白榮，龔小倩，邱海蘊(yùn)，陶恩

（1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443001；2.三峽食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北宜昌443000；3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北恩施445000）

反相高效液相色譜法測(cè)定心脈康合劑中淫羊藿苷含量

白榮1，龔小倩2，邱海蘊(yùn)2，陶恩3

（1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443001；2.三峽食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北宜昌443000；3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北恩施445000）

目的建立測(cè)定心脈康合劑中淫羊藿苷含量的反相高效液相色譜法，為質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法色譜柱為Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（25∶75），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。結(jié)果淫羊藿苷進(jìn)樣量線性范圍為0.062 6～1.879 8μg（r=1.000 0），精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性的RSD均小于2.00%，平均回收率為99.35%，RSD為0.79%（n=9）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制。

心脈康合劑；淫羊藿苷；反相高效液相色譜法

心脈康合劑是由麥冬、丹參、淫羊藿、黨參、附片、五味子、黃芪、甘草、桂枝、菟絲子、赤芍11味中藥組方的中藥復(fù)方制劑，臨床用于脾腎兩虛引起的氣血虛弱、心陽不足及冠心病、心腎功能不全、免疫功能失調(diào)。該制劑在我院臨床已應(yīng)用多年，效果良好。淫羊藿主要功能為補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨，用于腎陽虛衰、陽痿遺精。在目前的心脈康合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只有對(duì)麥冬、丹參的薄層色譜鑒別，未對(duì)其中任一藥材的有效成分進(jìn)行定量分析。為提高醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制劑質(zhì)量，參考文獻(xiàn)［1-7］，建立了心脈康合劑中淫羊藿苷含量測(cè)定的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀，Empower色譜工作站（美國Waters公司）；METTLER-AE240型電子分析天平。淫羊藿苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110737-200415）；乙腈為色譜純，水為去離子雙蒸餾水，其他試劑均為分析純；心脈康合劑（湖北民族學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室，批號(hào)為140109，140308，140809）；缺淫羊藿的陰性對(duì)照合劑（自制）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（25∶75）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。在此色譜條件下，淫羊藿苷達(dá)到基線分離（分離度大于1.5），理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

2.2溶液制備

精密稱取60℃減壓干燥14 h后的淫羊藿苷對(duì)照品19.57mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液；精密量取貯備液2 mL，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為62.62μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取供試品5mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇約45 mL，超聲溶解15min，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取處方量藥材（不含淫羊藿）按心脈康合劑生產(chǎn)方法制備缺淫羊藿的陰性對(duì)照合劑3批，混合均勻，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL，在擬訂色譜條件下分別注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置上有相同時(shí)間的保留峰，陰性對(duì)照品溶液色譜則無此峰。淫羊藿苷保留時(shí)間約為32.4min，理論板數(shù)以淫羊藿苷峰計(jì)算為12500。

線性關(guān)系考察：分別精密量取按2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0，5.0，10.0，20.0，30.0μL，注入色譜儀，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 306 468X-37 400，r=1.000 0（n=5）。結(jié)果，淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.062 6～1.879 8μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄峰面積。結(jié)果峰面積平均值為1 406 601，RSD為0.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)140109）6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20μL，依法測(cè)定。結(jié)果合劑中淫羊藿苷含量分別為0.432，0.429，0.427，0.430，0.429，0.435 g/L，平均0.430 g/L，RSD為0.7%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，12，24，48，72 h時(shí)進(jìn)樣20μL，依法測(cè)定。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為1.0%（n=7），表明供試品溶液至少在3 d內(nèi)穩(wěn)定。

檢測(cè)限與定量限確定：精取對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，記錄色圖譜。信噪比為3時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為2.50 ng，信噪比為10時(shí)測(cè)得定量限為12.52 ng。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取2mL已知含量的樣品9份（批號(hào)140109），分別精密加入按2.2項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品貯備液0.5，2.0，4.0mL各3份，再按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法配制成供試品溶液50mL，進(jìn)樣20μL測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1　淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中淫羊藿苷的含量。結(jié)果批號(hào)分別為140109，140308，140809的樣品含量分別為0.430，0.427，0.434 g/L，平均含量為0.430 g/L。

3　討論

淫羊藿作為主要組分廣泛應(yīng)用于多種制劑中，在本合劑組方中，淫羊藿即為主要成分。淫羊藿苷是淫羊藿中的主要成分，也是其主要活性成分之一，測(cè)定其含量對(duì)于控制本品質(zhì)量，更好地保證臨床療效有重要意義。

淫羊藿檢測(cè)方法比較成熟，對(duì)其定量檢測(cè)通常采用高效液相色譜（HPLC）法，含淫羊藿中成藥或制劑中淫羊藿苷的HPLC法含量測(cè)定報(bào)道已較多［1-7］，主要流動(dòng)相為甲醇-水（磷酸溶液）、乙腈-水（磷酸溶液），但因各制劑處方組成差異，流動(dòng)相比例各不相同，采用的洗脫方式也多種多樣，以充分消除樣品中其他成分的干擾。本研究中在建立心脈康合劑中淫羊藿苷含量測(cè)定時(shí)，對(duì)藥典及文獻(xiàn)中報(bào)道的方法進(jìn)行了研究測(cè)試，最終選定流動(dòng)相組成、磷酸溶液濃度、比例及洗脫方式，篩選出的色譜條件對(duì)本制劑中淫羊藿苷的測(cè)定具有較強(qiáng)的專屬性，能達(dá)到基線分離、峰形對(duì)稱、陰性對(duì)照無干擾，不足之處可能在于洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，但簡(jiǎn)便的樣品處理方式抵消了這種不足。

為了消除中藥制劑中主要成分測(cè)定過程中的干擾，提高目標(biāo)檢測(cè)物的可檢測(cè)性，中藥制劑樣品處理方式非常重要。含淫羊藿固體制劑的前處理方法大多為超聲提?。?-7］，其次是回流提?。?］，對(duì)液體制劑多直接用溶劑稀釋［4］。由于本制劑為液體制劑，不存在被檢成分能否完全溶出的問題，因此在樣品制備時(shí)首先選擇了操作簡(jiǎn)便的直接溶劑稀釋法。研究表明，取適量合劑樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，在線性范圍內(nèi)可對(duì)合劑中的淫羊藿苷進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，無需濃縮或提取過程［4］。

綜上所述，本研究中建立的淫羊藿苷含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于心脈康合劑的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：306.

［2］邢婧，任紅，汪軒，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定淫羊藿-川芎藥對(duì)8種化學(xué)成分的含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（6）：960-965.

［3］楊炳川，楊浩然，方應(yīng)權(quán)，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方玄駒膠囊中淫羊藿苷的含量［J］.中國藥房，2015，35（6）：1 282-1 283.

［4］黃朝情，彭玉德，黃文華，等.12種中成藥中淫羊藿組分的質(zhì)量考察［J］.中國藥房，2011，22（43）：4 086-4 088.

［5］劉源，石繼偉.高效液相色譜法測(cè)定安神補(bǔ)腦片中淫羊藿苷含量［J］.中國藥業(yè)，2014，23（1）：14-15.

［6］鮑蕾蕾，陳海飛，卞俊，等.高效液相色譜法測(cè)定健步關(guān)節(jié)膠囊中淫羊藿苷含量［J］.中國藥業(yè)，2012，21（20）：42-43.

［7］王巨存，馮鑫，趙薇，等.HPLC法測(cè)定壯骨止痛顆粒中淫羊藿苷的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（4）：742-744.

Determ ination of Icariin in Xinmaikang M ixture by RP-HPLC

Bai Rong1，Gong Xiaoqian2，Qiu Haiyun2，Tao En3
（1.Renhe Hospital of Three Gorges University，Yichang，Hubei，China 443001；2.Three Gorges Center for Food and Drug Control，Yichang，Hubei，
China 443000；3.The Affiliated Hospital of Hubei University for Nationalties，Enshi，Hubei，China 445000）

Objective To establish a reverse phase-high performance liquid chromatography（RP-HPLC）method for the determination of icariin in Xinmaikang Mixture，so as to provide

for its quality control.M ethods The HPLC analysis was carried out on the Diamonsil C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（25∶75）with the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 270 nm.Results The linear range of icariin was 0.062 6μg～1.879 8μg（r=1.000 0），the RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.00%，with an average recovery rate of icariin 99.35%，RSD=0.79%（n=9）.Conclusion This method is sensitive，simple and accurate with good repeatability and good linearity.It can be used for the quality contnet of icariin in Xinmaikang Mixture.

Xinmaikang Mixture；icariin；reverse phase-high performance liquid chromatography

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）24-0158-03

白榮（1962-），女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)、藥物分析及藥物制劑，（電子信箱）brlk933@ 163.com。

2015-08-13）