隋春紅王程董順福韓麗琴

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 132013）

葡萄糖淀粉酶在高壓靜電紡PEI/PVA納米纖維膜上的離子吸附固定

隋春紅1王程2董順福1韓麗琴1

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 132013）

旨在應(yīng)用離子結(jié)合法將葡萄糖淀粉酶固定在PEI/PVA納米纖維膜上并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。采用高壓靜電紡絲技術(shù)制備聚乙烯亞胺（PEI）/聚乙烯醇（PVA）納米纖維膜，采用熱交聯(lián)方法使其具備水穩(wěn)定性后，再利用離子吸附法固定葡萄糖淀粉酶。結(jié)果顯示，利用紅外光譜（FT-IR）表征固定有葡萄糖淀粉酶的PEI/PVA納米纖維膜，表明葡萄糖淀粉酶可成功固定在靜電紡絲形成的PEI/PVA納米纖維膜表面。通過(guò)固定化葡萄糖淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)固定化葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，比游離的葡萄糖淀粉酶提高了6℃；固定化葡萄糖淀粉酶的適用pH值范圍明顯變寬；熱穩(wěn)定性和存貯穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)且可以重復(fù)使用。利用離子吸附法能簡(jiǎn)便地將蛋白質(zhì)分子固定于納米纖維膜上，具有一定的應(yīng)用前景。

靜電紡絲；PEI/PVA納米纖維膜；葡萄糖淀粉酶；離子吸附；固定化

葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3.2.1.3）俗稱糖化酶，是一種由微生物分泌的胞外酶，可水解淀粉非還原性末端的葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖［1］。作為一種重要的酶制劑，葡萄糖淀粉酶被廣泛應(yīng)用于食品和發(fā)酵工業(yè)中，且需要量與日俱增。工業(yè)生產(chǎn)使用的葡萄糖淀粉酶多為液態(tài)酶，具有一定的局限性，如易失活、熱穩(wěn)定性差、酸性反應(yīng)環(huán)境和水解時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)［2］。因此世界各國(guó)科學(xué)家對(duì)葡萄糖淀粉酶的固定化進(jìn)行了大量的研究，獲得了穩(wěn)定性強(qiáng)、可反復(fù)使用、適于生產(chǎn)的連續(xù)化和自動(dòng)化等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)的固定化酶［3］。酶的固定化方法主要有共價(jià)鍵結(jié)合法、吸附法、包埋法、交聯(lián)法等［4］。其中，吸附法因其工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、載體材料豐富而備受青睞，包括物理吸附和離子吸附兩種類型［5］。利用吸附法制備的固定化酶暴露于載體之外，而且酶的空間結(jié)構(gòu)幾乎不發(fā)生改變。目前，用于固定化酶的載體已達(dá)上百種，包括明膠、磁性微球、活性炭、有序介孔材料、硅藻土和親水性微濾膜等［6］。納米材料作為一種新型的酶固定化載體越來(lái)越受關(guān)注，根據(jù)物理形態(tài)的差異性大致可以分為納米粒（包括納米球、納米囊）、納米纖維（包括納米管、納米線）、納米膜等［7］。靜電紡絲法制備的納米纖維膜具有比表面積大、孔隙率高和易于分離回收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為一種優(yōu)良的酶固定化載體，而且制備成本低、工藝簡(jiǎn)單［8，9］。

本研究采用靜電紡絲法制備出攜帶正電荷的聚乙烯亞胺（PEI）/聚乙烯醇（PVA）納米纖維膜，熱交聯(lián)使其具備水穩(wěn)定性后通過(guò)離子間相互作用力將帶有負(fù)電荷的葡萄糖淀粉酶吸附在納米膜上，達(dá)到固定化的目的，同時(shí)鑒定固定化葡萄糖淀粉酶的酶學(xué)特征，旨在為進(jìn)一步研究利用新型固定化酶材料和方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

H-7500型場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡（SEM）（Japan，HITACHI）；Magna 560型傅立葉紅外光譜（FT-IR）儀（USA，NICOLET），其掃描范圍為4 000-400 cm-1；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Japan，SHIMADZU）；高壓靜電紡絲裝置（吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院自組裝）；振蕩培養(yǎng)箱（上海精密儀器儀表公司）。聚乙烯亞胺（PEI，平均分子量為70 000）購(gòu)于阿拉丁試劑公司；聚乙烯醇（PVA，聚合度175±50）購(gòu)于安徽皖維高新材料股份有限公司；50%戊二醛（GA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；葡萄糖淀粉酶購(gòu)于蘇柯漢（濰坊）生物工程有限公司；可溶性淀粉、乙酸、碘化鉀、碘、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、硫代硫酸鈉、碳酸鈉等分析純?cè)噭┚?gòu)于北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 PEI/PVA復(fù)合纖維的制備 將50%（M/M）的PEI溶液和10%（M/M）的PVA溶液按質(zhì)量比1∶15混合，獲得12.5%（M/M）的PEI/PVA溶液，使混合高聚物溶液中PEI與PVA的質(zhì)量比為1∶3。再將混合高聚物溶液倒入帶有電極的塑料管中，調(diào)節(jié)合適的靜電紡絲參數(shù)，進(jìn)行高壓靜電紡絲。靜電紡絲的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)分別為：工作電壓為20 kV，噴口與接收板的距離為10 cm，溶液流速為1.5 mL/h。所制備的復(fù)合納米纖維膜進(jìn)行熱交聯(lián)（120℃保溫12 h）處理，使其具有疏水性后置于真空干燥器中備用。

1.2.2 葡萄糖淀粉酶的固定化 葡萄糖淀粉酶的等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）在3.8-5.6之間［2］。將葡萄糖淀粉酶分別溶解于pH為6、7、8和9的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，使酶分子攜帶負(fù)電荷，以便有效地與帶有正電荷的復(fù)合纖維膜發(fā)生離子吸附。再將疏水性的PVA/PEI納米復(fù)合纖維薄膜浸入不同pH值的葡萄糖淀粉酶溶液（0.5 g/L）中，在25℃的溫度下震蕩24 h，用PBS（pH為7.4）快速?zèng)_洗3遍，真空干燥待測(cè)。

1.2.3 酶活力測(cè)定 葡萄糖淀粉酶活力單位定義：在pH4.6、溫度為58℃時(shí)，1 h內(nèi)葡萄糖淀粉酶水解淀粉釋放出 1 mg 還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。酶比活力定義：?jiǎn)挝恢亓康挠坞x酶或載酶PEI/PVA納米纖維膜所具有的酶活力單位數(shù)，計(jì)量單位為U/g。反應(yīng)液是由10 mL的質(zhì)量濃度為2%的淀粉溶液和5 mL的pH4.6的醋酸緩沖液混合而成。在58℃水浴條件下加熱10 min后，加入0.5 g載酶PEI/PVA納米纖維膜，在58℃恒溫反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后，立刻將反應(yīng)液置于沸水浴中10 min，終止酶反應(yīng)。以葡萄糖的含量（mg）為橫坐標(biāo)，540 nm處吸光度值（OD540）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成的葡萄糖量采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定［10］。

1.2.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 取0.1 g游離酶和0.5 g固定化酶，分別以0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%濃度的可溶性淀粉為底物［S］，按酶活力測(cè)定方法測(cè)定葡萄糖的生成量，計(jì)算出酶促反應(yīng)速度V。采用Linweaver-Burk作圖法（即雙倒數(shù)作圖法），以1/［S］為X軸，1/V為Y軸，經(jīng)一元線性回歸擬合，所擬合直線在X軸上的截距為-1/Km，在Y軸上的截距為1/Vmax，由此求出Km和Vmax。

2 結(jié)果

2.1 靜電紡絲法制備的PEI/PVA納米纖維膜

由圖1-A展示出PEI/PVA納米纖維膜在宏觀上呈現(xiàn)纖維毯狀結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)良。PEI/PVA納米纖維膜的場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微照片（圖1-B）顯示，PEI/PVA納米纖維構(gòu)建出具有三維孔道結(jié)構(gòu)的膜性材料，而且纖維表面平滑、直徑均勻（約為600±5 nm），經(jīng)過(guò)熱交聯(lián)處理（圖1-C）后，纖維直徑有所降低（約為500±5 nm）。在熱處理過(guò)程中水分的蒸發(fā)導(dǎo)致纖維直徑減小，從而增加了纖維膜的比表面積和孔隙率，說(shuō)明經(jīng)過(guò)熱交聯(lián)處理后納米纖維薄膜表面暴露出更多的功能基團(tuán)，引起纖維表面對(duì)糖化酶的吸附位數(shù)量的增加，更加有利于提高纖維薄膜對(duì)糖化酶的靜電吸附作用。

圖1 靜電紡絲法制備的PEI/PVA納米纖維膜

2.2 葡萄糖淀粉酶在PEI/PVA納米纖維膜上的固定

PEI/PVA復(fù)合納米纖維在3 335 cm-1出現(xiàn)的最大吸收峰歸屬于羥基（O-H）和亞氨基（N-H）的伸縮振動(dòng)；2 926 cm-1的吸收峰為甲基（C-H）的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；2 865 cm-1較弱的吸收峰為來(lái)源于次甲基（C-H）的對(duì)稱振動(dòng)；1 660、1 631和930 cm-1兩處的吸收峰分別來(lái)源于PEI分子中伯胺基團(tuán)（N-H）的彎曲振動(dòng)和平面外（N-H）的彎曲振動(dòng)。而且在1 140 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是PVA晶體化的主要標(biāo)志，說(shuō)明經(jīng)過(guò)熱交聯(lián)后制備的復(fù)合纖維屬于疏水性材料，將更有利于提高葡萄糖淀粉酶的固定化程度和材料的重復(fù)使用性能。當(dāng)把經(jīng)過(guò)熱處理的疏水性復(fù)合纖維浸入到不同pH值溶液中時(shí)，通過(guò)紅外譜圖（圖2）可以看出，經(jīng)過(guò)葡萄糖淀粉酶負(fù)載后在1 610 cm-1和972 cm-1處出現(xiàn)了新的特征吸收峰，分別歸屬于酰亞胺基團(tuán)（-CONH-）和C-S鍵的伸縮振動(dòng)；而且在1 515 cm-1和1 505 cm-1出現(xiàn)的另外兩個(gè)特征峰歸屬于酰胺中的N-H變形振動(dòng)，即酰胺化合物的吸收帶Ⅱ，這說(shuō)明葡萄糖淀粉酶已經(jīng)成功固載于納米復(fù)合纖維膜之上。pH數(shù)值越大即溶液的堿性越強(qiáng)，對(duì)應(yīng)的糖化酶的特征吸收峰也越明顯，說(shuō)明在堿性條件下更加有利于葡萄糖淀粉酶的固定化。特別是當(dāng)溶液的pH 值為9時(shí)，特征吸收峰明顯變寬且強(qiáng)度增大，這說(shuō)明葡萄糖淀粉酶與載體之間存在著相互作用。

圖2 紅外光譜圖

2.3 固定化葡萄糖淀粉酶的理化性質(zhì)

2.3.1 酶活力 以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，測(cè)定并計(jì)算出回歸方程為y=1.840 6x+0.012 8（R2=0.999 8）。分別測(cè)定在不同pH條件下制備的固定化葡萄糖淀粉酶的活力、比活力和固化率，結(jié)果（表1）顯示，酶的固化率隨固化環(huán)境pH值的增大而增加；此外，與游離的葡萄糖淀粉酶相比，固定化酶的活力明顯降低，約為游離酶的1/10。

表1 pH條件下制備的固定化葡萄糖淀粉酶活力、比活力和固化率

2.3.2 最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度 測(cè)定固定化的葡萄糖淀粉酶與游離的葡萄糖淀粉酶在不同pH和溫度下的酶比活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，游離酶與固定化酶的最適pH基本相同，分別為4.61和4.57（圖3）；固定化前后的葡萄糖淀粉酶的最適催化反應(yīng)溫度發(fā)生較大改變，游離酶的最適反應(yīng)溫度為59.3℃，與產(chǎn)品說(shuō)明一致，而固定化酶的最適反應(yīng)溫度為65.1℃，比游離酶提高了約6℃（圖4）。固定化酶的適用溫度范圍和pH適用范圍均較游離酶明顯變寬，這可能是由于PEI/PVA納米纖維膜的保護(hù)降低了酶對(duì)環(huán)境的敏感性。

圖3 pH對(duì)葡萄糖淀粉酶活力的影響

圖4 溫度對(duì)葡萄糖淀粉酶活力的影響

2.3.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 根據(jù)底物濃度及酶促反應(yīng)速度作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)回歸方程求得固定化葡萄糖淀粉酶的Km值為17. 82 mg/mL，Vmax為5.33 mg/（mL·h）；游離的葡萄糖淀粉酶的Km值為8.07 mg/mL，Vmax為10.80 mg/（mL·h）。

圖5 葡萄糖淀粉酶Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

2.3.4 熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性 通過(guò)在pH4.6的醋酸緩沖液中，分別測(cè)定固定化葡萄糖淀粉酶和游離的葡萄糖淀粉酶在不同溫度下保持1 h后的酶活力來(lái)鑒定其熱穩(wěn)定性。結(jié)果（圖6）顯示，在高溫環(huán)境下，酶活力均明顯下降，但固定化酶的熱穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于游離酶。另將一批游離酶溶液和固定于PEI/PVA納米纖維膜上處于濕態(tài)的葡萄糖淀粉酶于4℃貯存于密封的容器中，每隔2 d取出一定量分別測(cè)定酶的活力，觀察酶活力的降低趨勢(shì)，鑒定其貯存穩(wěn)定性。結(jié)果（圖7）顯示，固定化葡萄糖淀粉酶和游離葡萄糖淀粉酶的活力均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但經(jīng)PEI/PVA納米纖維膜固定化后的葡萄糖淀粉酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯著提高。儲(chǔ)存20 d后，游離酶只能保留初始酶活力的21.61%，固定化酶仍能保持初始酶活力的59.52%。

圖6 固定化葡萄糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性

圖7 固定化葡萄糖淀粉酶的貯存穩(wěn)定性

2.3.5 重復(fù)使用性 衡量固定化酶在工業(yè)上是否具有廣泛的應(yīng)用性的一個(gè)重要指標(biāo)就是固定化酶的重復(fù)使用性。取反應(yīng)后的固定化葡萄糖淀粉酶用蒸餾水沖洗3次，以去除表面的底物和產(chǎn)物溶液，然后再在pH值4.6，60℃下重復(fù)使用，連續(xù)重復(fù)使用10次并測(cè)定其酶活力。結(jié)果（圖8）顯示，在第3次使用后酶活力開(kāi)始有一定幅度下降，從第7次使用開(kāi)始酶活力下降的趨勢(shì)減緩，在此之后再次使用時(shí)能保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，但酶活力偏低。

圖8 固定化葡萄糖淀粉酶的重復(fù)使用性

3 討論

與傳統(tǒng)紡絲法相比，靜電紡絲法制備聚合物納米纖維具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易以及高效等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是制備聚合物納米纖維最有效的方法。因此，基于攜帶大量正電荷的PEI為主體的高分子材料制備納米復(fù)合纖維薄膜可以與帶負(fù)電荷的糖化酶通過(guò)靜電作用而結(jié)合［11］，從而達(dá)到固定糖化酶的目的。通過(guò)離子結(jié)合法制備的固定化糖化酶可以提高酶的利用率和重復(fù)使用性，為進(jìn)一步研究利用新型固定化酶材料提供依據(jù)。

從不同pH條件下制備的固定化葡萄糖淀粉酶活力、比活力和固化率的結(jié)果可以看出，酶的固化率隨固化環(huán)境pH值的增大而增加，這可能是由于在較大pH環(huán)境下，酶蛋白所帶負(fù)電荷較多，與帶有正電荷的PEI/PVA納米纖維膜的吸附結(jié)合更加牢固［12］。然而固定化葡萄糖淀粉酶的活力在pH=9時(shí)并沒(méi)有增高，反而降低，說(shuō)明在過(guò)高pH環(huán)境下，酶蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，即酶蛋白發(fā)生變性，從而導(dǎo)致酶活力的降低。此外，與游離的葡萄糖淀粉酶相比，固定化酶的活力明顯降低，其原因在于固定后的酶分子的活動(dòng)自由度受納米纖維膜載體的限制而顯著降低。

由酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，固定化葡萄糖淀粉酶Km值＞游離葡萄糖淀粉酶的Km值，并且固定化酶的最大酶促反應(yīng)速度Vmax＜游離酶的Vmax。這說(shuō)明固定化糖化酶對(duì)底物的親和力要小于游離酶，即酶的固定化使酶對(duì)底物的親和性降低，這與固定化載體的空間障礙和擴(kuò)散限制作用有關(guān)，即載體限制了酶分子的空間自由度，使酶與底物分子接觸受阻。另外一種可能是固定后的酶分子活性中心的空間構(gòu)象發(fā)生變化，影響了酶活性中心對(duì)底物分子的定位作用［13］。

固定化葡萄糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶，說(shuō)明酶分子經(jīng)過(guò)固定化后，受到了納米纖維膜載體的保護(hù)作用，一定程度上屏蔽了外界環(huán)境對(duì)酶蛋白的影響。經(jīng)重復(fù)使用后，固定化葡萄糖淀粉酶活力有所下降，表明薄膜材料隨著使用次數(shù)的增加，會(huì)有少量的酶從纖維膜上脫附下來(lái)［14］，隨著酶含量的減少，酶活力也隨之下降。

4 結(jié)論

運(yùn)用高壓靜電紡絲技術(shù)制備帶有大量正電荷的納米復(fù)合纖維薄膜（PEI/PVA），使其作為載體通過(guò)正負(fù)離子間作用力將葡萄糖淀粉酶固定化。通過(guò)掃描電鏡和紅外光譜進(jìn)行表征，從而確定復(fù)合纖維的形貌及葡萄糖淀粉酶負(fù)載后分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，固定化的葡萄糖淀粉酶保持了較高原酶（游離酶）的活性，同時(shí)對(duì)游離酶及固定化糖化酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH及熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性進(jìn)行了比較，研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖淀粉酶被納米復(fù)合纖維薄膜PEI/PVA固載后，拓寬了其最適反應(yīng)條件、提高了酶的利用效率和重復(fù)使用性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Immobilization of Glucoamylase onto the Electrospinning PEI/PVA Composite Nanofiber Membrane via Ionic Adsorption

Sui Chunhong1Wang Cheng2Dong Shunfu1Han Liqin1
（1. Department of Pharmacy，Jilin Medical College，Jilin 132013；2. Department of Basic Medical Sciences，Jilin Medical College，Jilin 132013）

It was to study the physical and chemical properties of immobilization of glucoamylase on the PEI/PVA nanofibers via ion bonding. Polyethyleneimine（PEI）/polyvinyl alcohol（PVA） composite nanofiber membrane was prepared by electrospinning technology， and thermal crosslinking was applied to make it possess water stability. Glucoamylase was immobilized onto the electrospinning PEI/PVA composite nanofiber membrane via ion adsorption. Results showed that fourier transform infrared spectrum（FT-IR） indicated that glucoamylase can be successfully fixed on the surface of the electrospinning PEI/PVA composite nanofiber membrane. Then， the enzymatic properties of immobilized glucoamylase were identified. The results have shown that the optimum reaction temperature of immobilized glucoamylase is 65℃， 6 degrees higher than free glucoamylase， and the applicable pH range of immobilized glucoamylase is wider than free glucoamylase significantly. In addition， immobilized glucoamylase also has good thermal stability， storage stability and reusability. The use of ion adsorption can help the protein molecules easily fixed onto the nanofiber membrane， so this method processes a certain application.

electrospinning；PEI/PVA composite nanofiber membrane；glucoamylase；ionic adsorption；immobilization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.025

2014-07-07

吉林省教育廳資助項(xiàng)目（吉教科合字［2013］第354號(hào)）

隋春紅，女，博士，副教授，研究方向：納米材料；E-mail：suichunhong@163.com