劉健鋒丁艷平侯博儒王建林邵寶平

（1. 蘭州大學生命科學學院 動物學與發(fā)育生物學研究所，蘭州 730000；2. 西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；3. 蘭州大學第二臨床醫(yī)學院，蘭州 730030）

牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息學特征分析

劉健鋒1丁艷平2侯博儒3王建林1邵寶平1

（1. 蘭州大學生命科學學院 動物學與發(fā)育生物學研究所，蘭州 730000；2. 西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；3. 蘭州大學第二臨床醫(yī)學院，蘭州 730030）

為了研究高原動物對青藏高原高寒、低氧等極端生境的適應機理，進一步探討高原動物對高原反應——高原腦水腫抗性的分子機理，運用基因克隆與生物信息學相關技術和方法，對牦牛腦AQP4（水通道蛋白4，AQP4）基因CDS全長序列進行克隆、基因序列比對及其生物信息學特征分析。結果表明，牦牛AQP4的CDS含有一個966 bp的開放閱讀框，編碼322個氨基酸；牦牛AQP4基因編碼蛋白分子量34.69 kD，理論等電點（pI）7.59，其編碼蛋白含有6次跨膜結構，屬于疏水性蛋白；二級結構主要由α-螺旋、延伸及無規(guī)則卷曲構成；AQP4基因編碼產(chǎn)物氨基酸同源性及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，牦牛AQP4基因編碼氨基酸序列與黃牛、綿羊等物種間同源性較高，系統(tǒng)進化情況與其親緣關系遠近一致。

牦牛；AQP4；基因；CDS區(qū)；分子克??；生物信息學

機體內(nèi)氧氣含量較低是絕大多數(shù)疾病尤其是腦疾病最主要的誘發(fā)因子之一；高原腦水腫是高原反應中最常見、最重要的臨床癥狀之一。水通道蛋白4（Aquaporin，AQP4）是腦中表達最多、最重要的水通道蛋白，其不僅參與正常腦細胞間隙體積變化、神經(jīng)細胞遷移、腦脊液循環(huán)、細胞代謝產(chǎn)物清除等生理過程，而且在腦水腫的發(fā)生與清除中發(fā)揮著重要的作用［1-5］。1994年，Hasegawa等［6］首次從大鼠肺中克隆出一種特異性的對汞不敏感的水通道蛋白（Mercury insensitive water channel，MIWC），并將其命名為AQP4（aquaporin-4）；同年，又從大鼠腦中分離出AQP4的cDNA［7］。大量研究表明，AQP4在絕大多數(shù)腦疾病尤其是腦水腫的發(fā)生、發(fā)展及其消除過程中發(fā)揮著非常重要的作用。

牦牛是世界最具顯著特征的物種之一，是遍布青藏高原最大的哺乳動物，其對高寒、低氧極端生境的適應早已引起國內(nèi)外廣大學者的關注［8，9］。但是，到目前為止，在國內(nèi)外還尚未見到有關牦牛腦AQP4基因CDS全長序列及其相關生物信息學特征的研究報道。為了明晰高原動物對青藏高原高寒、低氧等極端環(huán)境的適應機理，進一步探討高原動物對高原反應——高原腦水腫抗性的分子機理，而為人類腦疾病的研究提供基礎資料，本研究運用基因克隆與生物信息學分析等技術和方法，對牦牛腦AQP4基因CDS全長序列進行了克隆、基因序列比對及生物信息學特征分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物為甘肅省甘南州瑪曲縣屠宰場的健康成年（3-4歲）牦牛，屠宰后立即取其頭部，沿矢狀面開顱取腦，用無菌生理鹽水將組織樣迅速沖洗干凈后剪成1 cm×1 cm×0.5 cm小塊后迅速放入液氮中，帶回實驗室后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

Trizol試劑、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DL2000 DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、SmaⅠ及質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；DNase I和DEPC購自Sigma公司（美國），IPTG 及X-Gal購自Promega公司（美國），pMD19-T克隆載體和E.coli DH5ɑ感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛大腦皮質(zhì)總RNA的提取 稱取100 mg牦牛大腦皮質(zhì)后加入液氮研磨，將研好的組織轉(zhuǎn)移至事先加入Trizol裂解液的離心管中，離心10 min；加入氯仿抽提5 min后離心；加入氯丙醇沉淀15 min后離心；再分別用無水乙醇和75%酒精洗滌后離心；DNase I去除基因組中殘留的DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測總RNA的質(zhì)量，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與合成 參考GenBank中黃牛AQP4基因cDNA序列（GeneID：516762）設計特異性引物P1和P2，即P1：5'-CCCAAGCTTATGAGTGACA GACCCGCAG-3'；P2：5'-TCCCCCGGGTCATACTGAA GACAACAC-3'，橫線部分分別為Hind Ⅲ，Sma Ⅰ內(nèi)切酶酶切位點序列。擴增引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.3 RT-PCR擴增 以牦牛大腦皮質(zhì)總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應，總反應體系10 μL：5×PrimeScript Buffer 2 μL，RNase free dH2O 7 μL，500 ng/ μL總RNA 1 μL，混勻后，37℃ 15 min，85℃ 5 s條件下進行逆轉(zhuǎn)錄反應，將產(chǎn)物4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，P1、P2為引物，擴增AQP4基因。PCR反應體系25 μL：5×Prime Star Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS 0.25 μL，cDNA模 板1 μL，RNase-Free dH2O 15.75 μL。PCR反應條件：98℃預變性2 min；98℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，用DNA片段回收試劑盒對PCR產(chǎn)物回收。

1.2.4 AQP4基因的克隆 回收的PCR產(chǎn)物在T4連接酶的作用下與pMD19-T克隆載體進行連接過夜（12-16 h）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH2α中，37℃，100 r/min培養(yǎng)1 h，涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h。挑取陽性單克隆接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。用“質(zhì)粒提取試劑盒”提取質(zhì)粒后進行用Hind Ⅲ，Sma Ⅰ內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定。鑒定成功后將質(zhì)粒送往上海生工公司進行測序。

1.2.5 生物信息學分析 AQP4基因開放閱讀框（ORF）采用NCBI的ORF Finder程序分析，序列比對及同源性分析使用DNAMAN軟件及在線NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白質(zhì)特性預測使用Bioedit及Lasergene7.1軟件包中的Protean軟件；親水性疏水性預測采用Epasy服務器上的protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）；蛋白質(zhì)二級結構預測采用法國里昂CNRS的SOPMA軟件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），并利用SWISS-MODEL軟件（http：//swiss-model.expasy.org/）進行三級結構預測；使用MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，置信度用Boot-strap檢驗（重復次數(shù)為1 000）。

2 結果

2.1 牦牛AQP4基因的PCR擴增

牦牛大腦皮層總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到28S、18S和5S 3條帶（圖1），OD260/OD280平均為1.95，表明RNA完整性較好，沒有蛋白質(zhì)或DNA污染且純度和濃度適合RT-PCR。牦牛RTPCR擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），DNA片段在1 000 bp左右，可能還含有編碼區(qū)兩側序列，與預期DNA片段（966 bp）大小基本一致，條帶清晰且特異性良好，可以進行切膠回收進一步做克隆。

圖1 牦牛皮質(zhì)總RNA的提取

圖2 AQP4基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜

2.2 牦牛AQP4基因克隆及重組子的鑒定

提取菌液的質(zhì)粒并用Hind Ⅲ，SmaⅠ內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到一條約3 000 bp的pMD19-T線性片段和約1 000 bp的插入片段（圖3），與預期的結果完全相同。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 牦牛AQP4基因的序列測定及分析

將雙酶切鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送往上海生工公司測序。測序結果表明，克隆得到的序列在CBI上進行同源性搜索，所得到的目的基因為含牦牛AQP4編碼區(qū)的序列。應用NCBI的ORF Finder程序?qū)﹃笈QP4基因序列開放閱讀框分析，得知AQP4基因含有一個長度為966 bp的開放閱讀框，編碼322個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖4）。

圖4 牦牛AQP4基因和編碼蛋白的序列

2.4 牦牛AQP4蛋白的生物信息學分析

2.4.1 牦牛AQP4蛋白的理化性質(zhì) 利用Protparam工具預測牦牛AQP4基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白分子量約為34.69 kD，理論等電點為7.59。含有20種基本氨基酸，其中含量最高的是Gly（10.5%），含量最低的分別是Gln（2.2% ）、Trp（2.2% ）和Cys（2.2%）；含有帶負電荷的殘基18個，帶正電荷的殘基33個，其280 nm的摩爾消光系數(shù)為49 430 mol/cm，該蛋白的平均親水系數(shù)為0.433。此外，牦牛AQP4基因編碼蛋白中含有8個Cys（圖4）。

2.4.2 牦牛AQP4蛋白的親水性/疏水性 運用ProtScale工具對牦牛AQP4進行親水性和疏水性分析。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強和分值越高疏水性越強的規(guī)律可知，牦牛AQP4基因編碼蛋白多肽鏈第136位Ala具有最低的分值-3.156和最強的親水性；第14位Leu具有最高的分值1.978和最強的疏水性。多肽鏈整體表現(xiàn)為疏水性（圖5），此結果與DNAMAN軟件分析結果基本一致。

圖5 牦牛AQP4蛋白疏水性分析

2.4.3 牦牛AQP4蛋白的跨膜區(qū)分析 如圖6所示，牦牛的AQP4為6個跨膜螺旋結構蛋白。其中，1-37位氨基酸為胞內(nèi)部分，38-60氨基酸為第1個跨膜螺旋，61-69氨基酸在胞外，70-92氨基酸為第2個跨膜螺旋，93-111為胞內(nèi)部分，112-134為第3個跨膜螺旋，135-153為胞外部分，154-176為第4個跨膜螺旋，177-188為胞內(nèi)部分，189-211為第5個跨膜螺旋，212-230為胞外部分，231-253為第6個跨膜螺旋，254-332為胞內(nèi)部分。

圖6 牦牛AQP4蛋白跨膜區(qū)域分析

2.4.4 牦牛AQP4蛋白的高級結構預測 采用SWISS-MODEL對牦牛AQP4蛋白同源建模獲得三級結構模型，該結果表明牦牛AQP4蛋白主要由α-螺旋、延伸和無規(guī)則卷曲構成，這與二級結構預測結果（圖7，圖8）一致。此外還發(fā)現(xiàn)牦牛AQP4由相同的4個亞基組成的同源四聚體，每個亞基均由完全相同的322個氨基酸組成。

圖7 牦牛AQP4蛋白的二級結構預測

圖8 牦牛AQP4蛋白三級結構預測

2.4.5 牦牛AQP4蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫中收集下載6個物種AQP4蛋白的序列，采用MegAlign軟件進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)牦牛AQP4蛋白與其它物種AQP4蛋白具有較高的同源性，均在90%以上，牦牛與黃牛AQP4氨基酸序列間同源性最高（表1），為98.8%。與綿羊、野豬、人、狼犬、小家鼠分別為97.9%、96.1%、94.6%、92.5%、92.0%。用NJ法構建了7個物種的AQP4基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9）。結果表明，牦牛與黃牛、綿羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近，這與動物學分類結果細胞水腫的“最后共同通道”。根據(jù)AQP4敲除鼠試驗病理模型研究表明AQP4在腦水腫的形成與去除的作用是雙方面的［14］。在低氧處理大鼠星形膠質(zhì)細胞模擬低氧腦缺血的模型中，相比于AQP4敲除型星形膠質(zhì)細胞，野生型細胞會更快速的腫脹，腫脹后細胞體積比AQP4敲除細胞更大，提示AQP4在促進水分進入星形膠質(zhì)細胞中起著重要作用［15］。另外，復氧后發(fā)現(xiàn)野生型星形膠質(zhì)細胞的腫脹程度仍然是AQP4敲除型的1.3倍，表明AQP4可以加速低氧處理后星形膠質(zhì)細胞水腫的清除［15］。

圖9 NJ法構建的AQP4基因系統(tǒng)發(fā)生樹

表1 牦牛與6個物種AQP4蛋白氨基酸序列同源性（%）比較

本研究克隆得到的牦牛AQP4基因編碼區(qū)序列具有特異的起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TGA），是牦牛AQP4基因編碼區(qū)全長序列，編碼AQP4蛋白。牦牛AQP4基因含有一個長度為966 bp的開放閱讀框，編碼322個氨基酸，整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性。由此推測，牦牛的該區(qū)域適益于水分子包裹的環(huán)境中。通過對牦牛AQP4基因編碼氨基酸序列跨膜結構進行分析表明，牦牛AQP4蛋白為6次跨膜螺旋結構蛋白，且這些跨膜區(qū)富含α-螺旋，缺少β-折疊結構，這與水通道蛋白家族其它成員結構相似［16］。該蛋白具有水通道蛋白家族保守的序列特征，其二級結構主要由α-螺旋、延伸和無規(guī)則卷曲構成，基本一致。

3 討論

近年的研究表明，腦水腫是缺血缺氧性損傷最常見的病理現(xiàn)象。了解水分子在細胞內(nèi)外或跨血腦屏障運輸?shù)臋C制對于研究腦水腫具有重要意義。水通道蛋白被認為是對腦中水運動提供關鍵路徑的主要水通道［10-13］，其中AQP4是在水通道蛋白家族中在腦中表達最為豐富的一個亞型，也被認為是產(chǎn)生這與其它AQPs結構相似［16］。此外，我們還發(fā)現(xiàn)牦牛AQP4基因編碼氨基酸序列中含有兩個天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）結構，NPA為AQP家族共有的特征結構。這與Preston等［16］發(fā)現(xiàn)的結果相一致，且這兩個NPA序列在空間上圍繞通道中軸呈點對稱分布。該蛋白序列中存在8個Cys。根據(jù)徐國恒等［17］研究結果推測Cys殘基的巰基基團發(fā)生氧化可形成二硫鍵，而疏水性氨基酸殘基圍繞著二硫鍵可形成局部疏水中心從而阻止水分子進行肽的內(nèi)部破壞氫鍵，該結構特征對于維持其結構穩(wěn)定及功能行使具有重要意義。同源建模結果表明牦牛AQP4蛋白高級結構是由相同的4個亞基組成的同源四聚體，這與鼠中AQP4蛋白高級結構類似［18］。每個四聚體都含有4個向外伸長圍繞中心孔隙排列的結構域，分別代表4個水孔，具有獨立的水通透活性。該四聚體在膜上的組裝是維持AQP穩(wěn)定性及正常功能所必需的。此外，序列同源性在一定程度上反映物種間親緣關系的遠近。通過序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，牦牛AQP4蛋白與其它物種AQP4蛋白具有較高的同源性，這與物種進化的結果相一致，表明AQP4基因可能是由同一個祖先基因進化而來，同時也反映了AQP4蛋白在不同物種結構上的穩(wěn)定性對生物體的功能重要性。我們還發(fā)現(xiàn)牦牛和黃牛AQP4基因編碼氨基酸序列間同源性最高，說明牦牛AQP4基因與黃牛該基因功能也極為相似，同時也提示了牦牛在適應高原低氧極端環(huán)境的過程中，AQP4基因在牦牛和黃牛體內(nèi)的表達量可能存在著一定差異。

4 結論

本研究利用分子克隆手段獲得牦牛AQP4基因的編碼區(qū)序列，并首次通過生物信息學相關技術和方法發(fā)現(xiàn)該蛋白含有6次跨膜結構，屬于疏水性蛋白；二級結構由α-螺旋、延伸、β-折疊及無規(guī)則卷曲構成；牦牛AQP4蛋白與黃牛、綿羊等物種間同源性較高。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of the CDS of Yak AQP4 Gene

Liu Jianfeng1Ding Yanping2Hou Boru3Wang Jianlin1Shao Baoping1
（1. School of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000；2. College of Life Sciences of Northwest Normal University，Lanzhou 730070；3. The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030）

A coding region sequence of yak AQP4 was cloned by molecular cloning technique. Some characters of the AQP4 gene and encoded protein sequences were predicted and analyzed by the methods of bioinformatics in the following aspects as the general physical and chemical properties， hydrophobicity， transmembrane structure and secondary structure. Results showed that the full-length of yak AQP4 contains a complete ORF（966 bp） encoding 322 amino acid. The putative molecular weight and theory isoelectric point of AQP4 gene in yak were 34.69 kD and 7.59， respectively. The protein encoded by yak AQP4 contains six transmembrane α-helices， and it is a hydrophobic protein. The second structures are mainly composed of α-helix， extended strand and random coil. Deduced amino acid sequences of AQP4 gene between yak and Bos Taurus， Ovis aries， Susscrofa and other species were high on homology and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship.

yak；Aquaporin 4（AQP4）；gene；CDS region；molecular cloning；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.019

2014-07-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（31000190），蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項

劉健鋒，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：andyandhope@gmail.com

邵寶平，男，博士，副教授，碩士生導師；研究方向：高原動物適應性機理；E-mail：shaobp@lzu.edu.cn