何念武，高一明

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

商南泉茗茶多糖的體外抗腫瘤活性

何念武，高一明

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000）

為了研究商南泉茗茶多糖體外抑瘤作用，采用MTT法檢測(cè)其作用于結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞系后的細(xì)胞存活率、LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，商南泉茗茶多糖對(duì)結(jié)腸癌、肺腺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞系均有不同程度的生長抑制作用，其中對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，結(jié)腸癌次之，肺癌最弱。進(jìn)一步研究表明，商南泉茗茶多糖能夠使MCF-7細(xì)胞的生長周期阻滯于G0/G1期，并且有明顯的誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用。商洛綠茶茶多糖具有明顯的體外抗腫瘤活性。

商南泉茗茶；茶多糖；抗腫瘤；細(xì)胞凋亡

商洛位于陜西東南部，秦嶺南麓，是陜西三大茶葉主產(chǎn)區(qū)之一，因位于秦嶺山脈的莽嶺、新開嶺和鄖西大梁山交匯處，屬北亞熱帶季風(fēng)型半濕潤氣候類型，其獨(dú)特的地理位置造就了商洛綠茶色香、味濃、耐沖泡，高雅而略有華麗之感。長期以來，有關(guān)綠茶的研究主要集中在茶多酚上，茶多糖的研究則處于發(fā)展階段，尤其是對(duì)于一些生境條件特殊、微量元素含量豐富的茶葉，對(duì)其生物活性或營養(yǎng)價(jià)值卻少有人問津［1］?，F(xiàn)有研究表明，茶多糖具有降血糖、降血脂以及免疫調(diào)節(jié)的功效［2］。倪德江［3］和丁仁鳳［4］等通過研究證實(shí)茶多糖確實(shí)有抗氧化、降血糖的作用，但是其選取的均為常規(guī)綠茶、烏龍茶或者紅茶。何念武等［1，5］就紫陽富硒茶活性成分的體外活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，證實(shí)紫陽富硒茶的營養(yǎng)價(jià)值確實(shí)較好。但對(duì)商洛茶葉的生物活性和營養(yǎng)價(jià)值的研究幾乎沒有。為此，本研究在前期分析測(cè)定了商洛綠茶中微量元素含量［6］以及商洛綠茶多糖制備工藝優(yōu)化［7］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)商南泉茗茶多糖的體外抗腫瘤作用進(jìn)行深入研究，以期為商洛茶葉，尤其是商南泉茗茶的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

商南泉茗茶，購于商南縣茶葉聯(lián)營公司。

1.2 方法

1.2.1 商南泉茗茶多糖的制備

參照何念武［7］的方法，采用水提醇沉法制備樣品多糖并進(jìn)一步以苯酚硫酸法測(cè)總糖含量［8］。1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1）MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取生命力旺盛的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的細(xì)胞培養(yǎng)液制成2×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，按照每孔150 μL的量接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在37℃的溫度下，5%CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Midi40，美國Thermo公司）中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，重新加入150 μL的培養(yǎng)液和10 μL不同濃度的樣品多糖溶液（0，50，100，150，200 μg·mL-1），陰性對(duì)照為生理鹽水和細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育48 h后，每孔加入15 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，濃度為5 mg·mL-1），37℃繼續(xù)孵育4 h后加入二甲亞砜終止反應(yīng)，在酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：深圳雷杜RT6000）490 nm處測(cè)定OD值，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。按公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率［5，9-11］：

2）細(xì)胞毒性分析

采用乳酸脫氫酶（LDH）法分析商南泉茗茶多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。前期細(xì)胞培養(yǎng)及后期多糖樣品處理與MTT法一致，不同之處在于繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，直接離心、取上清，按LDH試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）說明書操作進(jìn)行，在酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜RT6000）450 nm處測(cè)定OD值，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。按公式（2）計(jì)算細(xì)胞上清液中LDH活性。

3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的細(xì)胞培養(yǎng)液制成2×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，按照每孔1 mL的量接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后，分別加入0，50，100，200 μg·mL-1的商南泉茗茶多糖樣品溶液，繼續(xù)孵育48 h后，用0.25%胰酶消化液進(jìn)行消化，離心，收集細(xì)胞，在4℃冰箱以70%乙醇固定12 h以上。固定后的細(xì)胞用PBS洗兩遍并制成細(xì)胞懸液，加入PI染液（最終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1），37℃避光溫育30 min，300目尼龍網(wǎng)濾過，流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）上計(jì)數(shù)20 000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞各期DNA水平，分析細(xì)胞周期分布［5，11］。

4）流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理同周期分布檢測(cè)，區(qū)別在于培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，然后加入相關(guān)凋亡檢測(cè)試劑。按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（購于上海貝博生物科技有限公司）說明進(jìn)行操作，隨后再流式細(xì)胞儀（GUAVAeasyCyteTM8HT，美國密理博公司）上計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率［5，11］。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用M±SD，結(jié)果用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 商南泉茗茶多糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響

從圖1中可以看出，商南泉茗茶多糖作用于不同腫瘤細(xì)胞系之后，伴隨著茶多糖質(zhì)量濃度的不斷增加，細(xì)胞存活率明顯下降，呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)樣品多糖濃度在200 μg·mL-1時(shí)，結(jié)腸癌（LoVo）細(xì)胞存活率48.71%，肺癌（A549）存活率為51.37%，乳腺癌（MCF-7）存活率為38.71%。三種細(xì)胞中A549存活率最高，LoVo存活率次之，MCF-7存活率最低，結(jié)果表明，商南泉茗茶多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)。

此外，通過對(duì)水提醇沉法制備的茶多糖總糖含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其多糖含量能夠達(dá)到68.7%，足以說明主要是茶多糖在發(fā)揮抑瘤作用。

圖1 商南泉茗茶多糖對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的存活率

2.2 商南泉茗茶多糖對(duì)不同細(xì)胞LDH釋放量的影響

乳酸脫氫酶（LDH）是一種穩(wěn)定的糖酵解蛋白質(zhì)酶，存在于生命有機(jī)體所有組織、細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受到外界刺激并受到損傷，LDH即被釋放到細(xì)胞外，LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽和四唑鹽類反應(yīng)形成紫色的結(jié)晶物質(zhì)，可在酶標(biāo)儀450 nm處進(jìn)行檢測(cè)。從而通過檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的活力，可以間接的判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷程度［10］。

從圖2中可以看出，當(dāng)樣品濃度從0增加到200 μg·mL-1時(shí)，各細(xì)胞系的乳酸脫氫酶釋放量均有不同程度的增加，說明商南泉茗茶多糖能促使腫瘤細(xì)胞釋放出更多的LDH，從而間接發(fā)揮細(xì)胞毒作用。在樣品多糖濃度為200 μg·mL-1時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞LDH釋放量為708.75 U·L-1、肺癌細(xì)胞釋放量為969.17 U·L-1、乳腺癌釋放量為931.67 U·L-1，三種細(xì)胞中A549的釋放量最高，MCF-7次之，LoVo最弱。

圖2 商南泉茗茶多糖作用于不同細(xì)胞系的LDH活性

綜合MTT和LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究繼續(xù)對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行深入的抗腫瘤機(jī)制探究。

2.3 商南泉茗茶多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響

由圖3中可以看出，不同劑量的茶多糖樣品作用于MCF-7細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞DNA含量明顯增高，G2/M期DNA含量不斷減少，而S期DNA含量變化不大，說明樣品多糖作用于MCF-7細(xì)胞之后使其生長周期阻滯于G0/G1期。

圖3 商南泉茗茶多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響

2.4 商南泉茗茶多糖誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡情況

2.4.1 多糖樣品誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡結(jié)果

由圖4可以看出，不同質(zhì)量濃度的商南泉茗茶多糖作用于MCF-7細(xì)胞之后，都產(chǎn)生了一定的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，包括空白對(duì)照也有近1.4%的凋亡率（圖4A），這可能是在細(xì)胞處理過程中產(chǎn)生的少許細(xì)胞碎片，或者是后期數(shù)據(jù)處理有所欠缺所致。如圖4D所示，在200 μg·mL-1時(shí)，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞早期凋亡率為56.62%，晚期凋亡率為12.36%。由此可見，早期凋亡率最高，結(jié)果表明商洛綠茶有較明顯的促凋亡作用。

2.4.2 茶多糖樣品誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡率

從圖5中可以看出，隨著樣品多糖質(zhì)量濃度的增加其誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡率呈快速增長的態(tài)勢(shì)。樣品誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率依次為1.4%，14.1%，31.0%，68.9%。在200 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞早期凋亡率達(dá)到56.62%，晚期凋亡率為12.36%，表明在200 μg·mL-1時(shí)樣品誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡率非常明顯，與對(duì)照相比，差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 茶多糖誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用

3 結(jié)論與討論

商南泉茗茶多糖具有明顯的體外抗腫瘤活性。在體外細(xì)胞模型上對(duì)LoVo、A549、MCF-7等均有不同程度的增殖抑制作用。同時(shí)，又具有較好的誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用。

圖5 不同濃度茶多糖誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡率

現(xiàn)代研究表明，茶多糖是茶葉中治療糖尿病的主要藥理成分，一般由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、核糖、半乳糖等單糖組成，本文主要是驗(yàn)證商南泉茗茶多糖的細(xì)胞增殖抑制作用，故對(duì)其單糖組成還需進(jìn)行研究。一般而言，粗老茶多糖含量較高，等級(jí)低的茶葉中茶多糖含量高。在治療糖尿病方面，粗老茶比嫩茶效果要好［1］。因而，在材料選擇的時(shí)候宜選取粗老茶葉。

此外，研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)每天都會(huì)有一些細(xì)胞死亡，又有一些新的細(xì)胞產(chǎn)生，從而維持整個(gè)機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。對(duì)于這些細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，有些是病理性的，有些則是生理性的，因而這也成為生物醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)問題。目前，關(guān)于細(xì)胞死亡的方式學(xué)界普遍認(rèn)為主要是壞死和凋亡，前者發(fā)現(xiàn)較早，后者則是近些年來才被發(fā)現(xiàn)的。不管是細(xì)胞凋亡，還是細(xì)胞壞死，其最終結(jié)果都非常相似，但它們的死亡過程和現(xiàn)象卻有著極大的差別［1，5］。茶多糖是茶葉中的主要活性成分，對(duì)于其抗腫瘤活性研究也尤為重要。本文就商南泉茗茶多糖體外抗腫瘤活性進(jìn)行了較為深入的探討，研究表明，在體外細(xì)胞模型上對(duì)LoVo、A549、MCF-7等均有不同程度的增殖抑制作用。同時(shí)，又具有較好的誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用。

茶多糖是從茶葉中提取分離出來的一種蛋白多糖復(fù)合物，具有顯著的生物活性，有防癌和降血脂，清熱解毒，消腫止痛，活血通絡(luò)的功效［12］，既可用于醫(yī)藥工業(yè)，也可用于食品行業(yè)，是一種很好的功能性飲料。因此，針對(duì)茶多糖功能飲品的開發(fā)利用具有廣闊的前景，尤其是那些生境條件特殊的茶葉，對(duì)進(jìn)一步研究開發(fā)以其為原料的功能性飲品或保健藥物，提供一定理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：李堆淑）

In Vitro Antitumor Activity of Tea Polysaccharide in Shangnan Quanming

HE Nian-wu，GAO Yi-ming
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering，Shangluo University，Shangluo726000，Shaanxi）

In order to research on the antitumor activity of Shangnan Quanming tea polysaccharide in vitro. MTT method is chosen to detect survival rate，lactate dehydrogenase detection cell（LDH）method was used to detect cell toxicity，flow cytometry（FCM）analysis of the cell cycle，cell apoptosis was detected by FCM method in Shangnan Quanming tea polysaccharide in vitro anti-colon cancer（LoVo），lung cancer（A549），breast cancer（MCF-7）.The results show that，Shangnan Quanming tea polysaccharide on LoVo，A549，MCF-7 growth inhibition were added，which the strongest inhibitory effect on breast cancer，colon cancer times，lung cancer.Through further study found，tea polysaccharide can cause cell cycle arrest in breast cancer cells in G0/G1phase，and there were obvious apoptosis.Shangnan Quanming tea polysaccharide has significant in vitro antitumor activity.

Shangnan Quanming tea；tea polysaccharide；antitumor；apoptosis

TQ914.1

A

1674-0033（2015）04-0051-05

10.13440/j.slxy.1674-0033.2015.04.014

2015-05-20

商洛學(xué)院科研基金項(xiàng)目（13SKY-FWDF007）

何念武，男，陜西洛南人，碩士，講師