太原化學工業(yè)集團有限公司職工醫(yī)院（030021）王貴英

子宮內膜異位癥是子宮內膜出現在機體子宮腔以外的其他部位的一種疾病，高發(fā)于25～45歲女性，發(fā)病率約占育齡期婦女的10%～15%[1]。子宮內膜異位癥的臨床表現多種多樣，主要癥狀為繼發(fā)性痛經，并隨疾病的進展而漸進性加重，嚴重影響婦女的身心健康。目前，臨床上采用藥物和手術兩種方法治療子宮內膜異位癥。但迄今為止，除了切除子宮根治手術外，還沒有一種理想治療子宮內膜異位癥的方法，無論是藥物治療還是保守性手術均有高達50%以上的復發(fā)率。因此，尋找治療子宮內膜異位癥安全、有效的方法是目前子宮內膜異位癥研究的重點。

子宮內膜異位癥的發(fā)病機制至今仍未完全闡明。自從1860年Von Rokitansky首次對子宮內膜異位癥進行闡述后，眾多關于子宮內膜異位癥發(fā)病機制學說紛紛出現。1925年Sampson發(fā)表經血逆流學說[2]，提出脫落的子宮內膜碎片隨經血逆流至腹腔后，發(fā)生種植，并在局部生長。問題是經血逆流是育齡期婦女一種常見生理現象，但是僅有約10%～15%的婦女患子宮內膜異位癥。有學者表明[3]，內膜發(fā)生種植與生長要完成粘附、侵襲和血管形成三個步驟。由此可見，子宮內膜種植只是發(fā)病的原因之一，尚有其他發(fā)病機制在發(fā)病過程起作用。近年來，炎性反應在子宮內膜異位癥發(fā)病機制中的作用成為眾多學者的研究熱點。RANTES是一種由正常T細胞表達和分泌的趨化因子，參與了大量的炎性反應過程。有研究報道，RANTES與內異癥有著密切的關系，因此對RANTES的干預可能成為治療子宮內膜異位癥的新想法。PDTC是一種NF-ΚB抑制劑，它可以抑制炎性反應中的信號傳導樞紐—NF-ΚB通路的表達，從而抑制子宮內膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展。本文將通過研究RANTES在大鼠子宮內膜異位癥模型中的發(fā)達，及PDTC對其產生的作用，探討RANTES在子宮內膜異位癥發(fā)生發(fā)展中起到的作用。

附表1 干預前兩組異位灶體積

附表2 干預4周、8周后兩組內膜異位灶體積

附表3 干預后兩組大鼠血清中RANTES濃度的比較

附圖1 大鼠動情期顯微鏡成像

附圖2 手術自體移植法造模過程

附圖3 造模成功標準

1 動物模型的構建

1.1 實驗動物 選取健康雌性SD大鼠50只，周齡8～10周，體重200～250g。給予標準光照周期，按需添加標準飼料和水，定期更換墊料保持鼠籠清潔干燥。室內溫度保持20℃，濕度40%～50%。

1.2 SD大鼠動情期的確定 用無菌棉簽插入大鼠陰道內，旋轉棉拭子3～4圈，取出進行涂片，利用光學顯微鏡觀察分泌物的細胞形態(tài)。大鼠動情期時可見大量無核角化細胞和少量上皮細胞。選擇監(jiān)測有連續(xù)3個動情期的大鼠進行造模。（見附圖1）

1.3 大鼠內異癥模型建立 給予大鼠1 0%的水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉。麻妥后，將大鼠固定于動物實驗臺上。于尿道口上方1cm處打開腹腔。進入腹腔后，充分暴露子宮，取右側子宮近端離右側子宮角1cm處結扎，遠端離卵巢1cm處結扎。剪下中間段子宮后，行子宮段斷吻合術。分離離斷的子宮內膜及肌層。將其修剪成一塊約3mm×3mm大小的子宮內膜組織，將內膜面朝向腹腔，并固定在切口左側腹壁處，以無損傷棉線固定。每只大鼠注射25萬單位青霉素鈉。查無出血后，用絲線分層縫合腹部切口。大鼠分籠安放，待其自然蘇醒，常規(guī)喂養(yǎng)。術后連續(xù)3天給予肌肉注射青霉素鈉，25萬單位/只。保持鼠籠干燥清潔。（見附圖2）

1.4 造模成功標準 肉眼可見移植物體積增大，呈小泡狀的透明結節(jié)或囊腫，囊內可見黃色或透亮漿液，移植物有新生血管生成，被結締組織覆蓋。切取移植物送病檢。病理診斷證實為子宮內膜異位癥即造模成功。（見附圖3）

2 實驗方法

2.1 實驗對象分組 將造模成功的40只大鼠采用隨機分組的方法分為兩組，分別為：對照組和PDTC組。計算內異灶體積=0.52×長×寬×高[4]（見附表1）。各組內異灶體積比較P＞0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。測量后給予對照組常規(guī)飼養(yǎng)。PDTC組給予PDTC100mg/kg/d，持續(xù)8周。

2.2 取材 應用酒精棉球擦拭鼠尾。用5號頭皮針穿刺大鼠尾部，抽出注射器活塞，制造負壓進行取血。取血結束后，應用脫脂棉球按壓針眼部位30s，確定止血后放開大鼠[5]。切取大鼠異位病灶阻滯，用生理鹽水清洗，放入液氮保存。

2.3 ELISA方法測定血清中RANTES含量 所取大鼠尾靜脈血置于無菌采血管中，放置1～2 小時后離心(1000 轉/分鐘)10min，吸取血清置于-2 0 ℃冰箱保存。選用RANTES ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進行血清RANTES的測定。所有OD 值減除空白值后，根據標準品之OD 值在半對數紙上畫出標準曲線，再根據樣品的OD 值通過標準曲線計算出相應RANTES含量。

2.4 R T-P C R 方法測定大鼠異位灶中RANTES的含量

2.4.1 RNA引物的設計 根據GenBank NCBI發(fā)表的RANTES全長cDNA序列，采用Primer premier5.0軟件設計大鼠RANTES引物。RANTES上游引物為：5′-CCATATGGCTCGGACACCA-3′，下游引物為5′-GCTCATCTCCAAATAGTTG-3'，擴增產物長度為2 2 1 b p。內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的上游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，擴增產物長度為480bp。

2.4.2 實驗步驟 取出標本，稱重后加入1mlRNAiso Plus裂解細胞，充分裂解后轉移至EP管，室溫靜置。5min后加入200μl三氯甲烷，充分震蕩后室溫靜置。5min后在12000rpm，4℃條件下離心15min。吸取上清液轉移至EP管，加入等體積異丙醇搖勻，室溫靜置10min，再次離心5min。吸取上層乙醇，注意不要觸及RNA。干燥后加入DEPC水溶解RNA。

2.4.3 提取RNA純度測定 取1μl以上步驟提取的RNA，加入99μlTBE，用分光光度計測OD260和OD280數值。提取RNA純度= OD260/OD280。純度在1.7～2.0表示轉錄要求。

2.4.4 PCR擴增 將提取RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增。PCR擴增方案為：逆轉錄cDNA，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Dntp Mixture，2.0μl；TaKaRa Taq，0.25μl；上游引物，1.0μl；下游引物，1.0μl。用去離子水定容至25μl。

2.4.5 PCR產物電泳 取0.7g 2%瓊脂糖凝膠，放入燒杯中，加入35ml 0.5×TBE緩沖液。在微波爐中加熱至瓊脂糖融化后取出，搖勻冷卻，60℃時緩慢導入放有梳子的玻璃槽，注意不要有氣泡的出現。靜置30min后取出梳子。將凝好的瓊脂凝膠放入電泳槽，加入0.5×TBS緩沖液直至沒過凝膠表面。加入樣品與DNA Marker，進行電泳。結束后，在EB溶液中染色，用紫外燈顯像、拍攝。用光密度與GAPDH的作為半定量標準。

3 統(tǒng)計學方法實驗結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數據，數據均以均數±標準差的形式表示，多個獨立樣本兩兩均數之間的比較采用SNK-Q檢驗，P＜0.05，表明差異具有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 內異灶體積的變化 隨著時間的延長，對照組內異灶體積逐漸增大，PDTC組內異灶體積逐漸縮小，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PDTC組第4周、第8周的內異灶體積均明顯小于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）見附表2。

4.2 用ELISA 法檢測治療后各組大鼠血清中RANTES的含量 對照組第8周血清RANTES含量明顯高于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PDTC組第8周血清RANTES含量明顯低于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PDTC組第4 周、第8周大鼠血清中RANTES的水平均明顯低于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（見附表3）

4.3 R T-P C R 方法測定大鼠異位灶中RANTES的含量 對照組第8周內異灶RANTES含量明顯高于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PDTC組第8周內異灶RANTES含量明顯低于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。P D T C 組第4 周、第8 周大鼠內異灶中RANTES的水平均明顯低于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（見附圖4）

5 討論

子宮內膜異位癥是一種婦科常見疾病，其獨有的痛經、慢性盆腔痛以及導致的不孕，嚴重影響育齡期婦女的健康和生活質量。RANTES（regulated upon activation normal T expression and secretion）, 是一種由正常T細胞表達和分泌的趨化因子，1996年Oral等指出RANTES參與子宮內膜異位癥的炎癥反應[6]。本研究發(fā)現，大鼠的血清、內異灶中RANTES的含量明顯增高。由此我們推斷RANTES參與了子宮內膜異位癥發(fā)生發(fā)展的病理過程。另外還發(fā)現，如果無藥物的干預，血清和內異灶中RANTES濃度逐漸增加，預示著RANTES可能是反應該疾病嚴重程度的指標之一。因此，RANTES的測定很可能成為臨床上子宮內膜異位癥治療、評估的一個新方向。

附圖4 RT-PCR對異位灶中RANTES的測量結果

核因子ΚB(nuclear factor kappa—B，NF-ΚB)是一種多種細胞的核轉錄因子，其作為信號傳導途徑中的樞紐，參與了眾多炎性反應過程。其中RANTES趨化因子既是NF-ΚB傳導通路中的一員。本研究中發(fā)現，NF-ΚB抑制劑PDTC可以抑制大鼠內異癥模型血清和內異灶中RANTES的含量。說明PDTC治療大鼠內異灶模型有效，并且成功的干預了RANTES的表達分泌。

綜上所述，RANTES參與了大鼠子宮內膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展。NF-ΚB抑制劑PDTC可以抑制子宮內膜異位灶的生長及血清、內異灶RANTES的分泌。具有可觀的臨床應用前景。