Real-time quantitative PCR；microorganism；total volatile basic nitrogen（TVB-N）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.013

2014-10-22

國家“863“計劃項目（2007AA10Z212，2012AA101609-7）

宋艷敏，女，碩士，研究方向：食品微生物；E-mail：songyanminyx@sina.com

梁志宏，女，博士，研究方向：食品微生物及生物脫毒；E-mail：lzh01@cau.edu.cn