金琦芳孫威江陳志丹

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，泉州 362400；3.閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福州 350002）

光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成的調(diào)控機(jī)理

金琦芳1，3孫威江1，2，3陳志丹2，3

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，泉州 362400；3.閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福州 350002）

紫色芽葉茶作為特異的茶樹(shù)種質(zhì)資源，具有高花青素、芽葉紫紅的特性，因而受到學(xué)者們的重視。植物的花青素合成途徑及其關(guān)鍵基因的研究成為熱點(diǎn)，目前，從不同物種中已克隆、鑒定了花青素合成和代謝相關(guān)的主要調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因。前人研究表明，花青素合成和代謝與環(huán)境密切相關(guān)，而光照是主要的影響因素，但其調(diào)控機(jī)理尚不明確。通過(guò)綜述光照對(duì)其他紫色植物的花青素的調(diào)控，進(jìn)一步探討了光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成相關(guān)基因的調(diào)控，為研究茶樹(shù)特異種質(zhì)資源和生物技術(shù)育種提供依據(jù)。

紫色芽葉茶；花青素；合成途徑；光照

茶樹(shù)地方有性群體品種中，紫色芽葉占有很大比例。紫芽茶樹(shù)是一種稀有的特色茶樹(shù)資源，芽葉呈現(xiàn)紫色或紅紫色，花青素含量較高［1］。研究表明，花青素的高濃度積累是紅紫色芽葉呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因，不同茶樹(shù)品種芽葉的紅紫色程度不同［2］。中國(guó)代表性品種主要有云南省農(nóng)科院茶葉研究所選育的“紫娟”、浙江省選育的“苔香紫”、福建“大紅袍”、“紅芽佛手”等。據(jù)調(diào)查，在春季普通群體品種中，30%左右的芽葉呈現(xiàn)為微紅紫色或紅紫色，在夏季則有88.7%呈現(xiàn)微紅紫色或紅紫色，茶樹(shù)上的紅紫色芽葉較純綠色芽葉含有較多的茶多酚、兒茶素和黃酮類(lèi)化合物，保健性強(qiáng)的L-EGCG含量亦偏高，尤其是花青素含量較高，它是茶樹(shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因［1］。

花青素的形成和積累與環(huán)境條件密切相關(guān)。光是誘導(dǎo)花青素形成的主要原因，其中以光照和光質(zhì)影響尤為顯著。目前，花青素的合成途徑已經(jīng)基本清楚，從不同物種中克隆、鑒定了很多與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，改變植物花青素積累的研究和應(yīng)用也越來(lái)越廣泛［3］。但目前的研究還不能完全揭示環(huán)境因子及調(diào)控因子對(duì)花青素代謝的影響機(jī)制。本文對(duì)光照通過(guò)激活花青素苷代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)花青素苷的積累進(jìn)行綜述，以期為今后研究光環(huán)境對(duì)紫色芽葉茶紫化機(jī)理提供參考。

1 茶樹(shù)花青素

花青素苷是植物新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的類(lèi)黃酮物質(zhì)，是類(lèi)黃酮途徑的一個(gè)分支途徑，是決定被子植物根、莖、葉、種皮、花和果實(shí)等顏色的重要色素之一?；ㄇ嗨厥且活?lèi)廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于植物次生代謝產(chǎn)生的類(lèi)黃酮化合物。它廣泛存在于27個(gè)科72個(gè)屬的開(kāi)花植物（被子植物）中［4］，其中花青素含量較高的有山楂、葡萄、紫甘薯和松針等，目前研究最多的是紫甘薯和葡萄。花青素的基本機(jī)構(gòu)為3，5，7-羥基-2-苯基苯并吡喃大多數(shù)花青素在花色基元的3-，5-，7-碳位上有取代羥基［5］。由于其結(jié)構(gòu)中R1和R2碳位上的取代基不同，形成了各種各樣的花青素。目前已知有20種花青素，在植物中常見(jiàn)的有6種，即矢車(chē)菊色素（Cy）、錦葵色素（Mv）、飛燕草色素（Dp）、天竺葵色素（Pg）、芍藥花色素（Pn）和牽?；ㄉ兀≒t）［6］?；ㄇ嗨剀赵诩?xì)胞中合成但在液泡中積累，產(chǎn)生的顏色范圍從紅色到紫色［7-9］。其中，矢車(chē)菊色素和芍藥花色素是紫紅色；天竺葵色素是紅色；飛燕草色素、牽牛花色素和錦葵色素是紫色。茶葉中主要含有前3種花青素，另外茶葉中還有花白素及兒茶素聚合形成的原花色素，酸性條件下兩類(lèi)物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)化為花青素［10］?；ㄇ嗨氐淖畲笕觞c(diǎn)是顏色不夠穩(wěn)定，易受光照、金屬離子、酸堿度、氧化還原劑及溫度等因素的影響。劉棟等［11］研究表明，花青素在酸性溶液中，存在著4種花色苷- 醌型堿、黃洋鹽陽(yáng)離子、查耳酮和假堿之間的平衡。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，?；ㄇ嗨鼐哂休^強(qiáng)的護(hù)色能力，是由于?；行У刈璧K這4種化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。當(dāng)花青素中含有一個(gè)或多個(gè)?；鶗r(shí)，?；柚沽嘶ㄇ嗨貜募t色的黃洋鹽水解成無(wú)色的查耳酮或一般使得其轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色的醌酮，因此能保持顏色。液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GST等轉(zhuǎn)運(yùn)因子將合成的花青素苷運(yùn)輸?shù)揭号葜?。最后在?nèi)外因子共同作用下，花青素苷呈現(xiàn)出橙紅、粉紅、紅、藍(lán)色、紫紅和紫等顏色。

2 花青素的生物合成途徑

植物花青素的生物合成途徑已有深入的研究，類(lèi)黃酮物質(zhì)和花青素代謝途徑及相關(guān)酶類(lèi)已經(jīng)較為清楚。苯丙氨酸是類(lèi)黃酮生物合成的直接前體，由苯丙氨酸到花青素的合成被劃分為3個(gè)階段［3］。

第一個(gè)階段由苯丙氨酸到4-香豆酰 CoA，這是許多次生代謝共有的，該步驟受苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）和4-香豆酰CoA連接酶（4CL）活性的調(diào)控［3］。第二個(gè)階段由4-香豆酰CoA和3個(gè)丙二酰CoA 到二羥黃酮醇，是類(lèi)黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng)，受查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）和黃烷酮-3- 羥化酶（F3H）的活性調(diào)控。CHS通過(guò)將3個(gè)丙二酰CoA 的乙酸基加到香豆酰CoA上生成花青素途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物——查爾酮［12］。第三個(gè)階段是各種花青素的合成，受兩個(gè)酶調(diào)控［13］。二羥黃酮醇還原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS/LDOX）將無(wú)色黃酮醇轉(zhuǎn)化為無(wú)色花青素再經(jīng)氧化、脫水形成未修飾的花青素［14］。DFR以NADPH為輔因子，催化二氫黃酮醇在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)，生成無(wú)色花色素，是花青素合成過(guò)程中的重要酶［3］。ANS負(fù)責(zé)催化無(wú)色花青素經(jīng)氧化脫水形成有顏色的花青素。ANS是紫葉茶樹(shù)花青素合成的最后一個(gè)酶，也是將無(wú)色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶。

3 花青素生物合成的調(diào)控因子

目前，對(duì)花青素的次級(jí)代謝合成途徑及其相關(guān)的基因調(diào)控一直都是研究的熱點(diǎn)。已研究較清楚的主要有3類(lèi)調(diào)控因子：bHLH、WD40蛋白和MYB蛋白，大部分物種的花青素都是由這3類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合而成的蛋白復(fù)合體直接調(diào)控激活的，也有少數(shù)花青素合成只需要單個(gè)調(diào)控因子就能激活，如玉米中的鞣紅就能被一種MYBP1激活［15］。

從茶樹(shù)基因組中127 094條單一基因中篩選轉(zhuǎn)錄因子基因，并逐一進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，分別篩選得到73條R2R3-MYB基因，49條bHLH基因和134條WD40基因［16］。在單子葉植物中（如玉米），主要有兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素合成，一種是與MYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；另一種是與bHLH相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［17］。它們相互作用激活調(diào)控整個(gè)花青素合成途徑中的酶，如CHI、CHS、F3H、UFGT、DFR和ANS等。在雙子葉植物中（如擬南芥），花青素生物合成酶分為兩類(lèi)，分別由不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控：（1）早期的生物合成基因，包括 CHI、CHS、F3H、F3’H和FLS，依賴(lài)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子合成類(lèi)黃酮物質(zhì)；（2）晚期的生物合成基因，包括：DFR、ANS、UFGT、ANR，由bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYB蛋白和WD40蛋白組成的三元復(fù)合體調(diào)控［18］。主要產(chǎn)物為種子中的原花青素和植物組織中的花青素。

根據(jù)含有MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可將MYB 轉(zhuǎn)錄因子分為3類(lèi)：含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域的 R3-MYB，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的 R2R3-MYB和含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的R1R2R3 -MYB，花青素相關(guān)的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子通常包含R2和R3 兩個(gè)基序（R2R3-MYB）或包含R3 一個(gè)基序（R3-MYB）［19］?，F(xiàn)已在許多植物中分離鑒定出參與花青素合成調(diào)控的 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥的 TT2、PAP1 和 PAP2、矮牽牛的 AN2、紫蘇的 Myb-p1、金魚(yú)草的 Rosea和玉米的 C1/P1等。在煙草中過(guò)量表達(dá)擬南芥MYB 轉(zhuǎn)錄因子PAP1，轉(zhuǎn)基因植株葉、花、莖和根中大量積累花青素，外觀(guān)表現(xiàn)為深紅甚至紫色［20］。強(qiáng)光誘導(dǎo)后，玉米MYB基因與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)豐度均明顯增加，且MYB基因與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)密切相關(guān)，這是由于MYB轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合的緣故。已克隆的花青素合成調(diào)控相關(guān)的 bHLH 蛋白序列高度保守。在番茄中表達(dá)金魚(yú)草編碼 bHLH、MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)基因 Del 和Rose1，轉(zhuǎn)化株果實(shí)花青素含量明顯提高，顯示不同程度的紫色［21］。目前，已有多種WD40 重復(fù)蛋白基因得到鑒定，如擬南芥的 TTG1、矮牽牛的AN11、紫蘇的 PFWD和玉米的PAC1等。研究表明，在蘋(píng)果中的 WD40 蛋白 MdTTG1 過(guò)表達(dá)時(shí)，可以使花青素生物合成途徑下游的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，從而使花青素積累增加。

4 環(huán)境對(duì)花青素苷積累的調(diào)控機(jī)理

環(huán)境信號(hào)激活花青素苷合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，并促使植物開(kāi)始積累花青素苷［22，23］。迄今為止，對(duì)花青素苷的生物合成途徑已十分清楚，其中催化各步反應(yīng)的酶和編碼這些酶的基因已經(jīng)被鑒定出來(lái)［24-26］。同時(shí)，調(diào)控這些結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)改變植物花色有重要的作用?；ㄇ嗨剀盏暮铣煞e累是外界環(huán)境因子與內(nèi)部基因調(diào)控共同作用的結(jié)果?；蚓幋a的酶決定花青素苷的種類(lèi)。外界環(huán)境因子不僅影響花青素苷合成的速率，而且對(duì)其穩(wěn)定性和積累量也產(chǎn)生作用。環(huán)境因子對(duì)花青素苷合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因都具有調(diào)控作用，最終決定花青素苷的種類(lèi)。花青素苷的呈色易受外界環(huán)境因子的調(diào)控，不同的外界環(huán)境因子下，花色和葉色會(huì)隨之改變。影響花青素苷合成及呈色的外界環(huán)境因子主要包括光、溫度、pH值和糖等。

光照是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一。在綠色組織（如莖、花芽和葉片等）以及組織培養(yǎng)的細(xì)胞中，光通過(guò)激活花青素苷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)花青素苷的積累［27］?；ㄇ嗨剀盏暮铣膳c否及其積累量與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和光受體密切相關(guān)［28］。在花青素苷合成的前期，不同的光強(qiáng)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，強(qiáng)光可以同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，使花青素苷的積累量增加；而弱光或黑暗則抑制或下調(diào)基因的表達(dá)，從而抑制或減少花青素苷的合成，表現(xiàn)出淺色花或白花。光信號(hào)調(diào)控啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的強(qiáng)弱，在一定程度上影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，其表達(dá)量也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。研究表明，花青素苷合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因幾乎都可以受光調(diào)控，在強(qiáng)光下表達(dá)量上調(diào)，在黑暗或弱光條件下不表達(dá)或表達(dá)量下降［29］。

目前在茶樹(shù)上，與花青素合成相關(guān)的基因啟動(dòng)子還未克隆。然而茶樹(shù)上已鑒定了3類(lèi)參與花青素合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB、bHLH和WD40蛋白。這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子中相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)［30］。在其他作物上，啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互關(guān)系，光信號(hào)調(diào)控啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子研究，光照對(duì)花青素生物合成途徑中關(guān)鍵基因的調(diào)控及呈色作用在茶樹(shù)上還未有報(bào)道。

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5 光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成的調(diào)控

光是自然界中影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的最重要的環(huán)境因素之一。在高等植物的光形態(tài)建成過(guò)程中具有極其精細(xì)的光接收（Reception）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）系統(tǒng)。植物對(duì)光的應(yīng)答反應(yīng)主要通過(guò)不同的光受體接收和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)來(lái)完成的。用不同波長(zhǎng)的光照射植物，其發(fā)育對(duì)光譜某些區(qū)域比其他區(qū)域更敏感，特別是植物對(duì)紅光（波長(zhǎng)620-700 nm）、遠(yuǎn)紅光（700-800 nm）、UV-B（280-320 nm）、UV-A（320-380 nm）和藍(lán)光（380-500 nm）特別敏感［31］。

5.1 光受體

不同植物的光受體不同，目前鑒定出的高等植物光受體主要有3類(lèi)：吸收紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素（Phytochrome）；吸收藍(lán)光、UV-A的隱花色素（Cryptochrome）和向光素（Phototropin），以及最新研究發(fā)現(xiàn)的吸收UV-B的受體——UVR8［32］。

5.2 光受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)紫色芽葉茶花青素苷合成的調(diào)控

植物通過(guò)光受體可以感受光的強(qiáng)度和不同波段等，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控自身的光形態(tài)建成、生物節(jié)律以及代謝產(chǎn)物的合成等多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。光照對(duì)花青素苷的合成：光信號(hào)通過(guò)光受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子調(diào)控啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄子結(jié)合的強(qiáng)弱，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，而這些結(jié)構(gòu)基因又與茶樹(shù)葉片呈色有關(guān)。

紅光的光受體——光敏色素接受光信號(hào)后，一方面自身發(fā)生磷酸化，同時(shí)還可使得其他蛋白因子磷酸化，并將此信號(hào)傳遞給下游的信號(hào)傳導(dǎo)組分，最終誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)［33］。對(duì)擬南芥光敏色素A缺失突變體研究中發(fā)現(xiàn)紅光對(duì)CHS的誘導(dǎo)受光敏色素A調(diào)節(jié)，F(xiàn)HY1是光敏色素A信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的成分。兩個(gè)光信號(hào)途徑中的組成成分PIF3和HY5，可以直接結(jié)合到花青素苷合成的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，協(xié)同調(diào)節(jié)花青素苷的合成，而且PIF3對(duì)花青素苷的調(diào)節(jié)作用必須有HY5的參與［34］。

植物通過(guò)特異受體UVR8感受UV-B的刺激，可能是通過(guò)以色氨酸為基礎(chǔ)的機(jī)制進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。UV-B驅(qū)動(dòng)UVR8雙聚體解聚，激活受體，接著與光信號(hào)調(diào)控中心的C0P1互作將信號(hào)傳遞給下游途徑［32］。對(duì)圓葉牽牛整個(gè)開(kāi)花過(guò)程的環(huán)境因子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，UV強(qiáng)度會(huì)影響圓葉牽牛花瓣中的花青素苷含量，上調(diào)花青素苷合成途徑中的基因表達(dá)，且修飾花青素苷轉(zhuǎn)錄水平［37］。

5.3 光照對(duì)紫色芽葉茶花青素苷合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控及其呈色的機(jī)理

查爾酮合成酶是花色素合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶。它廣泛存在于多種植物中，在植物的抗菌機(jī)制、抗脅迫、細(xì)胞的發(fā)育和分化、花色素的積累和外源基因的表達(dá)等起著重要的作用［38］。目前已從多種植物中獲得了CHS基因。Takeuchi等［39］從茶樹(shù)中分離獲得了3種CHS，分別命名為CHS1、CHS2和CHS3，3個(gè)基因全長(zhǎng)分別為1 390 bp、1 405 bp和1 425 bp，均具有編碼389個(gè)氨基酸殘基的ORF，而且推測(cè)的氨基酸序列相似程度高達(dá)93%-96%。目前，在茶樹(shù)上光照對(duì)查爾酮合成酶基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。但在其他作物上已有少量報(bào)道。在金魚(yú)草花瓣中，光誘導(dǎo)bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子同CHS基因啟動(dòng)子區(qū)域中G-box結(jié)合，從而激活CHS基因的表達(dá)。在月季的研究表明，光照是影響月季花變色的關(guān)鍵環(huán)境因素，遮光阻礙了花瓣中花青素的合成，抑制了基因CHS的表達(dá)，導(dǎo)致花冠不著色［40］。CHS受到多種因素的影響，如環(huán)境脅迫、光照、傷害、誘導(dǎo)劑，甚至一些中間產(chǎn)物都能影響它的表達(dá)水平。茶樹(shù)CHS主要在葉片和莖中表達(dá)，在花中也有適度表達(dá)。隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，葉片中的表達(dá)下調(diào)。在葉片上噴施蔗糖，表達(dá)明顯上調(diào)。對(duì)新梢遮蔭處理，表達(dá)降低。在花色基因工程中，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行花色修飾得到了廣泛的研究。通過(guò)反義抑制，已成功在矮牽牛、菊花等幾種觀(guān)賞植物中進(jìn)行了花色修飾［41］。在菊花、月季、香石竹中都采用過(guò)量表達(dá)CHS引起共抑制的方法獲得了粉色或白色的轉(zhuǎn)基因植株［42］。花青素是茶樹(shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因，根據(jù)上述光照對(duì)其他紫色作物花青素合成結(jié)構(gòu)基因中查爾酮合成酶基因表達(dá)的影響，可以推測(cè)強(qiáng)光也能使紫色芽葉茶查爾酮合成酶基因表達(dá)上調(diào)，芽葉呈紫色；遮蔭則使紫色芽葉茶查爾酮合成酶基因不表達(dá)，芽葉不能正常著色。

查爾酮異構(gòu)酶將柚配基查爾酮異構(gòu)化形成二羥基黃烷酮［13］。植物的這一步反應(yīng)也可以在沒(méi)有CHI的條件下緩慢自發(fā)進(jìn)行。CHI基因陸續(xù)在苜蓿、矮牽牛中分離，具有較高的同源性。在茶樹(shù)上已克隆出CHI基因，其序列全長(zhǎng)1 163 bp，其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)723 bp，編碼240個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白分子量約為26.4 kD，pI為5.19［43］。目前，在茶樹(shù)上光照對(duì)查爾酮異構(gòu)酶基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。但在其他作物上已有少量報(bào)道。矮牽牛植株在完全黑暗的條件下放置4 d，CHI基因的表達(dá)喪失。再對(duì)其進(jìn)行光照誘導(dǎo)后，CHI基因再次表達(dá)。山川紫甘薯葉片的CHI基因受到光信號(hào)的誘導(dǎo)，光強(qiáng)越大，基因表達(dá)量越高［44］?；ㄇ嗨厥遣铇?shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因，根據(jù)上述光照對(duì)其他紫色作物花青素合成結(jié)構(gòu)基因中查爾酮異構(gòu)酶基因表達(dá)的影響，可以推測(cè)光強(qiáng)越大紫色芽葉茶查爾酮異構(gòu)酶基因表達(dá)越高，芽葉能正常著色并使顏色加深；遮蔭則使紫色芽葉茶查爾酮合成酶基因表達(dá)喪失，芽葉能正常著色。

黃烷酮3-羥化酶（F3H）是花青素代謝途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化4，5，7-三羥基黃烷酮生成二氫堪非醇［13］。目前已從擬南芥、矮牽牛、金魚(yú)草、苜蓿、葡萄、蘋(píng)果、康乃馨和翠菊等植物中分離出來(lái)。茶樹(shù)也已克隆出F3H的開(kāi)放閱讀框（ORF）包含1 107個(gè)堿基，編碼含有368個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。由于F3H的作用底物是柚皮素，因此F3H調(diào)控著黃酮與花青素的合成，是整個(gè)黃酮類(lèi)化合物代謝途徑的中樞位點(diǎn)［45］。目前，在茶樹(shù)上光照對(duì)黃烷酮 3-羥化酶（F3H）基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。但在其他作物上已有少量報(bào)道。在強(qiáng)光誘導(dǎo)下，擬南芥中的F3H基因表達(dá)量上調(diào)；弱光下，該基因表達(dá)量下調(diào)。此外，強(qiáng)光下擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子MYB（PAP1、PAP2）表達(dá)量上調(diào)。在弱光下，紫蘇的F3H基因表達(dá)量下調(diào)。這些研究都表明，F(xiàn)3H基因受到光照的調(diào)控，且與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。F3'5'H 是合成藍(lán)色的花翠素-3-葡萄糖苷的關(guān)鍵酶。矮牽牛編碼F3'5'H的基因Hf1和Hf2的表達(dá)均能使花色苷生物合成途徑趨向于產(chǎn)生藍(lán)色的花翠素-3-葡萄糖苷，從而使花趨于顯藍(lán)色?；ㄇ嗨厥遣铇?shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因，根據(jù)上述光照對(duì)其他紫色作物花青素合成結(jié)構(gòu)基因中黃烷酮3-羥化酶基因表達(dá)的影響，可以推測(cè)光照強(qiáng)度與紫色芽葉茶黃烷酮3-羥化酶基因表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，芽葉能正常著色并使顏色加深。

二羥基黃酮醇還原酶（DFR）是催化二氫櫟皮黃酮（DHQ）生成無(wú)色花青素，二氫堪非醇（DHK）生成無(wú)色花葵素，二氫楊梅黃酮（DHM）生成無(wú)色花翠素的關(guān)鍵酶［13］。DFR是這一轉(zhuǎn)變中起作用的第一個(gè)酶，失去DFR活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色［13］。茶樹(shù)已克隆出CsDFR的開(kāi)放閱讀框，它編碼含347個(gè)氨基酸的蛋白，推測(cè)分子量38.69 kD，等電點(diǎn)為6.02［46］。

目前，在茶樹(shù)上光照對(duì)二羥基黃酮醇還原酶（DFR）基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。但在其他作物上已有少量報(bào)道。在強(qiáng)光誘導(dǎo)下，擬南芥和野生型矮牽牛的DFR基因的表達(dá)量上調(diào)；相反，弱光下該基因的表達(dá)量下調(diào)［26］。其中，在強(qiáng)光下，擬南芥中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量也同時(shí)上調(diào)。Dong等［47］以蘋(píng)果花為材料，研究了光對(duì)花色形成的影響。結(jié)果表明阻斷光照后，花不能正常著色。這是由于黑暗下花青素苷合成途徑中DFR基因表達(dá)受到抑制。Tanaka 等［48］從玫瑰花瓣中克隆dfr，轉(zhuǎn)入淡粉紅色矮牽牛中，結(jié)果產(chǎn)生了矮牽牛缺乏的橙紅色的花葵素?；ㄇ嗨厥遣铇?shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因，根據(jù)上述光照對(duì)其他紫色作物花青素合成結(jié)構(gòu)基因中二羥基黃酮醇還原酶基因表達(dá)的影響，可以推測(cè)強(qiáng)光使紫色芽葉茶二羥基黃酮醇還原酶基因表達(dá)上調(diào)，芽葉能正常著色并使顏色加深。

類(lèi)黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）和花色素苷合成酶（ANS）是負(fù)責(zé)花青苷生物合成過(guò)程中的最后一個(gè)步驟，在細(xì)胞質(zhì)和液泡中協(xié)同作用使不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花青苷［47］。UFGT將不穩(wěn)定的花色素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色素苷，在花青素的運(yùn)輸和積累中，很大程度上影響植物的顏色表型，可能是花色素苷合成的關(guān)鍵酶。茶樹(shù)上已有人克隆出UFGT全長(zhǎng)。王曉帆以茶樹(shù)葉片為材料，結(jié)合同源克隆方法和RACE技術(shù)，克隆了1條UFGT 基因，命名為 CsUFGT。該基因cDNA全長(zhǎng)為1 526 bp，ORF長(zhǎng)1 380 bp，編碼459個(gè)氨基酸，推測(cè)等電點(diǎn)5.96，推測(cè)分子量為49.486 kD［49］。茶樹(shù)的ANS基因也已被克隆出，該基因的全長(zhǎng)為1 196 bp，編碼354個(gè)氨基酸［48］。目前，在茶樹(shù)上光照對(duì)類(lèi)黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）和花色素苷合成酶（ANS）基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。但在其他作物上已有少量報(bào)道。葡萄在遮光后，UFGT基因表達(dá)量下調(diào)，其轉(zhuǎn)錄因子MYB12、MYBA1和MYB5a表達(dá)量也下調(diào)［26］。李興國(guó)等［50］研究發(fā)現(xiàn)在紅色葡萄中明顯檢測(cè)到UFGT基因的表達(dá)，表現(xiàn)型由白色向紅色的轉(zhuǎn)變，是控制UFGT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因的結(jié)果，所以UFGT基因的表達(dá)在葡萄花青苷合成中具有決定性的作用。Rosati等［51］從美國(guó)金鐘連翹中克隆得到ANS基因和其啟動(dòng)子，并證明在Forsythin的花瓣中無(wú)花色素苷是由于缺少ANS基因的表達(dá)所至?；ㄇ嗨厥遣铇?shù)芽葉呈現(xiàn)紫色表征的主要原因，根據(jù)上述光照對(duì)其紫色他作物花青素合成結(jié)構(gòu)基因中UFGT和ANS基因表達(dá)的影響，可以推測(cè)強(qiáng)光使紫色芽葉茶UFGT和ANS基因表達(dá)上調(diào)，芽葉能正常著色并使顏色加深。

綜上所述，遮蔭使紫色芽葉茶花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)下調(diào)，芽葉不能正常著色；強(qiáng)光使紫色芽葉茶花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)上調(diào)，芽葉能正常著色并使顏色加深。結(jié)合花青素合成途徑，可繪制出強(qiáng)光下紫色芽葉茶花青素合成途徑圖（圖1）。

圖1 強(qiáng)光對(duì)紫色芽葉茶花青素合成相關(guān)基因表達(dá)及呈色影響

6 結(jié)語(yǔ)

迄今為止，光照對(duì)花青素苷合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控及其呈色的機(jī)理已有了進(jìn)一步的了解。葉片是茶樹(shù)接受光信號(hào)的器官，其感受到光信號(hào)以后，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子調(diào)控啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄子結(jié)合的強(qiáng)弱，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，從而激活花青素苷的合成通路，最后液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GST等轉(zhuǎn)運(yùn)因子將合成的花青素苷運(yùn)輸?shù)揭号葜校谷~片呈紫色。

目前在茶樹(shù)中，與花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)的基因（CHS、CHI、F3H、UFGT和ANS基因）都已克隆，其轉(zhuǎn)錄因子（R2R3-MYB、bHLH和WD40蛋白）也已明確。但與花青素合成相關(guān)的基因啟動(dòng)子還未有克隆，啟動(dòng)子研究相對(duì)其他作物較滯后；光照對(duì)紫芽茶樹(shù)花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成相關(guān)基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合強(qiáng)弱的影響及對(duì)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，以及茶樹(shù)葉片呈色的作用還需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Regulation Mechanism of Anthocyanin Synthesis in Purple Shoots of Tea by Lighting

Jin Qifang1，3Sun Weijiang1，2，3Chen Zhidan2，3
（1. College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；2. College of Tea，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，Quanzhou 362400；3. Fujian-Taiwan Joint Center for Ecological Control of Crop Pests，F(xiàn)uzhou 350002）

Purple shoots of tea as a specific tea germplasm with the characteristics of high anthocyanin and purplish red have earned the attentions from scholars. Studies on the biosynthesis pathway of anthocyanin and its key genes in plants have become a hot spot；currently the main regulatory genes and structural genes associated with anthocyanin synthesis and metabolism have been cloned and identified from different species. Previous studies have shown that anthocyanin synthesis and metabolism are closely correlated with the environment， and lighting is the major affecting factor， however its regulation mechanism is uncertain yet. Summarizing the regulation of lighting on anthocyanin in other purple plants， and further exploring the regulation of lighting on the genes related to anthocyanin synthesis in the purple shoots of tea provide the basis for the study of specific tea germplasm and breeding biotechnology.

purple shoots of tea；anthocyanin；synthetic pathway；lighting

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.003

2014-10-31

國(guó)家“863”計(jì)劃（2013AA10260605），紫化芽葉茶樹(shù)種質(zhì)資源的挖掘保存與創(chuàng)新利用（2015N5008）

金琦芳，女，碩士研究生；研究方向：茶樹(shù)特異種質(zhì)資源；E-mail：1293392431@qq.com

孫威江，男，博士，教授、博士生導(dǎo)師，研究方向：茶樹(shù)特異種質(zhì)資源；E-mail：swj8103@126.com