奧文芳，段振華，張雄，李婧怡，胡靜

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

利用金槍魚(yú)頭提取硫酸軟骨素的工藝探討

奧文芳，段振華*，張雄，李婧怡，胡靜

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

以金槍魚(yú)頭為原料，初步探討了硫酸軟骨素的提取工藝，采用稀堿-酶解，超聲輔助提取的方法，考察了堿提取過(guò)程中料液比、堿濃度、超聲時(shí)間、堿提溫度對(duì)提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了工藝優(yōu)化，得出最佳提取工藝為料液比1∶25 g/mL、堿濃度2.25%、超聲時(shí)間40 min、堿提溫度60℃，最大提取率為1.226%。

金槍魚(yú)；硫酸軟骨素；提?。粌?yōu)化

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，簡(jiǎn)稱(chēng)CS）是來(lái)自于動(dòng)物軟骨組織的一類(lèi)重要的酸性黏多糖——糖胺聚糖，是構(gòu)成動(dòng)物軟骨、腱、皮膚等結(jié)合組織的重要組成部分[1-2]。近年來(lái)，隨著對(duì)其研究的深入，發(fā)現(xiàn)CS具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌及降低心肌耗氧量，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈循環(huán)、降血脂、抗凝血和防止血管硬化等作用[3]。同時(shí)，對(duì)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛、心肌缺氧、心肌梗塞等心血管疾病的治療有一定療效[4]。此外，CS還具有保水性、保膠性和高黏性，是許多化妝品和保健品的重要原料[5]。目前，CS的主要來(lái)源是家禽和鯊魚(yú)的軟骨，但由于原料有限或成本較高，使得CS的獲取較難，價(jià)格較高，無(wú)法普及。因此，尋找低成本的、易得的原料成為主流。經(jīng)李川等[6]研究表明羅非魚(yú)頭中能提取出硫酸軟骨素，而關(guān)于金槍魚(yú)頭的研究較多的是氨基酸，礦物質(zhì)及其它生物活性物質(zhì)，對(duì)于硫酸軟骨素這方面的研究鮮有報(bào)道。同時(shí)，世界金槍魚(yú)年產(chǎn)量在350萬(wàn)t～430萬(wàn)t左右，產(chǎn)值達(dá)30億美元，大部分金槍魚(yú)常被用來(lái)制成生魚(yú)片或者加工成罐頭，在加工過(guò)程中產(chǎn)生大量下腳料，如魚(yú)頭、內(nèi)臟、鰓、暗色肉和魚(yú)皮等，約占總重量的50%～70%[7]。

CS的提取方法主要有：濃堿提取、稀堿濃鹽提取、稀堿提取、稀堿—酶解提取法及雙酶法等。利用濃堿工藝提取的產(chǎn)品顏色較深，且廢堿液對(duì)環(huán)境的危害較大；用稀堿工藝提取的方法使得產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量和氮含量較高，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)；利用稀堿濃鹽工藝提取，產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度都不高。其中最常用的是稀堿—酶解提取法，但提取周期較長(zhǎng)。超聲輔助法是利用超聲波的空化作用，使物料周?chē)纬煽昭ǎ瑥亩欣诹蛩彳浌撬靥崛〉姆椒?。蒲志軍等采用超聲波輔助的堿提酶解法提取豬喉骨中的硫酸軟骨素時(shí)發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)的堿提酶解法相比，硫酸軟骨素的提取率和純度并無(wú)明顯提高，但超聲輔助法可大大縮短提取時(shí)間[8]。本實(shí)驗(yàn)以低廉的金槍魚(yú)頭為原料，利用稀堿和酶解相結(jié)合，超聲輔助提取的方法，對(duì)金槍魚(yú)頭的硫酸軟骨素進(jìn)行提取研究，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，為金槍魚(yú)的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚(yú)頭：金槍魚(yú)購(gòu)自?？诋?dāng)?shù)厥袌?chǎng)，其中的魚(yú)肉用于罐頭實(shí)驗(yàn)，魚(yú)頭冷凍備用。

復(fù)合蛋白酶（3.8×105 U/g）：Novo公司；其他試劑：國(guó)產(chǎn)分析純；粒狀活性炭：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器和設(shè)備

KS-300E超聲波清洗機(jī)：寧波科生儀器廠；101-2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SF-200型粉碎機(jī)：泰州市博精制藥機(jī)械有限公司；HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；BS124S電子天平：Sartorius公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；BCD-180冰箱：海信科龍電器股份有限公司。

1.3 主要工藝流程

預(yù)處理→超聲處理→堿提取→沉淀蛋白→抽濾→酶解→吸附→抽濾→測(cè)定

1.3.1 預(yù)處理

將冷凍狀態(tài)金槍魚(yú)頭流水解凍，置于80℃恒溫水浴加熱1 h撈起、洗凈、去除魚(yú)肉等雜質(zhì)，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中65℃干燥4 h，粉碎，得魚(yú)頭骨粉，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲處理

稱(chēng)量1 g魚(yú)骨粉，用5 mL石油醚浸泡5 min，振蕩后靜置，小心傾倒出石油醚；根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求加入NaOH溶液，隨后進(jìn)行超聲波處理。

1.3.3 堿提取

超聲處理完后取出燒杯，分別向燒杯中加入10 mL同一濃度的NaOH溶液，在35℃的水浴鍋中浸提1 h，每15 min攪拌1次。

1.3.4 沉淀蛋白

取出燒杯后，調(diào)節(jié)pH2～3之間，除去酸性蛋白[9]，然后盡快調(diào)整pH7，靜置，抽濾后測(cè)量其體積。

1.3.5 酶解

根據(jù)體積向?yàn)V液中添加2%的復(fù)合蛋白酶，在50℃水浴鍋中水浴2 h[10]，維持pH7.0，酶解完成后，升溫到85℃，滅酶5 min。

1.3.6 吸附

取出冷卻，按2.0%的添加量加入活性炭，在65℃下吸附20 min后，抽濾[11]。

1.3.7 測(cè)定

取一定量的澄清濾液利用分光光度法測(cè)定硫酸軟骨素的含量。

1.4 硫酸軟骨素的測(cè)定

采用硫酸-咔唑法測(cè)定[12-13]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]的方法操作，在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，CS的質(zhì)量濃度C（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，其回歸方程為：A=2.38C-0.002 3，R2=0.998 5，而且質(zhì)量濃度在0.00 g/L～0.30 g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1[11]。

圖1 硫酸軟骨素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chondroitin sulfate

根據(jù)CS標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定樣液的吸光度值即可換算出硫酸軟骨素的含量，進(jìn)而可以得出提取率，其計(jì)算公式如下：

式中：c為CS的質(zhì)量濃度，g/L；n為稀釋倍數(shù)；v為樣液體積，mL；m為原料的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果分析

2.1 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate

從圖2中可以看出，在堿濃度1%、堿提時(shí)間60 min、堿提溫度35℃、超聲時(shí)間30 min時(shí)，以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比分別提取，結(jié)果顯示，在1∶10到1∶20之間，硫酸軟骨素的提取率隨著料液比的增加而增加。其原因?yàn)榻徇^(guò)程中溶質(zhì)由高濃度向低濃度擴(kuò)散，增大料液比可以增大原料與浸提液中硫酸軟骨素的濃度差，有利于硫酸軟骨素的提取。但1∶20后，由于蛋白質(zhì)與粘多糖在堿性水溶液中有很好的溶解性，料液比的增大使得浸提液中的這些雜質(zhì)增多，硫酸軟骨素的含量相對(duì)減少，所以提取率降低。1∶30、1∶40、1∶50基本平衡，增加料液比的意義相對(duì)較小。綜合考慮，選取1∶20的料液比進(jìn)行提取較為經(jīng)濟(jì)。

2.2 堿濃度對(duì)提取率的影響

堿濃度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 堿濃度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of alkali concentration ratio on the extraction rate

由圖3可以看出，在料液比1∶20、堿提時(shí)間60min、堿提溫度35℃、超聲時(shí)間30 min時(shí)，以0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%堿濃度分別提取，結(jié)果表明，在0.50%到2.00%之間，硫酸軟骨素的提取率隨著堿濃度增大而增大。但是，在0.20%后提取率顯然有所降低，這可能是因?yàn)樵诟邼舛葔A條件下，處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下，逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落降解[14]，使產(chǎn)率降低。因此，2.00%的堿濃度時(shí)提取率較高。

2.3 堿提時(shí)間對(duì)提取率的影響

堿提時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 堿提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of alkali extraction time on the extraction rate

從圖4可以看出，在料液比1∶20、堿濃度2.00%、堿提溫度35℃、超聲時(shí)間30 min時(shí)，以30、60、90、120、150 min分別提取，結(jié)果如圖所示。在30到60之間，提取率隨著堿提時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，60 min后提取率明顯降低。這可能是因?yàn)樵现械牡鞍锥嗵前l(fā)生的β-消去反應(yīng)[15]，硫酸軟骨素與蛋白的分離的同時(shí)產(chǎn)生副反應(yīng)，使產(chǎn)率下降。因此，60min的堿提時(shí)間最為合適。

2.4 堿提溫度對(duì)提取率的影響

堿提溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 堿提溫度對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of alkali extraction temperature on the extraction rate

料液比1∶20、堿濃度2.00%、堿提時(shí)間60 min、超聲時(shí)間30 min時(shí)，分別取溫度35、45、55、65、75℃。從圖5可以看出35到45的溫度變化對(duì)提取率的影響甚小，45到55的提取率隨著溫度的升高而增加，這是由于溫度的升高會(huì)使蛋白多糖發(fā)生的β-消去反應(yīng)加快[15]，使產(chǎn)率升高。但當(dāng)溫度超過(guò)55℃后，可能是由于軟骨素和蛋白質(zhì)的分解加快并產(chǎn)生副反應(yīng)，使產(chǎn)率下降。

2.5 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic-assisted treatment time on the extraction rate

從圖6可以看出，超聲時(shí)間在10 min～40 min范圍內(nèi)時(shí)，提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最大值；但時(shí)間超過(guò)40 min后，提取率反而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的作用使大分子的多糖斷裂，從而使后處理過(guò)程中的損失增大而影響硫酸軟骨素的提取率[11]。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上，以CS提取率為指標(biāo)，從中篩選出料液比、堿濃度、超聲時(shí)間、堿提溫度四因素三水平，設(shè)計(jì)L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳堿提取工藝條件，見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2分析可知：料液比、堿濃度、超聲時(shí)間、堿提溫度對(duì)硫酸軟骨素得率都有影響，其中料液比（A）的極差最大，影響最為顯著；堿提溫度（D）極差較大，影響較為顯著；堿濃度（B）極差較小，對(duì)產(chǎn)率的影響較小；超聲時(shí)間（C）的極差最小，影響最小。結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶25，堿濃度為2.25%，超聲時(shí)間為40 min，堿提溫度為60℃，即A3D3B3C2時(shí)硫酸軟骨素的產(chǎn)率達(dá)到最大。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor levels of orthogonal experiment

表2 堿提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment of alkali extraction conditions

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在A3D3B3C2的條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表3。

表3 堿提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of verified experiment of alkali extraction conditions

由表3可知，在A3D3B3C2的條件下3組平行實(shí)驗(yàn)的平均得率為1.226%，與正交實(shí)驗(yàn)中最高提取率A3D3B2C1相比較，A3D3B3C2＞A3D3B2C1，所以該實(shí)驗(yàn)結(jié)論正確。

3 結(jié)論

1）本研究以金槍魚(yú)頭為原料，利用超聲波輔助稀堿—酶解法提取硫酸軟骨素。

2）在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到各因素的關(guān)系為：料液比＞堿提溫度＞堿濃度＞超聲時(shí)間。

3）本研究最佳優(yōu)化工藝為：料液比1∶25、堿濃度2.25%、超聲時(shí)間40 min、堿提溫度60℃，此工藝下硫酸軟骨素的平均提取率為1.226%。

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Study on the Extraction Technology of Chondroitin Sulfate from Tuna Skull

AO Wen-fang，DUAN Zhen-hua*，ZHANG Xiong，LI Jing-yi，HU Jing
（Colloge of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

The articles introduced a method of extraction chondroitin sulfate from tuna skull.The effects of solid-liquid ratio，alkali concentration，ultrasonic-assisted treatment time，extraction temperature on the extraction rate was studied by using dilute alkali-enzymatic hydrolysis and ultrasonic assisted extraction method.On the basis of single-factor tests these parameter of extraction process was optimized by orthogonal experiment.The results showed that the solid-liquid ratio was 1∶25，the alkali concentration was 2.25%，the time of ultrasonic treatment was 40 min and the alkali extraction temperature was 60℃，the extraction percent of chondroitin sulfate could be improved up to 1.226%.

tuna；chondroitin sulfate；extraction；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.009

海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(11-20410-0005)

奧文芳（1991—），女（漢），在讀本科生，研究方向：水產(chǎn)品加工技術(shù)。

*通信作者：段振華（1965—），男，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品食品科技。

2013-12-04