裴徐梨荊贊革唐征王巖王鎮(zhèn)陳忠文羅天寬張小玲

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

青花菜花粉發(fā)育基因MF21的克隆及表達(dá)特征分析

裴徐梨1，2荊贊革1唐征1王巖2王鎮(zhèn)2陳忠文2羅天寬1張小玲1

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

從青花菜自交系‘WN12-95B'中克隆得到花粉發(fā)育基因MF21。序列生物信息學(xué)分析表明，該基因全長468 bp，編碼151個(gè)氨基酸，相對分子量為16.70 kD，等電點(diǎn)為8.56，為疏水性蛋白。青花菜MF21蛋白的信號(hào)肽長度為22個(gè)氨基酸殘基。且該蛋白含有兩個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，4 個(gè)N 端豆蔻?；稽c(diǎn)和一個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。不規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角是其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成成分。分子進(jìn)化表明，MF21基因與同屬的埃塞俄比亞芥進(jìn)化關(guān)系最近。通過熒光定量PCR對青花菜MF21基因的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因在保持系花蕾中表達(dá)較高，具有明顯的組織特異性。在Ogu不育系及其保持系不同發(fā)育階段的花蕾中MF21相對表達(dá)量差異明顯。

青花菜；花粉發(fā)育；MF21；基因克隆；表達(dá)分析

花粉發(fā)育是開花植物生命進(jìn)程中的一個(gè)重要組成部分，早期的研究主要集中在花粉形態(tài)學(xué)的觀察以及育性的調(diào)控，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，對花粉發(fā)育相關(guān)蛋白的研究逐漸成為熱點(diǎn)。目前，花粉發(fā)育的相關(guān)基因已在多種植物中成功克隆，如擬南芥的MMD1基因［1］、水稻的PPS1基因［2］以及白菜的BcMFs基因家族［3］。前人研究表明，MF2基因（Male Fertile 21）是白菜花粉發(fā)育的重要基因，可在四分體時(shí)期及小孢子中檢測到。其啟動(dòng)子區(qū)域含有7個(gè)典型的順式調(diào)控元件和3個(gè)花粉特異元件［4］。

迄今白菜MF基因研究較為深入，但在青花菜中的研究處于起步階段。MF基因?qū)儆谝粋€(gè)大的基因家族，家族成員包括多聚半乳糖醛酸酶MF6［5］、跨膜蛋白MF12［6］、花粉敗育蛋白MF13［7］以及C2H2鋅指蛋白MF20［8］等。MF21是MF基因家族中一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的成員，其基因特征及功能有待進(jìn)一步研究。

青花菜（Brassica oleracea var. italica）是十字花科蕓薹屬一二年生草本植物，以綠色或紫色花球?yàn)槭秤闷鞴?，在我國廣泛栽培。青花菜營養(yǎng)豐富，是深受消費(fèi)者喜愛的蔬菜之一。本試驗(yàn)從青花菜高代自交系‘WN12-95B'中克隆得到花粉發(fā)育基因MF21，通過分子生物學(xué)方法對其分子結(jié)構(gòu)及序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)對MF21基因在Ogu不育系及其保持系不同發(fā)育階段花蕾中的表達(dá)特性進(jìn)行分析，旨在為了解青花菜MF21基因在花粉發(fā)育中的作用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以課題組培育的青花菜Ogu不育系‘WN12-95A'及其保持系‘WN12-95B' 為試驗(yàn)材料，種植于溫州科技職業(yè)學(xué)院試驗(yàn)田，于花期取保持系的根、莖、葉、花蕾和嫩莢。同時(shí)取不育系和保持系不同發(fā)育階段的花蕾（＜2 mm，2-4 mm，＞4 mm），用鋁箔紙包好后，迅速投入液氮中固定，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和試劑 基因克隆和熒光定量試驗(yàn)過程中使用的RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR GreenⅠ、dNTP、Taq酶等均購于大連TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及MF21基因的克隆 青花菜總RNA提取參照RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄cDNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit）。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中花粉發(fā)育基因MF21設(shè)計(jì)全長引物對：BoMF21-F（5'-AGAAAGCCAAAATGGCAGAA-3'）和BoMF21-R（5'-GCTAGTTAGATTGTGGTGTCAT TG-3'）。以保持系花蕾cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系包括1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，10 μL Taq mixture，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性50 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，回收片段連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2 青花菜MF21基因的生物信息學(xué)分析 開放閱讀框的查找使用ORF FINDER程序（http：//www. ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html）進(jìn)行。青花菜花粉發(fā)育基因MF21與同源物種的檢索在NCBI的BLAST程序中完成。使用pI/MW軟件預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)；通過Signal P預(yù)測蛋白信號(hào)肽序列及位點(diǎn)。采用DNAMAN分析青花菜MF21的疏水性/親水性及氨基酸的理化性質(zhì)。系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建使用MEGA 5.0經(jīng)多重比對后完成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)使用Predict Protein軟件（http：//www.predictprotein.org）進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 青花菜MF21基因的熒光定量PCR分析 通過熒光定量PCR（Relative quantitative real-time RTPCR）技術(shù)檢測花粉發(fā)育基因MF21在青花菜不同組織中的表達(dá)情況。檢測引物為：5'-CTTGCTGGTCTGGATCAT-3'和 5'-AGTTAGATTGTGGTGTCATTG -3'，以actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物序列為：正向引物5'-GACAACTTACAACTCCATCAT-3'和反向引物5'-CTCATACGGTCAGCGATA-3'。QRT-PCR反應(yīng)在Bio-Rad IQ5上完成。

實(shí)時(shí)定量PCR參照大連TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq 試劑盒操作說明進(jìn)行，相對定量計(jì)算方法使用2-ΔΔCT法，其中ΔCT=CT，基因-CT，actin。

2 結(jié)果

2.1 青花菜MF21基因的克隆及序列生物信息學(xué)分析從青花菜保持系花蕾中克隆得到一個(gè)468 bp左右的MF21基因片段（圖1），該片段包含一個(gè)開放閱讀框?yàn)?56 bp，5'非翻譯區(qū)11 bp，3'非翻譯區(qū)1 bp，預(yù)測編碼151個(gè)氨基酸（圖2）。使用pI/MW軟件預(yù)測MF21蛋白相對分子量為16.70 kD，等電點(diǎn)為8.56。Signal P預(yù)測表明MF21基因存在信號(hào)肽的可能性為0.814，剪切位點(diǎn)位于第22位與第23位之間，信號(hào)肽序列為MAELKWMCLSFSVSLLLSLAVG。通過Prosite 數(shù)據(jù)庫對MF21蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)進(jìn)行查詢，結(jié)果得出在28-30 bp、189-131 bp含有兩個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，52-57 bp、55-60 bp、93-98 bp、105-110 bp 含有4個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)，120-123 bp含有一個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

圖1 RT-PCR克隆青花菜MF21基因

圖2 青花菜MF21基因的cDNA序列及編碼的氨基酸序列

2.2 青花菜與其他物種MF21基因的氨基酸序列同源性分析

通過GenBank的氨基酸序列同源檢索，發(fā)現(xiàn)19種物種的MF21基因的氨基酸序列與青花菜具有相似性，經(jīng)序列多重比對，MF21蛋白與埃塞俄比亞芥、紫菜苔、大葉芥、小白菜、甘藍(lán)型油菜、卷心菜、黑芥、薺菜、玉山筷子芥、擬南芥等10種植物具有較高同源性，其中相似性最高的物種為埃塞俄比亞芥，相似度達(dá)到100%。同時(shí)MF21與剛果錐蟲、放線菌以及野草莓等具有較低的同源性，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明無保守結(jié)構(gòu)域與青花菜MF21蛋白相匹配（圖3）。

通過對上述11種植物的MF21基因的氨基酸組成特性的分析，結(jié)果顯示，11種植物中的MF21基因的氨基酸殘基數(shù)變化范圍較小，為124-131個(gè)；相對分子量差異較小，均為16.50 kD左右；等電點(diǎn)、酸性氨基酸比例、堿性氨基酸比例差異較?。环枷阕灏被釘?shù)量最高為擬南芥（16個(gè)），其余均為12-15個(gè)不等；脂肪族氨基酸數(shù)量及不溶蛋白的比例較為固定。

2.3 青花菜MF21基因的氨基酸序列疏水性/親水性分析

氨基酸序列親水性及疏水性的分析對蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測具有重要作用。通過對MF21氨基酸序列的疏水性/親水性分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白疏水性氨基酸比親水性氨基酸多，推測其為疏水性蛋白，其中第18位絲氨酸（2.76）為疏水性最大位點(diǎn)，其次為相鄰的第17位亮氨酸（2.70）；第64位甘氨酸和第73位絲氨酸為親水性最大位點(diǎn)，最大值均為1.50，其次為第74位精氨酸和第75 位天冬氨酸。

2.4 青花菜MF21蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由其一級(jí)結(jié)構(gòu)折疊而成，包括α-螺旋和β型結(jié)構(gòu)兩種類型，二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建對于了解蛋白質(zhì)的生物功能有重要作用。本試驗(yàn)克隆得到的青花菜MF21蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α-螺旋（14%）、不規(guī)則卷曲（33%）、延伸鏈（9%）和β-轉(zhuǎn)角（43%），其中不規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成成分。

2.5 青花菜MF21基因分子進(jìn)化分析

通過MEGA 5.0對青花菜和上述10種植物的氨基酸序列進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，11個(gè)物種的MF21蛋白可分為兩個(gè)大的分支，一支包括擬南芥屬植物，另一支包括蕓薹屬和薺菜屬植物，其中青花菜MF21與同屬的埃塞俄比亞芥進(jìn)化關(guān)系最近，位于進(jìn)化樹的同一個(gè)亞組；其次與甘藍(lán)和油菜進(jìn)化關(guān)系較近，同植物學(xué)的分類較相符。

圖3 青花菜MF21基因氨基酸序列與不同物種的多重比對結(jié)果

圖4 青花菜及11個(gè)物種的MF21基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹分析

2.6 青花菜MF21基因的時(shí)空表達(dá)特征分析

采用qRT-PCR技術(shù)對MF21基因的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5-A）表明在保持系中MF21基因只在花蕾中表達(dá)，根、莖、葉和嫩莢中均未檢測到表達(dá)。保持系1、2級(jí)花蕾中的表達(dá)量較3級(jí)花蕾表達(dá)量顯著上調(diào)。Ogu不育系及其保持系不同發(fā)育階段花蕾中MF21基因表達(dá)差異較大，在1級(jí)花蕾（＜2 mm）中，保持系MF21表達(dá)量是不育系的20倍，不育系2-3級(jí)花蕾中未檢測到該基因的表達(dá)（圖5-B）。

3 討論

花粉由花粉母細(xì)胞分化而來，其發(fā)育機(jī)理十分復(fù)雜，涉及的基因以及蛋白也種類繁多。對花粉發(fā)育的研究，不僅為了解植物的生殖規(guī)律及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)還可以促進(jìn)雜種優(yōu)勢育種。本試驗(yàn)使用RT-PCR技術(shù)成功在青花菜中克隆得到花粉發(fā)育基因MF21，功能位點(diǎn)分析顯示，該基因編碼的蛋白含有蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N 端豆蔻?；稽c(diǎn)以及酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。蛋白激酶C基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中突觸形成的調(diào)控因子［9］，N 端豆蔻酰化參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)的運(yùn)輸以及Ca2+的調(diào)控［10］，同時(shí)酪氨酸磷酸化也參與了信號(hào)傳遞［11］。由此推測青花菜的MF21蛋白在花粉發(fā)育過程中以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式發(fā)揮重要作用。

氨基酸序列同源性分析得出，12種物種之間氨基酸序列、等電點(diǎn)、酸性氨基酸比例、堿氨基酸比例差異很小，表明該基因編碼的蛋白在種屬間高度保守，青花菜與同屬植物的蛋白同源性達(dá)66%-100%，而且同源植物集中在十字花科植物。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)MF21蛋白的疏水性氨基酸比親水性氨基酸多，為疏水性蛋白，推測可能與花粉發(fā)育過程中壁層形成中的脂類代謝相關(guān)［12］。

圖5 青花菜MF21基因的表達(dá)特性

蕓薹屬“禹氏三角”理論指出，蕓薹屬植物都是由白菜（AA）、黑芥（BB）和甘藍(lán)（CC）分化而來，這3種植物經(jīng)過兩兩雜交之后演化形成甘藍(lán)型油菜（AACC）、芥菜（AABB）和埃塞俄比亞芥（BBCC）［13］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，青花菜首先與埃塞俄比亞芥聚類，青花菜屬于CC基因組，埃塞俄比亞芥屬于BBCC基因組；同時(shí)屬于AA基因組的小白菜、紫菜苔和AABB基因組的大葉芥位于同一個(gè)亞組，聚類結(jié)果與“禹氏三角”理論相符。Udall等［14］研究發(fā)現(xiàn)，AA基因組與CC基因組進(jìn)化關(guān)系較近，BB基因組則較遠(yuǎn)，本試驗(yàn)中青花菜的MF21蛋白在進(jìn)化上具有高度的保守性，進(jìn)化方向與其他蕓薹屬植物保持一致，進(jìn)化關(guān)系與BB基因組的黑芥較遠(yuǎn)。

花粉發(fā)育基因按照作用時(shí)間的不同可分為早期基因和晚期基因，早期基因主要在減數(shù)分裂時(shí)期到花粉成熟期間發(fā)揮作用，而晚期基因多表達(dá)于成熟花粉中［15］。試驗(yàn)通過qRT-PCR技術(shù)對青花菜保持系中MF21基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析，僅在花蕾中檢測到表達(dá)，根、莖、葉中均未檢測到。在Ogu不育系及其保持系的1-3級(jí)的花蕾中，1級(jí)花蕾中MF21的表達(dá)量均最高，表明花粉發(fā)育基因MF21是在花粉中特異表達(dá)的早期基因，參與花粉細(xì)胞分化和花粉成熟。本研究克隆了青花菜MF21基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和時(shí)空表達(dá)特性分析，為今后進(jìn)一步深入研究MF21基因在青花菜花粉發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物技術(shù)手段創(chuàng)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型青花菜雄性不育系提供候選基因資源。

4 結(jié)論

本研究從青花菜高代自交系中克隆得到花粉發(fā)育基因MF21，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分子進(jìn)化揭示了MF21基因與甘藍(lán)和油菜進(jìn)化關(guān)系較近。qRT-PCR結(jié)果表明MF21基因在保持系花蕾中表達(dá)較高，在Ogu不育系及其保持系不同發(fā)育階段的花蕾中表達(dá)差異明顯。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of a Pollen Development Gene MF21 in Broccoli

Pei Xuli1，2Jing Zan'ge1Tang Zheng1Wang Yan2Wang Zhen2Chen Zhongwen2Luo Tiankuan1Zhang Xiaoling1
（1. Zhenan Key Laboratory of Crop Breeding，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006；2. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）

In this study， the MF21 gene were cloned from a broccoli maintenance line ‘WN12-95B'. Bioinformatic analysis showed that the full length of MF21 gene was 468 bp and encoded 151 amino acid peptides. The relative molecular weight and pI of MF21 was 16.70 kD and 8.56， respectively. Meanwhile， the MF21 protein was speculated as a hydrophobic protein. The MF21 protein include a 22 amino acid length signal peptide， and also contain two CK2 phosphorylation sites， four N-myristoylaton sites and one tyrosine kinase phosphorylation site. Random coils and β-strands were main components of the two-dimension structure. Based on the molecular evolution， we found that the MF21 gene had approximate evolution relationship between broccoli and Brassica carinata. The expression analysis of MF21 gene by qRT-PCR indicated that this gene was mainly expressed in bud of broccoli and had tissue specificity. The expressive abundance of bud in different development stage had great differences between the Ogu CMS line and its maintenance line.

broccoli；pollen development；MF21；gene clone；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.014

2014-08-06

浙江省自然基金項(xiàng)目（LY12C15009），浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12903-3-3），浙江省重大科技項(xiàng)目（2010C-12004），溫州科技局項(xiàng)目（N20090016）

裴徐梨，女，博士研究生，研究方向：蔬菜遺傳育種；E-mail：2012204024@njau.edu.cn

荊贊革，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)；E-mail：jingzange@aliyun.com