余小霞 田健 劉曉青 伍寧豐

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)及其啟動子研究進展

余小霞 田健 劉曉青 伍寧豐

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

枯草芽孢桿菌作為一種革蘭氏陽性細(xì)菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力強的特性和良好的發(fā)酵基礎(chǔ)及生產(chǎn)技術(shù)，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌外源蛋白的理想宿主，成為原核表達(dá)系統(tǒng)中的一種重要的模式菌株。而實現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一是使用強并可控制的啟動子。目前，枯草芽孢桿菌中常用的啟動子為組成型、誘導(dǎo)物誘導(dǎo)型、時期特異性及自誘導(dǎo)型。詳細(xì)介紹枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)以及其常用啟動子的優(yōu)缺點，并對克隆新的啟動子的方法做了總結(jié)，旨為完善枯草表達(dá)系統(tǒng)和工業(yè)生產(chǎn)外源蛋白奠定基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；表達(dá)系統(tǒng)；組成型啟動子；誘導(dǎo)型啟動子

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種重要的原核表達(dá)宿主，具有很高的應(yīng)用價值，其培養(yǎng)簡單快速，具有較強的分泌蛋白質(zhì)的能力、非致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表達(dá)宿主，是微生物研究領(lǐng)域中的一種重要模式菌株。但是目前，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍然存在不完善的地方，大部分外源蛋白在其體內(nèi)的表達(dá)仍舊不高，這主要是因為：（1）枯草芽孢桿菌在其對數(shù)生長末期表達(dá)和分泌大量的蛋白酶，影響外源蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量；（2）質(zhì)粒的分化和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，有時外源蛋白的組成型表達(dá)會影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性；（3）毒性蛋白在其體內(nèi)不易表達(dá)；（4）有些外源蛋白的表達(dá)分泌到培養(yǎng)基中會影響宿主菌的生長；（5）分子遺傳操作與大腸桿菌相比較困難。這些因素限制了枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展?？莶菅挎邨U菌168菌株的基因組全序列測序工作已于1997年完成［1］，但到目前為止，其基因組中尚有近50%［2］的基因的功能仍未闡明。因此目前針對枯草芽孢桿菌中基因及相關(guān)元件功能，以及其對內(nèi)部及外界環(huán)境響應(yīng)的研究仍是針對該菌基礎(chǔ)研究的重點。

外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)是實現(xiàn)其在工業(yè)應(yīng)用上的重要途徑，而使用強并可控制的啟動子是外源蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，決定著工業(yè)生產(chǎn)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。

本文簡單介紹了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點和表達(dá)目的蛋白時使用的載體系統(tǒng)，重點介紹枯了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的重要組成部分——啟動子，并對啟動子的分類和克隆進行了詳細(xì)的敘述，最后總結(jié)了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的現(xiàn)狀及展望。

1 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的概述

早在100多年前，人們就開始對枯草芽孢桿菌進行研究，但早期的工作主要針對其分離鑒定、形態(tài)觀察及功能鑒定等進行研究。1958年，Spizizen［3］發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以在自然條件下形成感受態(tài)，攝入外源DNA，從而建立了枯草芽孢桿菌化學(xué)感受態(tài)制備方法。此后，隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)明，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)成為研究熱點。

枯草芽孢桿菌是一種存在著發(fā)育過程的原核生物，該菌在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中具有典型的生長規(guī)律，如生長延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期及芽孢發(fā)育期。芽孢桿菌通常是采用更換不同的σ因子的方式來實現(xiàn)細(xì)胞中不同基因的特異性表達(dá)?？莶菅挎邨U菌中的σ因子有多種［4］，其中σA、σB、σC、σD、σH、σI、σX、σW與枯草芽孢桿菌營養(yǎng)生長相關(guān)，且枯草芽孢桿菌中的σA相當(dāng)于大腸桿菌σ70，是營養(yǎng)生長最主要的σ因子，占σ因子總量的90%-95%，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄持家基因和孢子形成早期基因；而σE、σF、σG、σK與孢子形成有關(guān)?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)的另一特點是其分泌系統(tǒng)，由于枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，僅有一層細(xì)胞膜。因此，蛋白質(zhì)的分泌無需轉(zhuǎn)位至周質(zhì)空間（革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌需經(jīng)過此步驟）而直接通過細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞外。通過生物信息學(xué)的預(yù)測，枯草芽孢桿菌中共有294種蛋白質(zhì)被預(yù)測為分泌型蛋白質(zhì)［5］。根據(jù)分泌型蛋白有無典型的信號肽，可以將其分泌系統(tǒng)分為依賴信號肽的分泌途徑和不依賴信號肽的分泌途徑。由于對不依賴信號肽的分泌途徑的研究很少，且與依賴信號肽的分泌途徑不同，因此又將其稱為非典型分泌途徑［6］。

枯草芽孢桿菌中至少存在4種依賴信號肽的分泌途徑［7］：Sec分泌途徑（Sec-SRP cooperation pathway）、Tat分泌途徑（Twin-arginine translocation pathway）、ABC轉(zhuǎn)運子途徑（ATP-binding cassette transporters）、假菌絲蛋白輸出途徑（Pseudopilin export pathway）。Sec分泌途徑是枯草芽孢桿菌中的主要分泌途徑，經(jīng)此系統(tǒng)分泌的蛋白質(zhì)含有Sec型信號肽［8］；Tat分泌途徑一般只分泌已形成正確構(gòu)象的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，經(jīng)此系統(tǒng)分泌的蛋白質(zhì)含有Tat型信號肽［8］；ABC轉(zhuǎn)運子途徑主要用于細(xì)菌素等小分子的運輸［9］；假菌絲蛋白輸出途徑與枯草芽孢桿菌細(xì)胞感受態(tài)的形成有關(guān)［10］。雖然枯草芽孢桿菌有強的胞外蛋白分泌能力，但較遺憾的是外源蛋白在其體內(nèi)的表達(dá)量不高，主要原因有以下兩種：（1）枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)不成熟；（2）枯草芽孢桿菌野生型菌株本身會產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，容易造成目的蛋白的降解。

枯草芽孢桿菌應(yīng)用的最為廣泛的宿主菌是枯草168菌株，目前已經(jīng)知道該菌株可產(chǎn)生8種胞外蛋白酶（其中不包括一些未發(fā)現(xiàn)的蛋白酶），利用基因突變的方法失活枯草168菌株基因組上中性蛋白酶、堿性蛋白酶、金屬蛋白酶、胞內(nèi)蛋白酶、芽孢桿菌肽酶F以及中性蛋白酶B六種蛋白酶基因后，將該菌株命名為WB600，其蛋白酶活性仍保留野生型菌株的0.32%［11］。WB700是在WB600的基礎(chǔ)上將絲蛋白酶基因vpr在內(nèi)的7個蛋白酶基因全失活的突變株，其蛋白酶活力是野生菌株的0.1%。隨后，來自加拿大卡加利大學(xué)的Wong等［12］在WB700的基礎(chǔ)上，繼續(xù)將枯草桿菌的胞壁蛋白酶基因cwp失活，發(fā)展了在野生菌株的基礎(chǔ)上缺失了8個蛋白酶基因的胞外蛋白酶活性更低的WB800菌株。因此，現(xiàn)在用于外源表達(dá)目的蛋白常用的枯草桿菌菌株大部分使用的是枯草168系列的突變株。

2 枯草芽孢桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)

克隆載體和表達(dá)載體是基因重組技術(shù)的重要工具，在分子遺傳操作的所有領(lǐng)域中處于十分重要的地位。根據(jù)類型的不同可將其分為3類［13］：獨立自主復(fù)制的質(zhì)粒載體、整合型載體及噬菌體載體。下面主要介紹在枯草芽孢桿菌中常用的獨立自主復(fù)制質(zhì)粒載體和整合型載體。

2.1 獨立自主復(fù)制的質(zhì)粒載體

枯草芽孢桿菌168系列菌株目前已全部完成測序，成為研究枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，大部分的枯草芽孢桿菌不含有內(nèi)源性質(zhì)粒，如今常用的質(zhì)粒大部分來自于葡萄球菌和鏈球菌［14，15］。這些質(zhì)粒載體可在枯草芽孢桿菌中自主復(fù)制，根據(jù)其復(fù)制方式可分為滾環(huán)復(fù)制型載體（Rolling circle-type replication vectors）和θ復(fù)制型載體，大部分來自于革蘭氏陽性細(xì)菌的小的質(zhì)粒載體（＜12 kb）是通過滾環(huán)復(fù)制機制復(fù)制的，而一些大的質(zhì)粒載體是通過θ復(fù)制機制復(fù)制的。如最開始鑒定的來自于金黃色葡萄球菌的4個質(zhì)粒 pUB110，pC194，pE194和pT181都是通過滾環(huán)機制復(fù)制的。pUB110帶有卡那霉素的抗性基因，拷貝數(shù)較低，每個細(xì)胞中有30-50個拷貝［16］；pC194帶有氯霉素的抗性基因，拷貝數(shù)約為15［17］；pE194較特殊，是個溫度敏感性的質(zhì)粒載體，32℃正常復(fù)制，隨著溫度增加，拷貝數(shù)降低，45℃時停止復(fù)制，這為人們純化含有此類質(zhì)粒的細(xì)胞提供了一個思路。另一方面，pE194可以在細(xì)菌基因組上多個位點發(fā)生特異性整合，整合子可以通過抗性（紅霉素）和培養(yǎng)溫度（50℃）進行篩選［18，19］。pT181帶有四環(huán)素的抗性基因，每個細(xì)胞中約有20個拷貝［18］。

這些質(zhì)粒一般可以在枯草芽孢桿菌中自主復(fù)制，表達(dá)其抗性基因，但在傳代培養(yǎng)中仍存在許多問題，其中最大的問題是質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性［20］。質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性表現(xiàn)在細(xì)胞在無篩選壓力條件質(zhì)粒易丟失；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定包括質(zhì)粒DNA的重排、篩減和增加。質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性嚴(yán)重影響了其在枯草芽孢桿菌的研究應(yīng)用，如許多基因不能直接構(gòu)建在枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入宿主菌進行表達(dá)。然而，大腸桿菌分子遺傳操作成熟，不會產(chǎn)生質(zhì)粒不穩(wěn)定性現(xiàn)象，所以構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒載體是十分必要的，這樣就可以將外源基因在大腸桿菌中構(gòu)建完成后再轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中表達(dá)。目前常用的穿梭質(zhì)粒載體有 pEB10［21］、pEB20［22］、pEB60［22］、pUB18［23］、pUB19［24］和pWB980［24］等，詳細(xì)信息，見表1。

表1 常用的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體

2.2 整合型質(zhì)粒載體

芽孢桿菌中高效表達(dá)外源蛋白的最大障礙是構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌中通常不穩(wěn)定，解決這一問題的有效途徑是使用整合型載體?？莶菡闲唾|(zhì)粒載體一般含有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起點（通常為pBR322或其衍生質(zhì)粒）、抗性篩選標(biāo)記基因（常用于枯草的標(biāo)記基因有卡那霉素、氯霉素、紅霉素等）及一段或兩段整合基因（即與宿主細(xì)胞染色體序列同源的基因）。它的特點是限制性復(fù)制，即整合型質(zhì)粒只在大腸桿菌中有復(fù)制功能，轉(zhuǎn)入革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽孢桿菌中則無此功能，因此只有整合進宿主基因組中才能正常的表達(dá)目的基因。整合型質(zhì)粒載體根據(jù)其整合方式不同可分為單交換整合和雙交換整合。

2.2.1 單交換整合 通過一段位于外源基因某側(cè)的同源序列（與枯草芽孢桿菌基因組同源的序列），與枯草芽孢桿菌基因組的目標(biāo)序列發(fā)生同源重組，從而將外源基因整合到染色體上，單交換需要的同源臂較短，整合效率高且穩(wěn)定，不易發(fā)生逆整合（圖1）。

圖1 單交換整合型載體

2.2.2 雙交換整合 通過位于外源基因兩側(cè)的同源序列，與枯草芽孢桿菌基因組的目標(biāo)序列發(fā)生同源重組。為了提高雙交換的整合效率，其需要的同源臂長度至少要400-500 bp［25］，才能發(fā)生有效的重組；其次還需要考慮發(fā)生重組的線性雙鏈DNA的穩(wěn)定性。因為線性雙鏈DNA導(dǎo)入枯草芽孢桿菌體內(nèi)容易被AddAB解旋酶降解，但若在線性雙鏈DNA末端加上Chi位點（χBs，5'-AGCGG-3'）可以解決此問題［26，27］，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒載體時可以在克隆同源臂時引入Chi位點以提高重組效率。目前常用的雙交換整合型載體是通過amyE基因位點進行整合［28］，插入的外源基因破壞了amyE基因，宿主菌不能表達(dá)淀粉酶，從而可以通過功能平板和酶活測定來鑒定陽性重組子。另外，一些其他的整合型載體還可通過thrC位點進行整合，插入的外源基因破壞thrC基因，從而導(dǎo)致蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型［29］，以此來篩選重組子（圖2）。常見的整合型載體，見表2。

圖2 雙交換整合型載體

表2 常見的芽孢桿菌整合型載體

3 枯草表達(dá)系統(tǒng)的啟動子

啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動子是實現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵。

3.1 啟動子的分類

依照控制轉(zhuǎn)錄水平的高低，啟動子可以分為強啟動子和弱啟動子；從啟動子誘導(dǎo)機制上分類，啟動子可以分為組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、時期特異性啟動子及自誘導(dǎo)啟動子，下面著重介紹枯草芽孢桿菌中已發(fā)表的組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子［2］，并對時期特異性啟動子和自誘導(dǎo)啟動子做簡單的介紹。

3.1.1 組成型啟動子 組成型啟動子就是不需要任何誘導(dǎo)物，可以持續(xù)性表達(dá)目的蛋白的啟動子。這類啟動子啟動強度通常要求較強，且成本低，一些組成型啟動子常通過構(gòu)建胞內(nèi)或分泌表達(dá)載體表達(dá)目的蛋白。常用的枯草桿菌組成型啟動子有P43啟動子和噬菌體啟動子，其中P43啟動子是枯草桿芽孢菌胞苷脫氨酶（cdd）基因的啟動子，廣泛用于研究，該啟動子屬于重疊啟動子，分別由σA和σB識別，前者負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄持家基因和孢子形成早期基因，后者一般負(fù)責(zé)與脅迫相關(guān)的基因［35］。研究發(fā)現(xiàn)P43啟動子為強啟動子，啟動強度強于誘導(dǎo)型啟動子PsacB和PamyE，普遍作為表達(dá)載體的調(diào)控元件［36］。Yang等［37］通過啟動子誘捕系統(tǒng)（Promoter trap system）從地衣芽孢桿菌基因組中篩選到一個強啟動子Pshuttle-09，其強度是P43的8倍，在分析Pshuttle-09序列的基礎(chǔ)上，Yang等又構(gòu)建了一個人工雙啟動子Plaps，此啟動子的強度是P43的13倍，是目前應(yīng)用在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的最強的組成型啟動子。不過組成型啟動子也存在一些問題，如組成型表達(dá)載體不穩(wěn)定，表達(dá)量不易控制，不適合表達(dá)對宿主菌有害的或有毒性蛋白，另外重復(fù)使用同一種啟動子表達(dá)多個外源基因可能會引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象等。

3.1.2 誘導(dǎo)型啟動子 與組成型啟動子相比，誘導(dǎo)型啟動子可根據(jù)需要在特定的誘導(dǎo)條件，快速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的“開”與“關(guān)”。誘導(dǎo)型啟動子可以分為兩類：一類與環(huán)境應(yīng)答有關(guān)，如滲透壓、pH值、氧氣匱乏、低溫、熱休克等，在這些環(huán)境下，啟動子啟動相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，以適應(yīng)環(huán)境變化；另一類是化學(xué)誘導(dǎo)啟動子，即受化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)而提高相應(yīng)基因的表達(dá)量。下面主要介紹枯草芽孢桿菌中常用的幾個化學(xué)物誘導(dǎo)啟動子。

枯草芽孢桿菌中最常見的是受IPTG誘導(dǎo)的啟動子，IPTG能夠與大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白LacI結(jié)合，使得LacI從操縱位點上脫離，從而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)。最早應(yīng)用的是啟動子Pspac，由枯草芽孢桿菌噬菌體SPO1和大腸桿菌lac操縱子融合而成［38］。隨后Phan等［39］將熱激蛋白GroES和GroEL編碼序列的強啟動子與lac操縱子融合，構(gòu)成受IPTG誘導(dǎo)的啟動子Pgrac。Phan等［40］進一步通過優(yōu)化啟動子Pgrac的調(diào)控元件，構(gòu)建另一個更強的啟動子Pgrac100。雖然受IPTG誘導(dǎo)的啟動子強并且可控，但它存在以下3個缺點：（1）IPTG價格昂貴，且有毒性，不適宜進行大規(guī)模的外源蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)；（2）Pspac啟動強度仍然不夠，外源蛋白的表達(dá)量不是很高；（3）Pspac不屬于嚴(yán)緊的可控啟動子，從而導(dǎo)致在未加入誘導(dǎo)物IPTG的情況下，仍然有少量的重組蛋白表達(dá)。因而這些由IPTG誘導(dǎo)的啟動子不適用于工業(yè)上大規(guī)模蛋白酶的生產(chǎn)。

枯草芽孢桿菌中第2個啟動子系統(tǒng)是以木糖為誘導(dǎo)物的啟動子Pxyl。Pxyl由xylR編碼的阻遏蛋白嚴(yán)格控制表達(dá)，通過添加0.1%-2%的木糖，能夠誘導(dǎo)該啟動子的表達(dá)，木糖啟動子系統(tǒng)對代謝中的大部分代謝產(chǎn)物不敏感，不過卻受到葡萄糖的抑制［41］。

枯草芽孢桿菌中第3個啟動子系統(tǒng)是以蔗糖為誘導(dǎo)物的sacB啟動子，sacB基因是枯草芽孢桿菌基因組上受蔗糖誘導(dǎo)調(diào)控的基因，編碼外分泌的蔗糖果聚糖酶（Levansucrase）。其啟動子sacR轉(zhuǎn)錄起始是持續(xù)性的，不受蔗糖誘導(dǎo)的控制，但在無蔗糖的情況下，其表達(dá)強度比有蔗糖誘導(dǎo)時低100倍［42］。

這3個啟動子誘導(dǎo)系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中應(yīng)用廣泛，尤其是前兩個系統(tǒng)，常被用做外源蛋白高效表達(dá)的元件，但它們共同存在一個缺點就是所用的誘導(dǎo)物IPTG和木糖價錢昂貴，在工業(yè)生產(chǎn)中易增加成本，因此限制了在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。而蔗糖誘導(dǎo)啟動子的啟動強度相對較弱，無法在工業(yè)生產(chǎn)中高效表達(dá)目標(biāo)蛋白。

除了上述介紹的3種誘導(dǎo)啟動子外，枯草芽孢桿菌中還有受淀粉誘導(dǎo)的持續(xù)性表達(dá)的淀粉酶基因啟動子Pamy［36］，以及受磷酸［43］、檸檬酸鹽［44］、四環(huán)素［45］、枯草菌素［46］、細(xì)胞壁抗生素［47］和甘氨酸［48］等誘導(dǎo)的啟動子。此外，為了降低誘導(dǎo)物的成本以更利于工業(yè)化應(yīng)用，Heravi等［49］開發(fā)了以甘露醇為誘導(dǎo)物的表達(dá)系統(tǒng)。Yang等［14，50］利用麥芽糖為誘導(dǎo)物的啟動子Pglv構(gòu)建了表達(dá)系統(tǒng)。Reza等［51］通過施加環(huán)境壓力和葡萄糖匱乏構(gòu)建了PohrB表達(dá)系統(tǒng)。

3.1.3 時期特異性啟動子 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示基因表達(dá)是有時期依賴性的［52］。一些基因特異性的在對數(shù)生長期表達(dá)，而另外一些基因卻在菌體進入穩(wěn)定期后才被激活表達(dá)。應(yīng)用這些時期特異性表達(dá)基因的調(diào)控元件來表達(dá)外源基因，可以避免添加外源的誘導(dǎo)物。目前有兩個此類啟動子被用于外源基因的表達(dá)。一個是啟動子PrpsF，特異性在對數(shù)期表達(dá)，利用此啟動子已成功地將來源于C. perfringens的β-類毒素的基因進行了高效表達(dá)［53］。另一個使用的啟動子是在對數(shù)末期表達(dá)的PaprE。PaprE是σA依賴型的啟動子，且它的活性被高度控制。使用lacZ作為報告基因，將其與啟動子共同構(gòu)建在枯草桿菌整合型載體上，整合進枯草桿菌基因組進行外源蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的表達(dá)量約占總蛋白量的10%［54］。

3.1.4 自誘導(dǎo)啟動子 自誘導(dǎo)啟動子在工業(yè)生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。Lee等［55］運用蘇云金芽胞桿菌伴孢晶體蛋白基因cry3Aa的啟動子Pcry3Aa構(gòu)建了枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并且通過對此啟動子進行優(yōu)化，優(yōu)化后外源蛋白lacZ的表達(dá)量較優(yōu)化前提高了5倍。優(yōu)化后的Pcry3Aa啟動子可能會成為枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的一個強的備選啟動子。另外，Wenzel等［56］利用啟動子PmanP構(gòu)建了適合高細(xì)胞密度發(fā)酵的自誘導(dǎo)系統(tǒng)。這種新型的枯草芽孢桿菌自誘導(dǎo)系統(tǒng)在工業(yè)生產(chǎn)上將不僅可以提高外源蛋白的產(chǎn)量，還可以降低生產(chǎn)成本。

綜上所述，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的啟動子，見表3。

表3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的啟動子

3.2 啟動子克隆的方法

啟動子的研究一方面是為了得到有利于實際應(yīng)用的高強度啟動子；另一方面也有助于進一步了解基因組和遺傳特性。目前克隆啟動子的方法多種多樣，大致可分為兩種：一是用啟動子誘捕系統(tǒng)（即用到啟動子探針質(zhì)粒載體）篩選啟動子；另一種根據(jù)基因組信息結(jié)合計算機軟件預(yù)測直接用PCR擴增已知的基因啟動子，然后再進行后期生物實驗驗證，這種方法精確性較差。因此，對于篩選到的啟動子還需要進行進一步的優(yōu)化。

3.2.1 利用啟動子誘捕系統(tǒng)篩選啟動子 利用啟動子誘捕系統(tǒng)篩選啟動子是一種簡單有效且更加準(zhǔn)確的方法［37，57］。啟動子誘捕系統(tǒng)中最為核心的部分是構(gòu)建啟動子探針質(zhì)粒載體，這種載體通常由不含啟動子成分的報告基因和一個篩選標(biāo)記基因組成，只有當(dāng)內(nèi)源基因編碼區(qū)插入到載體上，序列中產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄本時報告基因才可能表達(dá)。在探針載體構(gòu)建時，報告基因的選擇至關(guān)重要。作為報告基因，它的全序列必須是已知的、已克隆研究過，另外報告基因的表達(dá)產(chǎn)物在宿主菌中不存在背景干擾，并且其表達(dá)產(chǎn)物的檢測應(yīng)簡單、快捷、靈敏度高、重復(fù)性好。目前常用的報告基因有以下幾種：（1）β-半乳糖苷酶基因：細(xì)菌β-半乳糖苷酶基因，尤其是來自于嗜熱芽孢桿菌的耐熱性的β-半乳糖苷酶基因被廣泛應(yīng)用，它能水解底物X-gal，利用藍(lán)白斑篩選可鑒定插入啟動子的陽性克隆。Yang等［37］利用來自于嗜熱芽孢桿菌的bgaB基因為報告基因構(gòu)建啟動子捕獲載體pShuttleF，從地衣芽孢桿菌的基因組中篩選出比P43表達(dá)強度強8倍的PShuttle-09啟動子；（2）氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報告基因（CAT） ：細(xì)菌CAT酶可以將乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素的3-羥基位上，而使宿主菌失去抗性，再通過檢測放射性標(biāo)記的底物實現(xiàn)量化。以CAT為報告基因檢測簡單，重現(xiàn)性好且靈敏度高。Harwood等［58］以氯霉素抗性基因為報告基因構(gòu)建啟動子捕獲載體，在枯草芽孢桿菌中克隆了一些啟動子片段。（3）綠色熒光蛋白報告基因（gfp） ：綠色熒光蛋白基因最初是從維多利亞發(fā)光水母（Aequorea victoria）中分離得到，在508 nm處自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物。GFP相對分子質(zhì)量小、對活細(xì)胞無毒害、熒光穩(wěn)定且檢測方法簡單直觀（通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測），加熱、變性劑及一般的蛋白酶均不能使GFP失活。GFP上述的優(yōu)點使其成為報告基因的后起之秀。目前已經(jīng)有多種GFP突變體，如藍(lán)色熒光蛋白（CFP）、黃色熒光蛋白（YFP）及加強型的熒光蛋白（EGFP）等。Gat等［57］以gfp和egfp基因為報告基因，通過啟動子誘捕載體從炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）中篩選出用于重組蛋白rPA表達(dá)的啟動子。此外，還有β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase）基因、酸性磷酸脂酶基因及熒光素酶基因等，在啟動子篩選中也應(yīng)用廣泛。

3.2.2 結(jié)合生物信息學(xué)和PCR技術(shù)克隆啟動子 應(yīng)用啟動子誘捕載體克隆啟動子無需知道基因的具體序列，可隨機篩選啟動子，這樣不用設(shè)計引物，可得到大量的啟動子片段。但這種方法需要構(gòu)建啟動子文庫，篩選工作量大。隨著生物信息學(xué)和PCR技術(shù)的發(fā)展，利用計算機軟件預(yù)測加上PCR擴增和后期的實驗驗證，從基因組中分離已知序列的啟動子逐漸成為熱門。

Wang等［59］在蘇云金芽胞桿菌的RNA測序結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用生物信息學(xué)預(yù)測未知基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，并將轉(zhuǎn)錄起始位點上游500 bp的核苷酸進行分析，尋找與之匹配的σ因子和轉(zhuǎn)錄因子的識別位點，從而判斷是否存在潛在的可開發(fā)的啟動子。使用PCR技術(shù)將選定的啟動子克隆并構(gòu)建到表達(dá)載體上，后期進一步通過實驗驗證這些選定的啟動子強度。在此基礎(chǔ)上，他們篩選出20個不同時期表達(dá)的啟動子，為蘇云金芽胞桿菌的分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用研究奠定了基石。

除了上述的普通PCR擴增啟動子外，還有常用反向PCR、銜接頭PCR及TAIL-PCR等方法擴增啟動子序列。

4 展望

目前，已有許多的原核基因和真核基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。已克隆的原核基因很多，如屬于分子遺傳學(xué)范疇的一些與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的抗性基因；與DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)的DNA重組、誘變、修復(fù)等相關(guān)基因；與基因表達(dá)及其調(diào)控有關(guān)的Sigma因子、Trna、正負(fù)調(diào)控基因等；與芽孢形成萌發(fā)的spoOA、spoIIG基因等；以及與蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白相關(guān)的cry、cyt基因等；甚至有些與感受態(tài)、蛋白分泌有關(guān)的Com、SecDF基因等。此外，還有一些工業(yè)生產(chǎn)用酶也成功在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，如堿性蛋白酶、中性蛋白酶A和B、α-淀粉酶、β-淀粉酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、β-半乳糖苷酶和真枯草多肽酶F等。

真核基因在原核生物中表達(dá)總是不理想，其主要原因一是原核生物中缺乏蛋白翻譯后修飾如糖基化等問題；二是枯草桿菌的胞外蛋白酶易降解真核基因產(chǎn)物。因此，其缺失蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌成為高表達(dá)外源蛋白的理想菌株。

基因表達(dá)體系是一個復(fù)雜的過程，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)比較，枯草表達(dá)系統(tǒng)還不是很成熟。近年來，科研工作者在枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)外源蛋白方面取得很大的進展，已建立一個有效的外源蛋白枯草表達(dá)系統(tǒng)。相比于傳統(tǒng)的大腸桿菌系統(tǒng)，枯草表達(dá)系統(tǒng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于它，但在蛋白表達(dá)純化和分泌活性蛋白方面則要明顯優(yōu)于大腸桿菌。實踐證明，枯草表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)多種可溶性的并具有生物活性的蛋白質(zhì)。在進一步發(fā)展和完善枯草表達(dá)系統(tǒng)過程中，勢必要不斷完善和擴大枯草芽孢桿菌載體系統(tǒng)和宿主系統(tǒng)，而在載體系統(tǒng)的改造過程中，啟動子調(diào)控元件起著重中之重的作用。因此，從啟動子出發(fā)，篩選新的強啟動子元件，構(gòu)建成熟高效的枯草表達(dá)系統(tǒng)，無論是在理論研究還是實際生產(chǎn)中都有十分重要的意義。

［1］Harwood CR， Wipat A. Sequencing and functional analysis of thegenome of Bacillus subtilis strain 168 ［J］. FEBS Lett， 1996， 389（1）：84-87.

［2］張曉舟. 枯草桿菌新型表達(dá)系統(tǒng)和遺傳操作體系的建立及應(yīng)用［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006.

［3］Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1958，44（10）：1072.

［4］Haldenwang WG. The sigma factors of Bacillus subtilis ［J］. Microbiological Reviews， 1995， 59（1）：1-30.

［5］Tjalsma H， Bolhuis A， Jongbloed JD， et al. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis：a genome-based survey of the secretome ［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2000，64（3）：515-547.

［6］Bendtsen JD， Kiemer L， Fausb?ll A， et al. Non-classical protein secretion in bacteria ［J］. BMC Microbiology， 2005， 5（1）：58.

［7］Tjalsma H， Antelmann H， Jongbloed JD， et al. Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis：separating the “secrets” of the secretome ［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2004，68（2）：207-233.

［8］Fu LL， Xu ZR， Li WF， et al. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis：Implication for optimization of heterologous protein secretion ［J］. Biotechnology Advances， 2007， 25（1）：1-12.

［9］Banerjee S， Hansen JN. Structure and expression of a gene encoding the precursor of subtilin， a small protein antibiotic ［J］. Journal of Biological Chemistry， 1988， 263（19）：9508-9514.

［10］Chung Y， Breidt F， Dubnau D. Cell surface localization and processing of the ComG proteins， required for DNA binding during transformation of Bacillus subtilis ［J］. Molecular Microbiology，1998， 29（3）：905-913.

［11］Wu XC， Lee W， Tran L， et al. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases ［J］. Journal of Bacteriology， 1991， 173（16）：4952-4958.

［12］ Murashima K， Chen CL， Kosugi A， et al. Heterologous production of Clostridium cellulovorans engB， using protease-deficient Bacillus subtilis， and preparation of active recombinant cellulosomes［J］. Journal of Bacteriology， 2002， 184（1）：76-81.

［13］ Plasmids SB， Harwood CR， Cutting SM（eds）//Molecular biological methods for Bacillus ［J］. New York：John Wiley and Sons， 1990：75-174.

［14］ Yang MM， Zhang WW， Zhang XF， et al. Construction and characterization of a novel maltose inducible expression vector in Bacillus subtilis ［J］. Biotechnology Letters， 2006， 28（21）：1713-1718.

［15］ Kunst F， Ogasawara N， Moszer I， et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis ［J］. Nature， 1997， 390（6657）：249-256.

［16］ Lacey R， Chopra I. Genetic studies of a multi-resistant strain of Staphylococcus aureus ［J］. Journal of Medical Microbiology， 1974，7（2）：285-297.

［17］Iordanescu S， Surdeanu M， Della-Latta P， et al. Incompatibility and molecular relationships between small staphylococcal plasmids carrying the same resistance marker ［J］. Plasmid， 1978， 1（4）：468-479.

［18］Iord?nescu S. Three distinct plasmids originating in the same Staphylococcus aureus strain ［J］. Archives Roumaines de Pathologie Expérimentales et de Microbiologie， 1976， 35（1-2）：111.

［19］Hofemeister J， Israeli-Reches M， Dubnau D. Integration of plasmid pE194 at multiple sites on the Bacillus subtilis chromosome ［J］. Molecular and General Genetics MGG， 1983， 189（1）：58-68.

［20］Bron S， Meijer W， Holsappel S， et al. Plasmid instability and molecular cloning in Bacillus subtilis ［J］. Research in Microbiology， 1991， 142（7）：875-883.

［21］Bron S， Luxen E， Swart P. Instability of recombinant pUB110 plasmids in Bacillus subtilis：plasmid-encoded stability function and effects of DNA inserts ［J］. Plasmid， 1988， 19（3）：231-241.

［22］Nagarajan V， Albertson H， Chen M， et al. Modular expression and secretion vectors for Bacillus subtilis ［J］. Gene， 1992， 114（1）：121-126.

［23］Wang LF， Wong SL， Lee SG， et al. Expression and secretion of human atrial natriuretic α-factor in Bacillus subtilis using the subtilisin signal peptide ［J］. Gene， 1988， 69（1）：39-47.

［24］Wu SC， Wong SL. Development of improved pUB110-based vectors for expression and secretion studies in Bacillus subtilis ［J］. Journal of Biotechnology， 1999， 72（3）：185-195.

［25］Melnikov A， Youngman PJ. Random mutagenesis by recombinational capture of PCR products in Bacillus subtilis and Acinetobactercalcoaceticus ［J］. Nucleic Acids Research， 1999， 27（4）：1056-1062.

［26］Chédin F， Noirot P， Biaudet V， et al. A five-nucleotide sequence protects DNA from exonucleolytic degradation by AddAB， the RecBCD analogue of Bacillus subtilis ［J］. Molecular Microbiology，1998， 29（6）：1369-1377.

［27］Chedin F， Ehrlich SD， Kowalczykowski SC. The Bacillus subtilis AddAB helicase/nuclease is regulated by its cognate Chi sequence in vitro ［J］. Journal of Molecular Biology， 2000， 298（1）：7-20.

［28］Hidenori S， Henner DJ. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis ［J］. Gene， 1986， 43（1）：85-94.

［29］Guérout-Fleury AM， Frandsen N， Stragier P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis ［J］. Gene， 1996， 180（1）：57-61.

［30］Vagner V， Dervyn E， Ehrlich SD. A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis ［J］. Microbiology， 1998， 144（11）：3097-3104.

［31］Kaltwasser M， Wiegert T， Schumann W. Construction and application of epitope-and green fluorescent protein-tagging integration vectors for Bacillus subtilis ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（5）：2624-2628.

［32］Feucht A， Lewis PJ. Improved plasmid vectors for the production of multiple fluorescent protein fusions in Bacillus subtilis ［J］. Gene，2001， 264（2）：289-297.

［33］Lewis PJ， Marston AL. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis ［J］. Gene，1999， 227（1）：101-109.

［34］Yuan G， Wong SL. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence（CIRCE） ［J］. Journal of Bacteriology， 1995， 177（19）：5427-5433.

［35］Zhang XZ， Cui ZL， Hong Q， et al. High-level expression and secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（7）：4101-4103.

［36］Ye RQ， Kim JH， Kim BG， et al. High-level secretory production of intact， biologically active staphylokinase from Bacillus subtilis ［J］. Biotechnology and Bioengineering， 1999， 62（1）：87-96.

［37］Yang MM， Zhang W， Ji SY， et al. Generation of an artificial double promoter for protein expression in Bacillus subtilis through a promoter trap system ［J］. PLoS One， 2013， 8（2）：9.

［38］Yansura DG， Henner DJ. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1984， 81（2）：439-443.

［39］Phan TTP， Nguyen HD， Schumann W. Novel plasmid-based expression vectors for intra-and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis ［J］. Protein Expression and Purification， 2006， 46（2）：189-195.

［40］Phan TTP， Nguyen HD， Schumann W. Development of a strong intracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements ［J］. Journal of Biotechnology， 2012， 157（1）：167-172.

［41］Kim L， Mogk A， Schumann W. A xylose-inducible Bacillus subtilis integration vector and its application ［J］. Gene， 1996， 181（1）：71-76.

［42］Zukowski MM， Miller L. Hyperproduction of an intracellular heterologous protein in a sacU sup hsup mutant of Bacillus subtilis［J］. Gene， 1986， 46（2）：247-255.

［43］Lee JK， Edwards CW， Hulett FM. Bacillus licheniformis APase I gene promoter：a strong well-regulated promoter in B. subtilis ［J］. Journal of General Microbiology， 1991， 137（5）：1127-1133.

［44］Yamamoto H， Murata M， Sekiguchi J. The CitST two-component system regulates the expression of the Mg-citrate transporter in Bacillus subtilis ［J］. Molecular Microbiology， 2000， 37（4）：898-912.

［45］Geissend?rfer M， Hillen W. Regulated expression of heterologous genes in Bacillus subtilis using the Tn10 encodedtet regulatory elements ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 1990， 33（6）：657-663.

［46］Bongers RS， Veening JW， Van Wieringen M， et al. Development and characterization of a subtilin-regulated expression system in Bacillus subtilis：strict control of gene expression by addition of subtilin ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（12）：8818-8824.

［47］Toymentseva AA， Schrecke K， Sharipova MR， et al. The LIKE system， a novel protein expression toolbox for Bacillus subtilis based on the liaI promoter ［J］. Microbial Cell Factories， 2012， 11（1）：143.

［48］Phan TTP， Schumann W. Development of a glycine-inducible exp-ression system for Bacillus subtilis ［J］. Journal of Biotechnology，2007， 128（3）：486-499.

［49］Heravi KM， Wenzel M， Altenbuchner J. Regulation of mtl operon promoter of Bacillus subtilis：requirements of its use in expression vectors ［J］. Microbial Cell Factories， 2011， 10：83.

［50］Yang MM， Zhang WW， Chen YL， et al. Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv promoter ［J］. Microbial Cell Factories， 2010， 9（1）：55.

［51］Panahi R， Vasheghani-Farahani E， Shojaosadati SA， et al. Induction of Bacillus subtilis expression system using environmental stresses and glucose starvation ［J］. Annals of Microbiology， 2014， 64（2）：879-882.

［52］Blom EJ， Ridder AN， Lulko AT， et al. Time-resolved transcriptomics and bioinformatic analyses reveal intrinsic stress responses during batch culture of Bacillus subtilis ［J］. PLoS One， 2011， 6（11）：e27160.

［53］Nijland R， Lindner C， Van Hartskamp M， et al. Heterologous production and secretion of Clostridium perfringens β-toxoid in closely related Gram-positive hosts ［J］. Journal of Biotechnology，2007， 127（3）：361-372.

［54］Jan J， Valle F， Bolivar F， et al. Construction of protein overproducer strains in Bacillus subtilis by an integrative approach ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2001， 55（1）：69-75.

［55］Lee SJ， Pan JG， Park SH， et al. Development of a stationary phasespecific autoinducible expression system in Bacillus subtilis ［J］. Journal of Biotechnology， 2010， 149（1）：16-20.

［56］Wenzel M， Müller A， Siemann-Herzberg M， et al. Self-inducible Bacillus subtilis expression system for reliable and inexpensive protein production by high-cell-density fermentation ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（18）：6419-6425.

［57］Gat O， Inbar I， Aloni-Grinstein R， et al. Use of a promoter trap system in Bacillus anthracis and Bacillus subtilis for the development of recombinant protective antigen-based vaccines ［J］. Infection and Immunity， 2003， 71（2）：801-813.

［58］Harwood CR， Williams DM， Lovett PS. Nucleotide sequence of a Bacillus pumilus gene specifying chloramphenicol acetyltransferase［J］. Gene， 1983， 24（2）：163-169.

［59］Wang J， Ai X， Mei H， et al. High-throughput identification of promoters and screening of highly active promoter-5’-UTR DNA region with different characteristics from Bacillus thuringiensis ［J］. PLoS One， 2013， 8（5）：e62960.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of Bacillus subtilis Expression System and Its Promoter Regulatory Elements

Yu Xiaoxia Tian Jian Liu Xiaoqing Wu Ningfeng
（Institute of Biotechnology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）

As a Gram-positive bacteria， Bacillus subtilis is an attractive host for the production of heterologous secretory proteins for several reasons：it is non-pathogenic and the capable of secreting functional extracellular proteins directly to the culture medium， a great deal of vital information concerning large scale fermentation and production technology. One of the key factors for achieving high-level expression of heterologous proteins is the use of a strong and control promoter. In present， the promoters of Bacillus subtilis can be classified into three categories：constitutive promoters， inducer-specific promoters and autoinducible promoters. This paper described the advantages and disadvantages of Bacillus subtilis expression system and the classification of promoters. At the same time， we summarized the methods of the amplification of new promoters， which provided a foundation for improving Bacillus subtilis expression systems and the industrial production of heterologous proteins .

Bacillus subtilis；expression system；constitutive promoters；inducible promoters

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.005

2014-07-10

國家“863計劃”項目（2014AA021303）

余小霞，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：yuxiaoxia198921@sina.com

伍寧豐，研究員，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：wuningfeng@caas.cn