王龑劉陽(yáng)劉伊寧

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

產(chǎn)毒真菌基因組研究進(jìn)展

王龑1，2劉陽(yáng)1，2劉伊寧1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，以木霉、曲霉、毛霉、青霉和根霉為主的絲狀真菌是農(nóng)產(chǎn)品中常見的產(chǎn)毒真菌。闡明農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒致病微生物的基因組序列信息是揭示真菌特殊遺傳性狀的基礎(chǔ)。截至2013年12月，共有子囊菌門中204個(gè)種和擔(dān)子菌門中62個(gè)種的基因組序列已經(jīng)測(cè)序或公布，它們的基因組大小大部分在30-40 Mb。整理了部分已完成基因組測(cè)序的具有產(chǎn)毒能力或致病力的真菌基因組信息，并對(duì)真菌測(cè)序方案、主要產(chǎn)毒真菌及其比較基因組學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

真菌；真菌毒素；農(nóng)產(chǎn)品；基因組；比較基因組學(xué)

真菌毒素是天然產(chǎn)生的毒素，主要包括黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，真菌毒素能夠污染幾乎所有種類的食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品，在我國(guó)，小麥、玉米、稻谷、花生等糧油產(chǎn)品受真菌毒素污染情況嚴(yán)重，此外，奶制品、堅(jiān)果、干果、香辛料、水果等食品也易受到污染［1］。由于真菌毒素具有強(qiáng)毒性和致癌性，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成了巨大的威脅［2］。農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素污染問(wèn)題已成為世界各國(guó)高度關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)。因此，合理控制和預(yù)防產(chǎn)毒真菌對(duì)于保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要意義。真菌基因組的闡明將為真菌特性的分析提供強(qiáng)有力的依據(jù)，為揭示真菌特殊性狀的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。對(duì)于深入解析種植、生長(zhǎng)、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)毒真菌菌群的發(fā)生和形成，真菌毒素的合成路徑及其調(diào)控機(jī)制、產(chǎn)毒真菌與農(nóng)產(chǎn)品互作、危害儲(chǔ)糧品質(zhì)的機(jī)理具有深遠(yuǎn)的實(shí)際意義。

最近10年來(lái)真菌基因組學(xué)研究發(fā)生根本性的變化，真菌已成為真核生物基因組研究的最佳模式生物。本研究整理了部分已完成基因組序列測(cè)定的具有產(chǎn)毒能力真菌的信息，并對(duì)真菌測(cè)序方案、真菌毒素主要產(chǎn)毒菌及其比較基因組學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 基因組研究技術(shù)進(jìn)展

真菌多樣性豐富，基因組具有相對(duì)較小、重復(fù)序列高、易于突變等特點(diǎn)，因此，真菌基因組的測(cè)序研究是很有必要的。通過(guò)真菌基因組學(xué)的研究可以了解真菌各種代謝過(guò)程、遺傳機(jī)制和生命活動(dòng)所需要的基本條件，以及微生物特殊功能如致病性的遺傳基礎(chǔ)等［3，4］。

真菌基因組測(cè)序分為基因組從頭測(cè)序（De novo）和基因組重測(cè)序（Genome re-sequencing）。基因組從頭測(cè)序是指不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對(duì)某個(gè)微生物物種進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼裝，從而獲得該真菌的基因組圖譜［5］?；蚪M重測(cè)序是對(duì)基因組序列已知的真菌進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體水平或群體水平進(jìn)行差異性分析的方法。真菌基因組重測(cè)序能夠檢測(cè)全基因組的罕見變異。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代。第一代Sanger測(cè)序法，基本原理是基因組DNA經(jīng)酶切后的片段亞克隆至2 kb 的小文庫(kù)和10-20 kb 的大文庫(kù)中。從兩端開始對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序（即正義鏈和負(fù)義鏈），然后組裝成連續(xù)的疊連群（Contigs），最終形成完整的基因組［5］。第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis），即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，在Sanger測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，用不同顏色的熒光標(biāo)記4種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息?，F(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 FLX、Illumina/ Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems SOLID system［6］。這3個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454FLX的測(cè)序片段比較長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)（Read）能達(dá)到400 bp；Solexa測(cè)序性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測(cè)序的1/10；SOLID測(cè)序的準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15×覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%，是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。第三代基因測(cè)序技術(shù)即基于納米孔的單分子讀取技術(shù)。熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。單分子的DNA聚合酶被固定在直徑只有幾十納米的納米孔內(nèi)，當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，即熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止［5，7］。第三代測(cè)序技術(shù)主要有3個(gè)優(yōu)勢(shì)：一是實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬(wàn)倍；二是實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列，讀長(zhǎng)達(dá)幾千個(gè)堿基；三是測(cè)序精度非常高，達(dá)到99.9999%。此外，第三代測(cè)序可以直接測(cè)RNA的序列，大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差；可以直接測(cè)甲基化的DNA序列，通過(guò)DNA聚合酶復(fù)制堿基時(shí)停頓的時(shí)間不同，判斷模板的C堿基是否甲基化［7］。

2 常見重要致病真菌基因組信息

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序服務(wù)的普及，大量真菌基因組陸續(xù)完成測(cè)序和注釋，截止到2013年12月，在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共有子囊菌門（Ascomycota）中204個(gè)種的基因組序列和擔(dān)子菌門（Basidiomycete）中62個(gè)種的基因組序列已經(jīng)公布。子囊菌門中公布的基因組序列包括盤菌亞門（Pezizomycotina）的145個(gè)種和酵母亞門（Saccharomycotina）的59個(gè)種。

最早完成測(cè)序的種屬一般都是具有某一生物學(xué)功能并用于工業(yè)化生產(chǎn)的。真菌的基因組測(cè)序工作是從酵母開始的，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces pombe）是食品工業(yè)的常見菌，用于面包、酒類生產(chǎn)；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是生物學(xué)研究的模式菌株，分別在1965年、1997年、2002年和2003年測(cè)序完成［8-10］。米曲霉（Aspergillus orzaye）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的全基因組序列于2005 年完成測(cè)序和注釋［11，12］。黑曲霉（Aspergillus niger）、 棒 曲 霉（Aspergillus clavatus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）和土曲霉（Aspergillus terreus）等絲狀真菌基因組序列也相繼完成測(cè)序和/或注釋［4，13］。除曲霉屬外，產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）和鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的基因組也陸續(xù)完成測(cè)序［14］。表1 列出了已經(jīng)完成的一些農(nóng)產(chǎn)品中常見致病真菌的基因組測(cè)序、注釋的相關(guān)信息［8-10］。這些真菌的基因組大小大部分為 30-40 Mb，進(jìn)一步進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，將有助于了解真菌的生物特性，解決農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重大問(wèn)題。

表1 農(nóng)產(chǎn)品中常見致病真菌的基因組信息

3 部分完成全基因組序列測(cè)定的真菌

3.1 曲霉菌（Aspergillus）

曲霉菌屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌亞門（Pezizomycotina），目前測(cè)序研究的主要有曲霉屬9個(gè)種。棒曲霉生長(zhǎng)在土壤、霉果皮、動(dòng)物糞等基物上，產(chǎn)生可能使人類和動(dòng)物致病的棒曲霉素（Patulin）；黃曲霉感染花生、玉米等谷物，產(chǎn)生高致癌的黃曲霉素（Aflatoxin）威脅人畜類健康；煙曲霉感染玉米和豆粕等谷物，是臨床上重要的條件致病真菌，過(guò)敏體質(zhì)者、器官移植患者及免疫缺陷患者等更易感染；米曲霉產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和植酸酶等復(fù)合酶，是生產(chǎn)在大腸桿菌中不能表達(dá)的真核生物活性蛋白的理想載體；黑曲霉用于工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸、藥品、酶和食品，大部分菌株都產(chǎn)生有機(jī)酸和水解酶，部分菌株具有致病力，產(chǎn)生赭曲霉毒素（Ochratoxin）；白曲霉用于釀造燒酒，白曲霉生長(zhǎng)在蒸熟的谷物培養(yǎng)基上，分泌多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖類，與黑曲霉不同，白曲霉不產(chǎn)生赭曲霉毒素；構(gòu)巢曲霉能誘導(dǎo)產(chǎn)生異核體或二倍體、有性和無(wú)性孢子，是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究的模式生物之一；土曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物——他?。↙ovastatin），臨床上被廣泛應(yīng)用于心臟病預(yù)防。這些曲霉近緣種的基因組大約為30-37 Mb，分布于5或8條染色體。

3.1.1 黃曲霉 黃曲霉菌是一種自然界中常見霉菌，其嚴(yán)重威脅人畜健康。黃曲霉普遍存在于花生、玉米或黃豆中，對(duì)作物造成嚴(yán)重霉害；同時(shí)會(huì)產(chǎn)生高致癌、致畸毒性的黃曲霉素（Aflatoxin）。黃曲霉素主要有B1、B2、G1、G2，以及另外兩種代謝產(chǎn)物M1、M2。其中AFB1是最危險(xiǎn)的致癌物，在玉米、花生、棉花種子以及一些干果中常被檢測(cè)到。黃曲霉為單倍體，產(chǎn)生無(wú)性孢子，基因組約36 Mb，分布于8條染色體。

3.1.2 煙曲霉 煙曲霉在潮濕環(huán)境中普遍存在，可侵染棉鈴和蘋果等，引起果實(shí)腐爛，或寄藏于種子上，造成農(nóng)產(chǎn)品單位產(chǎn)量和質(zhì)量的下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于煙曲霉作為重要的人類致病菌，煙曲霉的基因組2005年被測(cè)序完成，在最近12年中煙曲霉導(dǎo)致的疾病發(fā)生率增加了14倍，尤其是過(guò)敏體質(zhì)者、器官移植患者、艾滋病毒攜帶者、艾滋病患者、慢性肉芽腫病及重癥聯(lián)合免疫缺陷等患者更易感染。煙曲霉對(duì)其他哺乳動(dòng)物也產(chǎn)生致病性，研究表明煙曲霉可以導(dǎo)致鳥類肺部和氣囊感染。基因組測(cè)序分析將有助于理解煙曲霉的生物學(xué)特性，識(shí)別煙曲霉致病性的分子機(jī)制。煙曲霉基因組約30 Mb，分布于8個(gè)染色體，可能有9 900-11 000個(gè)基因。

3.1.3 棒曲霉 棒曲霉可生長(zhǎng)在土壤、果皮、動(dòng)物糞便等基質(zhì)物上，能夠產(chǎn)生使人類和動(dòng)物畸變、癌變的棒曲霉素（Patulin）。目前這種毒素在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中均有被發(fā)現(xiàn)，并引起世界各衛(wèi)生組織極大的關(guān)注。棒曲霉與煙曲霉、土曲霉這兩大病原真菌親緣關(guān)系較近。棒曲霉為單倍體，基因組約28 Mb，分布于 5條染色體，大約有9 323個(gè)基因。

3.1.4 構(gòu)巢曲霉 構(gòu)巢曲霉也稱為小巢狀曲菌（Emericella nidulans），通常為單倍體，但能誘導(dǎo)為異核體或二倍體，產(chǎn)生有性和無(wú)性孢子，而其他大部分曲霉是無(wú)性的。構(gòu)巢曲霉菌屬于同宗配合菌，即任何兩個(gè)菌株間均可直接進(jìn)行交配產(chǎn)生子囊孢子。目前構(gòu)巢曲霉是遺傳學(xué)和生物化學(xué)上研究得最廣泛的生物之一，已經(jīng)得到了數(shù)百個(gè)基因的突變株。構(gòu)巢曲霉也是研究細(xì)胞生物學(xué)的模式生物之一，它還用來(lái)表達(dá)哺乳動(dòng)物基因。構(gòu)巢曲霉中的乙醇脫氫酶基因lacA可調(diào)控啟動(dòng)子，能夠被乙醇誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)又能被葡萄糖抑制，是基因表達(dá)調(diào)控中重要的工具元件。研究構(gòu)巢曲霉基因組將有助于了解構(gòu)巢曲霉的生物學(xué)特性，與寄主的相互作用以及曲霉菌的致病性，還能促進(jìn)疫苗和藥物的研制開發(fā)。構(gòu)巢曲霉與黑曲霉、米曲霉、黃曲霉和煙曲霉等親緣關(guān)系較近。構(gòu)巢曲霉基因組約31 Mb，分布于8條染色體，含11 000-12 000個(gè)基因。

3.1.5 黑曲霉 黑曲霉用于工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸、藥品、酶和食品。黑曲霉具有表型多樣性，在全球均有發(fā)現(xiàn)，包括海洋和陸地菌株，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，大部分菌株都產(chǎn)生有機(jī)酸和水解酶，有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯，部分菌株具有致病力，產(chǎn)生赭曲霉毒素（Ochratoxin）。生長(zhǎng)適溫37℃，最低相對(duì)濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變。黑曲霉基因組約34 Mb，分布于8條染色體，含10 947個(gè)基因。

3.1.6 白曲霉（Aspergillus kawachii） 白曲霉用于釀造燒酒，是日本傳統(tǒng)的蒸餾酒，原料主要包括大米、大麥、番薯、馬鈴薯和蕎麥。在生產(chǎn)燒酒的過(guò)程中，白曲霉生長(zhǎng)在蒸熟的谷物培養(yǎng)基上，分泌的酶包括各種多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖類。白曲霉與黑曲霉在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近，在食品生產(chǎn)工業(yè)上使用，能夠產(chǎn)生大量的檸檬酸防止細(xì)菌污染。但是，與黑曲霉不同，不產(chǎn)生赭曲霉毒素。白曲霉基因組大小約36.5 Mb，含有11 475個(gè)基因。

3.1.7 土曲霉 絲狀真菌土曲霉能夠產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物他汀。在過(guò)去10年中，他汀類降膽固醇藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用于心臟病預(yù)防。目前應(yīng)用的5個(gè)他汀類藥物中，土曲霉能發(fā)酵產(chǎn)生其中3個(gè)：普伐他汀（Pravastatin），辛伐他汀（Simvastatin）和洛伐他?。↙ovastatin）。此外，土曲霉也能產(chǎn)生對(duì)人類和其他動(dòng)物有害的棒曲霉素（Patulin）和橘霉素（Citrinin）。土曲霉是單倍體，基因組大約35 Mb，分布于 8條染色體，可能含有996個(gè)基因。

3.2 灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）

灰葡萄孢霉是一種植物致病菌，可引起灰霉腐?。℅ray mold rot）或灰霉病（Botrytis blight），感染超過(guò)200種植物，包括大部分的蔬菜、水果、多種喬木、灌木、花卉和雜草?；移咸焰呙乖谌蛟斐傻霓r(nóng)作物損失占全部損失的20%，每年約有10-100億歐元。在特定環(huán)境下，灰葡萄孢霉可造成葡萄貴腐（Noble rot），這是釀造貴腐酒等餐后甜酒必需的?；移咸焰呙故墙z狀真菌單倍體，基因組約38 Mb，分布于30個(gè)染色體，可能有11 000-17 000個(gè)基因。

3.3 鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）

鏈格孢菌是無(wú)性生殖有絲真菌，在蕓苔屬植物上引起黑斑病，包括花椰菜、甘藍(lán)、油菜和芥菜上均會(huì)發(fā)病，侵害葉、莖、莢。葉片染病病斑圓形至橢圓形，黑褐色，大小2-5 mm，具同心輪紋，濕度大時(shí)，病部生有黑灰色霉?fàn)钗?，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。病菌以菌絲體或分生孢子在病殘?bào)w或留種株上越冬，也可以分生孢子附著在種子表面越冬，翌年以分生孢子進(jìn)行初侵染和再侵染，借氣流傳播致病，一般發(fā)生在農(nóng)作物的夏季生長(zhǎng)期。在采后油菜作物上因?yàn)殒湼矜呔鸬膿p失達(dá)60%以上。鏈格孢菌基因組約29.6 Mb，分布于9條染色體。

3.4 鐮刀菌

3.4.1 輪狀鐮刀霉菌（Fusarium verticillioides） 輪狀鐮刀霉菌又稱為串珠狀赤霉（Gibberella moniliformis），是全球性感染玉米的真菌。一定的環(huán)境條件，串珠鐮刀菌使玉米內(nèi)核和穗腐爛，導(dǎo)致農(nóng)作物重大的經(jīng)濟(jì)損失。串珠狀赤霉也產(chǎn)生致癌物伏馬菌素（Fumonisin mycotoxins）。如果食用了含伏馬菌素的玉米可引起人類和動(dòng)物多種疾病。串珠狀赤霉是單倍體，基因組約46 Mb，分布于11條染色體，可能含有16 000個(gè)基因。

3.4.2 禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum） 禾谷鐮刀菌又稱為玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae），是小麥和大麥赤霉病的病原體。我國(guó)每年小麥赤霉病受害面積在4 00×104hm2以上，重發(fā)區(qū)已經(jīng)由長(zhǎng)江中下游向北擴(kuò)展到山東、河南、河北等小麥主產(chǎn)區(qū)，2010年發(fā)病面積甚至超過(guò)約0.667×108hm2，給小麥生產(chǎn)造成巨大損失，嚴(yán)重影響籽粒品質(zhì)。鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol）嚴(yán)重威脅食品安全。DON毒素具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和胚胎毒性，能引起人類食管癌、IgA腎病、克山病和大骨節(jié)病等。玉蜀黍赤霉還產(chǎn)生對(duì)人類及動(dòng)物健康造成嚴(yán)重危害的嘔吐毒素（Vomitoxin）。玉蜀黍赤霉基因組約40 Mb，分布于4條染色體，可能有11 000-14 000個(gè)基因。

3.5 青霉（Penicillium）

3.5.1 指狀青霉（Penicillium digitatum） 指狀青霉是一種腐生真菌，是橘科水果采后重要的致病菌，能引起柑橘類綠霉?。–itrus green mould），世界范圍內(nèi)90%的橘類水果損失是由指狀青霉引起的。指狀青霉的基因組測(cè)序有助于闡釋致病機(jī)制的遺傳基礎(chǔ)和高度的宿主特異性，檢測(cè)刺激代謝物基因簇，包括吲哚二萜，棒曲霉素鈣激活鉀通道阻斷劑。指狀青霉基因組約26 Mb，大約含有9 000個(gè)基因。

3.5.2 產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum） 產(chǎn)黃青霉也稱為點(diǎn)青霉，是無(wú)性絲狀真菌，至今60年來(lái)一直用于生產(chǎn)青霉素，普遍的細(xì)菌類抗生素，是青霉素V和青霉素G商業(yè)的主要來(lái)源。菌株訓(xùn)化用于提高青霉素的產(chǎn)量，主要是擴(kuò)大基因組上產(chǎn)生青霉素的基因簇片段，目前青霉素的生物合成基因已經(jīng)被清楚的鑒定注釋了。產(chǎn)黃青霉是單倍體，基因組約34.1 Mb，分布于4條染色體，可能有11 000-12 000個(gè)基因。

3.6 稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）

稻瘟病菌無(wú)性型稱Pyricularia grisea，是單倍體絲狀菌，是稻瘟病的病原體。稻瘟病是一種世界性水稻病害，每年因此病害損失的糧食可供養(yǎng)6 000萬(wàn)人。由于水稻產(chǎn)量增加，近年來(lái)因稻瘟病造成的損失日益加大。雖然抗稻瘟病的水稻已經(jīng)研究出來(lái)，但稻瘟病菌可迅速產(chǎn)生抗性。除了水稻，某些稻瘟病菌還可感染大麥、小麥、珍珠粟和草坪。稻瘟病菌是一種理想的研究植物病原真菌和宿主相互作用的模式生物。稻瘟病菌基因組約40 Mb，分布于7條染色體。

3.7 粗糙脈孢菌

粗糙脈孢菌屬于子囊菌亞門脈孢菌屬（Neurospora），是一種多細(xì)胞絲狀真菌，是20世紀(jì)現(xiàn)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式物種。1941年Beadle和Tatum 兩位科學(xué)家通過(guò)X射線誘導(dǎo)處理粗糙脈孢菌，獲得了大量的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體，在對(duì)這些突變體研究分析以后，提出了一個(gè)基因?qū)?yīng)一種酶的假說(shuō)。粗糙脈孢菌是單倍體雌雄異體子囊菌，僅能識(shí)別藍(lán)光/紫外光范圍，子囊孢子減數(shù)分裂產(chǎn)物的有序重排有利于基因重組分析。粗糙脈孢菌基因組約有40 Mb，分布于7條染色體。

3.8 穎枯殼針孢（Phaeosphaeria nodorum）

穎枯殼針孢無(wú)性型稱Stagonospora nodorum，屬于子囊菌半知菌亞門（Deuteromycotina），分生孢子器散生，是小麥的主要病害，主要為害小麥未成熟穗部和莖稈，也為害葉片和葉鞘，引起有重大經(jīng)濟(jì)損害的禾草殼針孢葉斑病，也稱為小麥穎枯病。病害多發(fā)生于潮濕陰冷的氣候，多雨年份和潮濕地區(qū)發(fā)生尤其嚴(yán)重。穎枯殼針孢菌基因組約30 Mb，分布于24條染色體。

3.9 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）

核盤菌屬于子囊菌亞門核盤菌屬（Sclerotinia），是已知具有最廣泛宿主的真菌病原體，危害作物和蔬菜，它引起如菜豆菌核?。╓hite mold of bean），向日葵爛盤型菌核?。℉ead rot of sunflower），油菜菌核?。╓hite mold of canola）和大豆菌核?。⊿clerotinia stem rot of soybean）。核盤菌是研究寄主-病原物相互作用的模型。核盤菌是單倍體，基因組38 Mb，分布于3條染色體。

3.10 里氏木霉（Trichoderma reesei）

絲狀真菌里氏木霉是多細(xì)胞的真核微生物，屬于半知菌亞門木霉屬（Trichoderm），其作為工業(yè)菌株用于分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等。里氏木霉對(duì)人體無(wú)毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，適合用于工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶類。里氏木霉是單倍體，基因組33 Mb，分布于7條染色體。

3.11 禾柄銹菌（Puccinia graminis）

禾柄銹菌屬于擔(dān)子菌門，引起谷類作物，如小麥、燕麥、黑麥、大麥等的稈銹病。稈銹病，也稱為黑銹或稈黑銹病，是世界上最具破壞性的禾谷類作物病害。禾柄銹菌具有復(fù)雜的生命周期，包括5個(gè)孢子階段和兩個(gè)非常不同的宿主，即以雜草為初宿主，通常以小蘗屬植物為轉(zhuǎn)換寄主。因?yàn)槌跫闹鲗Ｒ恍?，禾柄銹菌有很多?；?，如Puccinia graminis f. sp.tritici可侵染小麥。禾柄銹菌為單倍體，基因組約80 Mb，分布于18條染色體。

3.12 玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）

玉米瘤黑粉菌是一種擔(dān)子菌，通常以一種絲狀菌絲體存在，異宗配合。常為害玉米葉、稈、雄穗和果穗等部位的幼嫩組織，產(chǎn)生大小不一的病瘤，是我國(guó)玉米上分布最廣的主要病害之一，北方發(fā)生較為普遍而嚴(yán)重。在玉米瘤黑粉菌的生活史中，有兩種不同形態(tài)的細(xì)胞，即單倍體細(xì)胞（擔(dān)孢子）和雙核菌絲體。單倍體細(xì)胞沒有致病性，在特定培養(yǎng)基上芽殖產(chǎn)生“酵母”狀菌落。不同遺傳型的單倍體細(xì)胞融合形成雙核菌絲，雙核菌絲能在寄主植物體內(nèi)迅速發(fā)育，刺激寄主組織形成腫瘤，并繼而經(jīng)過(guò)細(xì)胞核融合，產(chǎn)生雙倍體的冬孢子。玉米瘤黑粉菌基因組約20 Mb，分布于23條染色體。

4 真菌基因組研究的應(yīng)用及未來(lái)

比較基因組學(xué)（Comparative genomics）在對(duì)未知生物的基因組圖譜和測(cè)序基礎(chǔ)上，與已知基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，通過(guò)序列同源比對(duì)和計(jì)算機(jī)分析從而了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化。隨著已測(cè)序基因組數(shù)量的不斷增加，一方面，比較基因組學(xué)應(yīng)用于基因鑒別及基因表達(dá)的調(diào)控元件的研究［15］；另一方面，比較基因組學(xué)能夠幫助鑒定親緣關(guān)系較近的物種之間的區(qū)別，包括致病性、次級(jí)代謝模式或其他特性［13，16，17］。大量預(yù)測(cè)到的微生物代謝物的生物合成基因所反映的不是標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的，特殊條件下會(huì)激活這些基因。這些隱藏的基因簇大多編碼一些重要致病因子的生物合成，如毒素、藥物等，隨著高通量篩選平臺(tái)的發(fā)展，一些小分子在生物系統(tǒng)上的功能逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。基因組挖掘和宏基因組分析技術(shù)，與相關(guān)基因分析工具組合分析大的生物合成基因簇，在異源源系中高效克隆表達(dá)，揭開棘手的或神秘的化合物的面紗，這個(gè)跨學(xué)科的研究領(lǐng)域已經(jīng)打開了天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的新時(shí)代［18，19］。

基因組測(cè)序使得真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的鑒定快速發(fā)展，在絲狀真菌中，代謝相關(guān)基因一般是以基因簇（Genes clusters）的形式分布，經(jīng)過(guò)基因組注釋后，在曲霉屬真菌中至少發(fā)現(xiàn)了30-40個(gè)典型基因簇存在，這些基因簇一般與聚酮體或非核糖體多肽的合成相關(guān)?；诤Ａ啃畔⒑捅容^基因組學(xué)的基因組采礦技術(shù)（Genome mining）能夠挖掘和鑒別一些真菌基因組中未知蛋白功能，在模式微生物構(gòu)巢曲霉基因組隱藏的代謝途徑中分析發(fā)現(xiàn)了新的聚酮合酶-非核糖體肽合酶（PKS-NRPS）混合代謝物［3，20］。黑曲霉基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)精確的比對(duì)分析并結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)鑒定出了許多與DNA 復(fù)制、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)/胞外酶生產(chǎn)相關(guān)的蛋白，豐富了黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸的分子機(jī)制，同時(shí)預(yù)測(cè)出伏馬菌素和赭曲霉毒素A（OTA）合成的基因簇信息［4］。比較基因組學(xué)技術(shù)分析煙曲霉和米曲霉，提高了功能注釋和代謝途徑的模擬分析，分析表明3個(gè)物種間存在超過(guò)500個(gè)非編碼區(qū)域是保守的，為真菌基因組進(jìn)化和基因調(diào)控研究提供新的理解［13］。

真菌毒素合成主要通過(guò)聚酮代謝PKS（Polyketide synthase）、NRPS非核糖體多肽合成（Nonribosomal peptide synthetase）、PKS-NRPS混合代謝、萜類化合物代謝、氨基酸相關(guān)代謝。PKS和NRPSs在大多數(shù)真菌基因組中都存在，導(dǎo)致了許多次生代謝物的物種多樣性，通常參與生物合成同一種代謝產(chǎn)物的基因位于同一個(gè)基因簇［21］。在克隆了幾個(gè)重要的黃曲霉毒素合成基因之后，黃曲霉毒素合成基因簇在黃曲霉和寄生曲霉中被發(fā)現(xiàn)［22］，有30個(gè)基因參與黃曲霉毒素的生物合成，黃曲霉毒素合成基因集中位于三號(hào)染色體大約75 kb的區(qū)域內(nèi)，離端粒大約80 kb。碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和疣狀青霉（Penicillium verrucosum）都能夠產(chǎn)生OTA，有研究認(rèn)為PKS參與OTA合成的第一步，催化合成OTA的主體結(jié)構(gòu)異香豆素。進(jìn)化樹分析6個(gè)已知產(chǎn)OTA 菌株的PKSs序列的KS和AT結(jié)構(gòu)域，證實(shí)不同真菌OTA PKS酶結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的多樣性，KS和AT結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是PKS的保守區(qū)域，參與OTA的合成。Chiang等［3］采用基因組采礦技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)分析揭示了構(gòu)巢曲霉中一個(gè)含有兩個(gè)真菌聚酮合酶的基因簇編碼一個(gè)聚酮化合物。經(jīng)過(guò)比較基因組分析，在不同物種間僅有一小部分鑒定到的基因簇是保守的［23］。Callaghan等［24］采用基因組步移技術(shù)和序列比對(duì)分析，鑒定到在疣狀青霉上存在PKS基因，且與紅曲霉橘毒素合成基因簇同源性最高，在PKS上下游亦存在氧化還原蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與疣狀青霉OTA的合成。Atoui等［25］分析了9個(gè)赭曲霉和5個(gè)炭黑曲霉的KS結(jié)構(gòu)域序列，結(jié)果表明KS結(jié)構(gòu)域分布在5個(gè)不同的基因簇上，表明PKS基因具有不同的生物學(xué)功能。

Bhatnagar等［26］以解決黃曲霉毒素污染為例，綜述了采用基因組、蛋白組和代謝組的方法挖掘有用的信息，形成有效的戰(zhàn)略揭示真菌產(chǎn)生真菌毒素的機(jī)制，有助于開發(fā)具有真菌抗性的作物，減少作物的真菌毒素污染。Yu等［27］構(gòu)建黃曲霉菌絲cDNA表達(dá)文庫(kù)，采用表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）技術(shù)分析營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件對(duì)黃曲霉毒素合成的影響，從7 218個(gè)表達(dá)序列中鑒定到110個(gè)序列影響黃曲霉毒素的合成。2011年，Yu等［28］采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)不同溫度條件下黃曲霉轉(zhuǎn)錄組分析研究，表明在適合黃曲霉生長(zhǎng)的37℃和適合黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素的30℃，存在1 153個(gè)差異表達(dá)基因，在30℃條件下30個(gè)黃曲霉毒素生物合成基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度是37℃條件下的3 300倍，鑒定到兩個(gè)溫度對(duì)毒素的負(fù)調(diào)控因子aflR和aflS。

大量真菌基因組陸續(xù)完成測(cè)序和注釋，產(chǎn)毒真菌的后基因組時(shí)代已經(jīng)開啟，研究真菌基因組有助于人們理解不同生長(zhǎng)環(huán)境下真菌的生理特性、形態(tài)差異、進(jìn)化和代謝多樣性。后基因組學(xué)的研究，對(duì)于深入解析種植、生長(zhǎng)、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)毒真菌菌群的發(fā)生和形成，真菌毒素的合成路徑及其調(diào)控機(jī)制、產(chǎn)毒真菌與農(nóng)產(chǎn)品互作、危害儲(chǔ)糧品質(zhì)的機(jī)理提供新的思路。

［1］Bennett JWKM. Mycotoxins［J］. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：497-516.

［2］Hussein HS， Brasel JM. Toxicity， metabolism， and impact of mycotoxins on humans and animals［J］. Toxicology， 2001， 167：101-134.

［3］Chiang YM， Szewczyk E， Davidson AD， et al. A gene cluster containing two fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for apolyketide， asperfuranone， in Aspergillus nidulans［J］. Journal of the American Chemical Society， 2009，131：2965-2970.

［4］Pel HJ， De Winde JH， Archer DB， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88［J］. Nature Biotechnology， 2007， 25：221-231.

［5］孫健冬， 高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)作物全基因組序列測(cè)定中的應(yīng)用概覽［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2012， 2（1）：11-15.

［6］王龑， 許文濤， 趙維薇， 等. 組學(xué)技術(shù)及其在食品科學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2011（11）：005.

［7］劉巖， 吳秉銓. 第三代測(cè)序技術(shù)：?jiǎn)畏肿蛹磿r(shí)測(cè)序［J］. 中華病理學(xué)雜志， 2011， 40（10）：718-720.

［8］Galagan JE， Calvo SE， Borkovich KA， et al. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Nature， 2003， 422：859-868.

［9］Wood V， Gwilliam R， Rajandream MA， et al. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe［J］. Nature， 2002， 415：871-880.

［10］余知和， 高元鋼， 曾昭清， 等. 真菌基因組學(xué)研究進(jìn)展［J］.菌物學(xué)報(bào)， 2008， 27（5）：778-787.

［11］Nierman WC， Pain A， Anderson MJ， et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Nature， 2005， 438：1151-1156.

［12］Machida M， Asai K， Sano M， et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1157-1161.

［13］Galagan JE， Calvo SE， Cuomo C， et al. Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1105-1115.

［14］Van den Berg MA， Albang R， Albermann K， et al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum［J］. Nature Biotechnology， 2008， 26：1161-1168.

［15］Andersen MR， Salazar MP， Schaap PJ， et al. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88［J］. Genome Research， 2011，21：885-897.

［16］Ma LJ， Van Der Does HC， Borkovich KA， et al. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium［J］. Nature， 2010， 464：367-373.

［17］Fedorova ND， Khaldi N， Joardar VS， et al. Genomic islands in the pathogenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Plos Genetics， 2008， 4：e1000046.

［18］Wilkinson B， Micklefield J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：379-386.

［19］ Gross H. Genomic mining-a concept for the discovery of new bioactive natural products［J］. Current Opinion In Drug Discovery & Development， 2009， 12：207-219.

［20］ Bergmann S， Schümann J， Scherlach K， et al. Genomics-driven discovery of PKS-NRPS hybrid metabolites from Aspergillus nidulans［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：213-217.

［21］ Gallo A， Knox BP， Bruno KS， et al. Identification and characterization of the polyketide synthase involved in ochratoxin A biosynthesis in Aspergillus carbonarius［J］. International Journal of Food Microbiology， 2014， 179：10-17.

［22］ Yu J. Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in reducing aflatoxin contamination［J］. Toxins，2012， 4：1024-1057.

［23］ Brakhage AA， Schroeckh V. Fungal secondary metabolites strategies to activate silent gene clusters［J］. Fungal Genetics and Biology， 2011， 48：15-22.

［24］ O’Callaghan J， Coghlan A， Abbas A， et al. Functionalcharacterization of the polyketide synthase gene required for ochratoxin A biosynthesis in Penicillium verrucosum［J］. International Journal of Food Microbiology， 2013， 161：172-181.

［25］ Atoui A， Phong Dao H， Mathieu F， et al. Amplification and diversity analysis of ketosynthase domains of putative polyketide synthase genes in Aspergillus ochraceus and Aspergillus carbonarius producers of ochratoxin A［J］. Molecular Nutrition & Food Research， 2006， 50：488-493.

［26］ Bhatnagar D， Rajasekaran K， Payne G， et al. The ‘omics’ tools：genomics， proteomics， metabolomics and their potential for solving the aflatoxin contamination problem［J］. World Mycotoxin Journal， 2008， 1：3-12.

［27］ Yu J， Ronning CM， Wilkinson JR， et al. Gene profiling for studying the mechanism of aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus and A. parasiticus［J］. Food Additives and Contaminants， 2007， 24：1035-1042.

［28］ Yu J， Fedorova ND， Montalbano BG， et al. Tight control of mycotoxin biosynthesis gene expression in Aspergillus flavus by temperature as revealed by RNA-Seq［J］. FEMS Microbiology Letters， 2011， 322：145-149.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances in Studies on Genomics of Toxogenic Fungi

Wang Yan1，2Liu Yang1，2Liu Yining1
（1. Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；2. Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100193）

Mycotoxins， a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains. It is mainly produced by filamentous fungi， including Trichoderma， Aspergillus， Chaetomium， Penicillium and Rhizopus， existed in agricultural products. Illustrating the genome sequence information of the pathogenic microorganisms in agricultural products， is essential to reveal fungal specific genetic traits. Until to December 2013， a total of 204 species in Ascomycetes and 62 species in Basidiomycete genomic information had been sequenced or published， genomes size from approximately 30 Mb to 40 Mb. This review here provides an overview of available genomic information of toxin-producing fungal or virulent fungus， summarizes the recent development in genome sequencing strategies and main fungal produced mycotoxin， and proposes the future direction of the comparative genomics research on fungi.

fungi；mycotoxin；agricultural products；genome；comparative genomics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.004

2014-11-02

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB127805），國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203037），科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2013FY113400）

王龑，女，博士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素預(yù)防控制；E-mail：wangyan062006@163.com

劉陽(yáng)，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素防控和脫毒理論與技術(shù)及其應(yīng)用；E-mail：liuyang01@caas.cn