劉毅 姚粟 李輝 劉洋 劉勇 劉波 程池

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

三種DNA指紋圖譜技術(shù)在菌株分型中的應(yīng)用

劉毅 姚粟 李輝 劉洋 劉勇 劉波 程池

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

旨在通過(guò)ERIC-PCR、BOX-PCR、RAPD等技術(shù)對(duì)4株地芽孢桿菌屬菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，找到一種適合于地芽孢桿菌屬尤其是嗜熱脂肪地芽孢桿菌的菌株分型方法。4株地芽孢桿菌屬菌株呈現(xiàn)出4種不同的指紋圖譜，其中ERIC-PCR的方法獲得的條帶較為清晰，實(shí)驗(yàn)方法較為簡(jiǎn)便快捷，且能相對(duì)較好地區(qū)分不同株系；BOX-PCR的方法得到的條帶相對(duì)較少，不能很好地區(qū)分同一種菌的不同株系；RAPD的方法獲得的條帶相對(duì)較多，區(qū)分性更高，但同時(shí)也增加了一部分工作量和成本。3種菌株分型技術(shù)均能有效的區(qū)分地芽孢桿菌屬菌株，其中ERIC-PCR是一種最有效最便捷區(qū)分嗜熱脂肪地芽孢桿菌不同株系的方法。

菌株分型；ERIC-PCR；BOX-PCR；RAPD；嗜熱脂肪地芽孢桿菌

嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）因所產(chǎn)芽孢無(wú)致病性、無(wú)熱原、無(wú)毒，且對(duì)壓力蒸汽的抵抗力在大多數(shù)微生物中最強(qiáng)，已作為國(guó)際質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株，成為驗(yàn)證濕熱滅菌程序最常用的生物指示劑指標(biāo)菌［1，2］。然而，現(xiàn)在國(guó)際上通用的標(biāo)準(zhǔn)指示菌株為ATCC 7 953株［3］，新發(fā)現(xiàn)的嗜熱脂肪地芽孢桿菌由于專利權(quán)的問(wèn)題，就必須要與其區(qū)分開。由于分子生物學(xué)菌種鑒定應(yīng)用到的16S rDNA基因鑒定、功能基因鑒定、多位點(diǎn)序列分析（MLSA）等技術(shù)并不能精細(xì)到區(qū)分同一菌種的不同菌株，所以，就需要借助DNA指紋圖譜等細(xì)菌菌株分型的方法。

目前用于細(xì)菌菌株分型的技術(shù)主要包括腸桿菌基因間重復(fù)共有序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ERICPCR）、細(xì)菌基因組重復(fù)序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（BOX-PCR）以及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）等，這些技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、方便快捷、區(qū)分度高、結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于革蘭氏陰性細(xì)菌以及芽孢桿菌等菌株分型的研究。ERIC-PCR技術(shù)是1991年Hulton等及Versalovic等發(fā)明的長(zhǎng)引物隨機(jī)PCR技術(shù)（long primer RAPD，LP-RAPD）［4，5］。由于ERIC-PCR引物堿基序列長(zhǎng)、退火溫度高，所以相對(duì)于普通的RAPD技術(shù)，具有圖譜穩(wěn)定、重復(fù)性高、對(duì)底物的序列差異敏感性高以及產(chǎn)生的圖譜多態(tài)性豐富等特點(diǎn)［7，8］。BOX-PCR指紋圖譜分析技術(shù)，是根據(jù)BOX插入因子設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段，補(bǔ)充散布的重復(fù)序列，使不同大小的DNA片段與位于這些片段之間的序列得到擴(kuò)增，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性的一種微生物鑒定方法［9］。與其它指紋圖譜技術(shù)相比較，BOX-PCR的操作更為簡(jiǎn)便快捷，容易獲得較為豐富的擴(kuò)增條帶，且不需要菌株的特異性DNA探針［11，12］。隨機(jī)放大多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是1990年，Williams根據(jù)RFLP法研究分子標(biāo)記時(shí)提出的［15］。RAPD技術(shù)是基于PCR的DNA多態(tài)性分析方法，以非限制性的隨機(jī)寡核苷酸鏈為引物。由于目的基因組序列DNA通常都是很長(zhǎng)的大分子DNA，寡核苷酸引物有足夠的機(jī)會(huì)隨機(jī)與模板DNA同源堿基配對(duì)結(jié)合，延伸擴(kuò)增兩個(gè)緊鄰結(jié)合點(diǎn)間的DNA片段，擴(kuò)增的片段與目的基因組有同源序列［16］。相對(duì)于限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）以及核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（ARDRA）等技術(shù)，RAPD方法更簡(jiǎn)便、快捷，借助泳帶微機(jī)分析，可同時(shí)鑒別大批量的同群下的種內(nèi)標(biāo)本，使之更具有可比性［17，18］。本研究擬通過(guò)ERIC-PCR、BOX-PCR、RAPD等技術(shù)對(duì)4株地芽孢桿菌屬菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，旨在找到一種適合于地芽孢桿菌屬尤其是嗜熱脂肪地芽孢桿菌的菌株分型方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)使用的菌種為 ATCC 7953株、ATCC 12980株、CICC 21091株、CICC 10853株。

其中，ATCC 7953株、ATCC 12980株和CICC 21091株均為嗜熱脂肪地芽孢桿菌，但其芽孢具有不同的耐熱抗性。CICC 10853株是熱噬地芽孢桿菌。菌種分別來(lái)源于ATCC和CICC。

TSB成品培養(yǎng)基，購(gòu)自O(shè)XOID公司；分子生物學(xué)試劑購(gòu)自TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌體富集 將TSA斜面保存的菌種用接種環(huán)接種至TSB液體培養(yǎng)基中，將TSB培養(yǎng)基置于55℃搖床中，220 r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)24 h 。取1.5 mL培養(yǎng)之后的種子液，加入1.5 mL離心管中，用高速離心機(jī)以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，棄上清液收集菌體。

1.2.2 基因組DNA提取 用200 μL無(wú)菌超純水懸浮菌體之后，加入10 μL溶菌酶處理40 min以上。使用CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA，具體步驟如下：加入1.5 mL TE離心洗滌后，用567 μL TE溶解菌體，混勻。加入30 μL 10% SDS和3 μL 20 mg/mL的蛋白酶K（100 μg/mL），混勻，于37℃溫育1h。加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 μL CTAB/NaCl，混勻，65℃溫育10 min。加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）（0.8 mL），混勻，12 000 r/min離心5 min，保留上清。上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）（0.8 mL），混勻，12 000 r/min離心5 min，保留上清。加入0.6倍的異丙醇（0.48 mL），輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)（0.5 h），12 000 r/min離心15 min，收集DNA沉淀，用75%乙醇（1 mL）1 2000 r/min離心5 min洗滌DNA沉淀，真空干燥0.5 h。用50 μL雙蒸水溶解DNA，加入終濃度為20 μg/mL RNaseA，4℃保存。用0.6%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的DNA ，每孔點(diǎn)樣6 μL（4 μL樣品+ 2 μL loading buffer），80 V，電泳1.5 h。

1.2.3 引物與PCR擴(kuò)增體系 3種DNA指紋圖譜的方法均采用通用引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

其中ERIC-PCR使用的PCR體系為：10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL；25 mmol/μL MgCl2溶液2 μL；2.5mmol/L dNTP混合液2 μL；20 pmol/L ERIC1引物0.5 μL；20 pmol/L ERIC2引物0.5 μL；模板DNA 40-80 ng；加水至25 μL。BOX-PCR使用的PCR體系為：10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL；25 mmol/μL MgCl2溶液2 μL；2.5 mmol/L dNTP混合液2 μL；20 pmol/L BoxA1R引物1 μL；模板DNA 40-80 ng；加水至25 μL。RAPD使用的PCR體系為：10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL；25 mmol/μL MgCl2溶液2 μL；2.5 mmol/L dNTP混合液2 μL；20 pmol/L RAPD引物1 μL；模板DNA 25 ng；加水至25 μL。

1.2.4 DNA指紋圖譜PCR程序 ERIC-PCR的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，65℃延伸8 min，30個(gè)循環(huán)；65℃再次延伸16 min。

BOX-PCR的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min；94℃變性1 min，40℃退火1 min，65℃延伸8 min，30個(gè)循環(huán)；65℃再次延伸16 min。

RAPD的PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，30℃退火1 min，72℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸10 min。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 以3 μL緩沖液為負(fù)載，將10 μL PCR擴(kuò)增混合物于2%瓊脂糖凝膠（含0.2%的gold view染料）進(jìn)行電泳（300 V/h），使用1×TAE作為電泳緩沖液。

1.2.6 核酸條帶的觀察 電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察凝膠的核酸條帶，比對(duì)不同泳道的條帶分布，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取的電泳結(jié)果

4株菌的基因組DNA提取結(jié)果（圖1）顯示，所提取的DNA片段均約為23 kb，表明4株菌的基因組DNA提取效果好，且4株菌基因組DNA大小基本一致。

圖1 基因組DNA電泳圖譜

2.2 ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

如圖2所示，ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶明亮清晰，每條泳帶代表一株細(xì)菌的ERIC-PCR指紋圖譜，不同位置的條帶代表該株細(xì)菌基因組DNA被擴(kuò)增出來(lái)的不同片段，條帶的多少代表了不同菌株被該種引物擴(kuò)增出來(lái)的片段多少，條帶的帶型代表了不同菌株之間的相似程度，即兩條泳帶之間越是相似，兩株菌的親緣關(guān)系就越近。結(jié)果（圖2）表明，ATCC 7953株的泳帶與ATCC 12980的泳帶之間，在2 000 bp以上的位置有一個(gè)條帶的明顯差異，因而該種方法可以作為同種不同株菌株的區(qū)分；ATCC 7953株的泳帶與CICC 21091株的泳帶基本一致，無(wú)肉眼可見(jiàn)的差異，推測(cè)兩株菌為同一菌株的傳代；ATCC 7953株與CICC 10853株泳帶差異十分明顯，說(shuō)明兩株菌的進(jìn)化地位差異較大，因而，該種方法應(yīng)用于地芽孢桿菌屬不同種菌株的區(qū)分也是可行的。

圖2 ERIC-PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 BOX-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

如圖3所示，BOX-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶明亮清晰，條帶大都集中在500 bp和1 000 bp附近，因?yàn)闂l帶顯色后的熒光強(qiáng)度比較大，所以在這個(gè)區(qū)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量比較大。由于條帶均比較集中，所以展開效果和區(qū)分度并不高。結(jié)果（圖3）表明，CICC 10853株與其它3株菌的條帶差異明顯，因而，該方法適用于地芽孢桿菌屬不同種之間的區(qū)分，同時(shí)，ATCC 7953株、ATCC 12980株 和CICC 21091株這3株菌的條帶基本一致，所以，該方法在區(qū)分同一菌種的不同株型方面存在一定的局限性。

圖3 BOX-PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.4 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

如圖4所示，RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶均清晰明亮，條帶豐富且分子量范圍較廣。由于該種方法使用了5種不同的短引物來(lái)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，所以條帶更多，因而區(qū)分度就更好。結(jié)果（圖4）表明，CICC 10853株在5種引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中，均與其它3株菌條帶差異較大，因而該方法同樣適用于地芽孢桿菌屬不同種的區(qū)分；在OPA-02引物擴(kuò)增的圖譜中，ATCC 7953株與ATCC 12980株在1 800 bp附近有一個(gè)條帶的明顯差異，在OPA-18引物擴(kuò)增的圖譜中，ATCC 7953株與ATCC 12980株在600 bp附近有一個(gè)條帶的明顯差異，在OPL-16引物擴(kuò)增的圖譜中，ATCC 7953株與ATCC 12980株在750 bp附近有一個(gè)條帶的明顯差異，在OPM-05引物擴(kuò)增的圖譜中，ATCC 7953株與ATCC 12980株在1 000 bp附近有一個(gè)條帶的明顯差異，所以這些引物都可以很好地區(qū)分這兩株菌，但在OPL-07引物擴(kuò)增的圖譜中，ATCC 7953株與ATCC 12980株條帶基本一致，無(wú)肉眼可見(jiàn)差異；同時(shí)，CICC 21091株與ATCC 7953株在5中引物擴(kuò)增圖譜中的條帶基本一致，因而，仍然無(wú)法區(qū)分這兩株菌。

圖4 RAPD產(chǎn)物電泳圖譜

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，ERIC-PCR和RAPD兩種方法均能有效用于地芽孢桿菌屬菌株的分型，兩種方法綜合印證了ATCC 7953株與ATCC 12980株不是同一株菌，而ATCC 7953株與CICC 21091株屬于同一株菌。ERIC-PCR、BOX-PCR和RAPD 3種方法均能有效區(qū)分ATCC 7953株和CICC 10853株這兩株不同種的菌株。

3 討論

ERIC-PCR、BOX-PCR和RAPD 3種DNA指紋圖譜方法均是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的菌株分型方法，具有方便快捷、檢測(cè)限低、區(qū)分度高、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。而地芽孢桿菌屬的菌株均是從溫泉、火山等高溫環(huán)境中生存的菌株，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁非常厚，因而，使用傳統(tǒng)的脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）等方法就會(huì)有一定的局限性。DNA指紋圖譜的方法就能很好的解決這個(gè)問(wèn)題，不但時(shí)間短，而且容易得到較好結(jié)果，在地芽孢桿菌屬菌株的分型中具有重要意義。

通過(guò)3種DNA指紋圖譜方法的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在比較地芽孢桿菌屬菌株不同株系的過(guò)程中，ERIC-PCR的方法獲得的條帶明亮清晰，試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便快捷，且能較好的區(qū)分不同株系，容易得到結(jié)果，是一種有效區(qū)分地芽孢桿菌屬菌株不同株系的方法；BOXPCR的方法得到的條帶相對(duì)較少，不能很好的區(qū)分同一種菌的不同株系，因而不適合于地芽孢桿菌屬菌株的株系分析；RAPD的方法獲得的條帶相對(duì)較多，區(qū)分性更高，但同時(shí)也增加了一部分工作量和成本，即便如此，也沒(méi)有將CICC 21091株和ATCC 7953株這兩株菌區(qū)分開。

地芽孢桿菌屬菌株在壓力蒸汽滅菌的效果監(jiān)測(cè)方面具有十分重要的地位，為了保證該種菌在株水平上的多樣性，同種不同株菌的開發(fā)尤為重要。這就需要借助分子生物學(xué)手段對(duì)不同菌株進(jìn)行區(qū)分，尤其是DNA指紋圖譜技術(shù)，應(yīng)用于地芽孢桿菌屬菌株的分型，效果良好，對(duì)于地芽孢桿菌屬菌株的分型有極為重要的作用。

由于地芽孢桿菌屬菌株命名的歷史比較短，所以，有關(guān)于屬內(nèi)菌種的分子生物學(xué)研究較少，從而DNA指紋圖譜的引物只能使用通用引物或者常用引物，這可能會(huì)影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。在以后的研究中，應(yīng)當(dāng)在對(duì)地芽孢桿菌屬菌種基因組全面了解的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)專用于地芽孢桿菌屬菌株株系分析的引物。

4 結(jié)論

ERIC-PCR、BOX-PCR和RAPD 3種DNA指紋圖譜方法均可以應(yīng)用于地芽孢桿菌屬不同種的區(qū)分；在同一菌種不同株系的區(qū)分方面，通過(guò)3種方法的比較發(fā)現(xiàn)，ERIC-PCR是一種簡(jiǎn)便快捷有效區(qū)分地芽孢桿菌屬菌株不同株系的方法。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Application of 3 DNA Fingerprinting Techniques in Strain Identification

Liu Yi Yao Su Li Hui Liu Yang Liu Yong Liu Bo Cheng Chi
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015）

Four strains of Geobacillus were analyzed with 3 DNA fingerprinting techniques of ERIC-PCR， BOX-PCR and RAPD for searching the proper strain identification measure for the genus especially Geobacillus stearothermophilus. Each of 4 strains of G. stearothermophilus had different fingerprint. The bands by simple and quick ERIC-PCR were quite clear， and the different strains could be recognized clearly. The bands by BOX-PCR were less， and the strains of the same bacteria could not be recognized clearly. More bands could be obtained by RAPD with higher identification；however the workload of identification and cost increased significantly. Three techniques may effectively identify the strains of Geobacillus， and ERIC-PCR is the most effective and fast method to identify strains of G. stearothermophilus.

strain identification；ERIC-PCR；BOX-PCR；RAPD；Geobacillus stearothermophilus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.012

2014-11-20

劉毅，男，碩士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：lewisbeyond@163.com

程池，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品工業(yè)微生物菌種資源管理與鑒定評(píng)估；E-mail：cheng100027@163.com