曹建斌 于慧瑛 李新

（運城學(xué)院生命科學(xué)系，運城　044000）

耐鹽芽孢桿菌LAY的分類鑒定及其抗白色念珠菌活性研究

曹建斌 于慧瑛 李新

（運城學(xué)院生命科學(xué)系，運城044000）

旨在從運城鹽湖黑泥樣品中分離獲得一株耐鹽細菌LAY，對其進行分類鑒定及抗菌特性研究?；?6S rRNA基因序列對菌株進行分類鑒定。以白色念珠菌為指示菌，采用杯碟法對菌株LAY發(fā)酵上清液進行抗菌活性檢測，研究不同因素對其抗菌活性的影響；采用掃描電鏡和透射電鏡觀察其抗菌效果，并對菌株基因組進行功能基因的PCR篩查。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株LAY為Bacillus屬成員，為耐鹽細菌。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株LAY發(fā)酵上清液可導(dǎo)致白色念珠菌細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常?？咕€(wěn)定性研究表明，菌株LAY發(fā)酵上清液活性較為穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的對溫度、pH、NaCl和紫外光的耐受性。功能基因篩查發(fā)現(xiàn)菌株LAY基因組中含有聚酮合酶（PKS）基因，表明該菌具有產(chǎn)聚酮類化合物的潛力。結(jié)果表明，鹽湖環(huán)境中的極端微生物資源可作為抗菌活性物質(zhì)的潛在新來源。

耐鹽細菌；Bacillus；Candida albicans；抗菌活性；功能基因

白色念珠菌（Candida albicans）是念珠菌屬中致病力最強的一種革蘭氏陽性條件致病菌［1］，常常侵犯人體皮膚、黏膜，并導(dǎo)致內(nèi)臟或全身感染。近年來，隨著大量抗生素、激素、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開展，使該菌導(dǎo)致的感染發(fā)病率逐漸增高，甚至危及生命［2］。因此尋找和開發(fā)具有抗白色念珠菌活性的新化合物，已成為醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。

運城鹽湖是個典型的內(nèi)陸咸水湖，由于湖水及其周圍土壤的含鹽度較高，生活在這類環(huán)境中的動植物較為稀少，但卻蘊藏著豐富的嗜/耐鹽微生物資源［3］。這類微生物對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，在長期的進化中逐步形成了獨特的種群特點和代謝機制，并產(chǎn)生了許多具有特殊功能的天然活性物質(zhì)［4］，在食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護等領(lǐng)域具有重要的開發(fā)利用價值［5，6］。近年來，人們雖對鹽湖微生物資源開展了大量的研究，但將其應(yīng)用于抗菌活性篩選的報道卻十分有限，僅有少量的嗜/耐鹽細菌次生代謝產(chǎn)物被分離純化，如Halobacillus litoralis YS3106產(chǎn)生的3種具有抗菌作用的環(huán)肽［7］和Pelagiobacter variabilis產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的一組吩嗪類化合物［8］。由此可見，鹽湖微生物所蘊含的抗菌代謝產(chǎn)物資源還遠未被人們所發(fā)掘。

本研究從運城鹽湖中分離獲得一株對白色念珠菌具有明顯抗菌活性的菌株LAY，采用16S rRNA基因序列分析對其進行分類鑒定，并對其發(fā)酵液抗菌活性進行初步研究。此外，在活性研究的基礎(chǔ)上，對菌株LAY基因組進行聚酮合酶（PKS）基因和非核糖體肽合成酶（NRPS）基因的篩查研究，旨在為其在農(nóng)業(yè)生防或醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株LAY分離自運城鹽湖黑泥樣品，白色念珠菌（C. albicans）由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，37℃（培養(yǎng)菌株LAY）。YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉20 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，28℃（活化培養(yǎng)白色念珠菌）。

1.2 方法

1.2.1 菌株LAY的16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 提取菌株LAY基因組DNA，采用細菌通用引物進行16S rRNA基因的PCR擴增。正向引物（27f）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物（1540r）：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由北京三博遠志公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast搜索，選擇同源性較高的相關(guān)序列，利用Clustal W 1.8軟件進行多重序列比對后，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建菌株LAY的系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 白色念珠菌的活化及菌株LAY發(fā)酵上清液的制備 從斜面上挑取適量的白色念珠菌菌苔，接入已滅菌的YPD培養(yǎng)基，28℃下振蕩培養(yǎng)2 d。菌株LAY于37℃振蕩培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min，上清液用于抗菌活性檢測。

1.2.3 抗菌活性檢測

1.2.3.1 熱穩(wěn)定性 將5 mL上清液分別置于30、40、50、60、70、80、90和100℃下處理30 min，以白色念珠菌為指示菌，未處理的發(fā)酵上清為對照，采用杯碟法測定抑菌圈直徑，檢測其熱穩(wěn)定性。

1.2.3.2 pH穩(wěn)定性 取發(fā)酵上清液，將其pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10、11和12的溶液，后均定容至5 mL，靜置2 h。采用杯碟法檢測其酸堿穩(wěn)定性。

1.2.3.3 NaCl穩(wěn)定性 取1 mL上清液，加入NaCl溶液，分別調(diào)節(jié)鹽濃度為3%、6%、9%、12%、15%和18%，靜置2 h。采用杯碟法測定其對NaCl的穩(wěn)定性。

1.2.3.4 紫外光照穩(wěn)定性 取5 mL菌株LAY發(fā)酵上清液置于紫外燈下，分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 h取樣，以白色念珠菌為指示菌，未處理的發(fā)酵上清為對照，采用杯碟法測定其光照穩(wěn)定性。

1.2.4 電鏡觀察 取1 mL活化的白色念珠菌懸液（108CFU/mL），加入2 mL發(fā)酵上清液，28℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集細胞，用磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗，加入2.5%（V/V）的戊二醛溶液進行固定。細胞樣品經(jīng)處理后，分別在掃描電鏡（JSH-35CF，日本）和透射電鏡（DXB2-12，上海）下進行觀察。

1.2.5 菌株LAY生長曲線與抗生素產(chǎn)生量的關(guān)系 以1%的接種量將菌株LAY接種于PDA培養(yǎng)基中，于37℃下振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)2 h后，每隔2 h測OD600值，以PDA培養(yǎng)基做空白對照。同時，取1 mL菌液，于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用于抗菌活性檢測。

1.2.6 功能基因的PCR篩查及序列分析 采用Zhu等［9］設(shè)計的特異引物，對菌株LAY基因組進行聚酮合酶（PKS）和非核糖體肽合成酶（NRPS）基因的PCR篩查。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行回收純化、酶連及轉(zhuǎn)化。挑取陽性克隆由北京三博遠志生物公司進行測序。將獲得的基因序列提交到GenBank中獲得基因登錄號。采用DNAman軟件將獲得的基因序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，選取同源性較高的相關(guān)序列，采用MEGA5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株LAY的分類鑒定

2.1.1 部分生理生化特征 如圖1所示，菌株LAY在0-25.0%的鹽濃度范圍內(nèi)均能生長，最適生長濃度為5%，確定其為耐鹽細菌；菌株生長的最適pH和溫度分別為pH7.0和35℃。

圖1 NaCl濃度（A）、pH（B）和溫度（C）對菌株LAY生長特性的影響

2.1.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 采用PCR 擴增菌株LAY的16S rRNA基因，獲得大小為1 449 bp的片段。采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖2）顯示，菌株LAY與Bacillus屬內(nèi)各種的同源性均在98.0%以上，確定其為Bacillus屬成員，命名為Bacillus sp. LAY。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株LAY的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株LAY發(fā)酵液抗白色念珠菌活性研究

2.2.1 抗菌活性檢測 采用杯碟法檢測菌株LAY發(fā)酵上清液的抗菌活性，結(jié)果（圖3）表明該菌可產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì)，對白色念珠菌具有明顯的抑制作用。

2.2.2 抗菌穩(wěn)定性研究 熱穩(wěn)定性（圖4-A）結(jié)果表明，在70℃以下，抗菌活性較為穩(wěn)定；80℃時，抗菌活性最佳；溫度高于90℃，抗菌活性開始有所下降。在pH11時，上清液對白色念珠菌的抗菌活性最強。pH為4-10時，抗菌活性比較穩(wěn)定。在pH12時，抗菌活性明顯下降。結(jié)果（圖4-B）表明，菌株LAY發(fā)酵液的抗菌活性對酸堿的耐受性較好。鹽穩(wěn)定性結(jié)果（圖4-C）表明，菌株LAY抗菌活性在鹽度為0-3%時最高。但隨著鹽度的升高，抗菌活性不斷下降，當鹽濃度超過15%時，抗菌活性基本消失。此外，研究發(fā)現(xiàn)，菌株LAY發(fā)酵上清液具有良好的對紫外光的穩(wěn)定性（圖4-D）。

圖3 菌株LAY發(fā)酵液抗菌活性檢測

圖4 菌株LAY發(fā)酵上清液的抗菌特性

2.3 電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察菌株LAY上清液對白色念珠菌的抗菌作用，如圖5所示。正常白色念珠菌細胞形狀規(guī)則，呈圓球形，表面較為光滑，直徑約為2-4 μm（圖5-A）。經(jīng)上清液處理后的細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞表面粗糙并出現(xiàn)裂紋，且部分細胞發(fā)生破裂（圖5-B）。

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)規(guī)則，細胞質(zhì)分布均勻，細胞壁厚度約為150-200 nm，且細胞質(zhì)中含有豐富的電子致密物質(zhì)（圖6-A）。經(jīng)處理后的細胞發(fā)生明顯改變，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂，部分細胞胞壁疑似消失（圖6-B）或增厚（圖6-C）。此外，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)與細胞壁的界限變得模糊，且無法直接觀察到細胞核的存在（圖6-C）。

圖5 掃描電鏡觀察

圖6 透射電鏡觀察

2.4 菌株LAY生長曲線與抗生素產(chǎn)生量的關(guān)系

如圖7所示，菌株LAY在培養(yǎng)開始后即進入對數(shù)生長期，30 h后達到峰值，并隨后進入穩(wěn)定期（30-46 h）。由于菌株LAY產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的量與抑菌圈直徑的大小成正比，抗菌物質(zhì)在菌株培養(yǎng)18 h后開始產(chǎn)生，32 h后產(chǎn)生量最高，后趨于穩(wěn)定。

圖7 菌株LAY生長曲線與抗生素產(chǎn)生量的關(guān)系

2.5 功能基因的PCR篩查與分析

對菌株LAY基因組進行聚酮合酶（PKS）和非核糖體肽合成酶（NRPS）基因PCR篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株基因組中不存在NRPS基因，但發(fā)現(xiàn)了PKS基因的存在。經(jīng)測序后，獲得一條666 bp的PKS基因片段，提交到GenBank中獲得基因登錄號為KM000039。將獲得的基因片段轉(zhuǎn)換為氨基酸序列（AIO09649），進行Blastx比對，發(fā)現(xiàn)該序列與GenBank中已有序列的最高相似度為99%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株LAY的PKS基因序列編碼的氨基酸序列為酮縮合酶（KS）基因的高度保守序列（圖8）。

3 討論

作為一類重要的藥源性微生物資源，芽孢桿菌具有產(chǎn)豐富次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力，它們易于繁殖，分布廣泛，適應(yīng)環(huán)境能力強，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)利用價值［10］。近年來，隨著陸地微生物資源的日益匱乏和細菌耐藥性問題的不斷出現(xiàn)，尋找新種屬或特殊性狀的微生物來開拓微生物篩選的新資源顯得尤為迫切。因此，從極端環(huán)境中尋找和發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的特殊菌株就成為研究者關(guān)注的新熱點［11］。多年來，本課題組針對運城鹽湖的微生物資源，開展了大量的調(diào)查研究工作，篩選并獲得了一批具有明顯抗菌活性的鹽湖芽孢桿菌菌株。本研究針對其中一株具有抗白色念珠菌活性的耐鹽細菌菌株LAY進行研究，通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)其為Bacillus屬成員。

圖8 基于氨基酸序列的PKS基因的系統(tǒng)進化樹

由微生物產(chǎn)生的聚酮類化合物（Polyketide）和非核糖體肽類化合物（Non-ribosomal peptide）是天然化合物的兩大重要家族，它們大多具有良好的生物學(xué)活性，被廣泛用于醫(yī)用或農(nóng)用抗生素、免疫抑制劑和抗癌藥等［12］。目前已報道的聚酮類化合物和非核糖體肽類化合物可達數(shù)萬種，主要來源于各種細菌、放線菌和真菌［13］。對此，本研究采用PCR技術(shù)主要開展了菌株LAY基因組中的PKS基因和NRPS基因的分子篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bacillus sp. LAY也具有產(chǎn)聚酮類化合物的潛力。近年來，在耐鹽細菌的許多常見種群中，如Aeromonas，Burkholderia，Photobacterium，Pseudomonas等，均發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性菌株的存在［14-16］，但對其次級代謝產(chǎn)物的報道卻相對較少。

本研究表明，菌株LAY發(fā)酵上清液對白色念珠菌具有明顯的抗菌活性。同時，對其發(fā)酵上清液進行各種處理后，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性表現(xiàn)出對紫外光照、熱、環(huán)境酸堿度等良好的穩(wěn)定性，因此可能具有廣闊的應(yīng)用潛力。細胞壁是真菌細胞外的重要結(jié)構(gòu)，在維持細胞的生長和正常的生理功能上發(fā)揮重要作用。由于哺乳動物無細胞壁，因而作用于真菌細胞壁的藥物具有高效、低毒的特點。通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株LAY發(fā)酵上清液處理后的真菌細胞出現(xiàn)破裂或變形。Leite等［17］報道該現(xiàn)象主要是由于化合物導(dǎo)致細胞滲透性發(fā)生變化引起的，而這可能源于抗菌物質(zhì)的作用靶點為真菌細胞膜或細胞壁。該結(jié)果表明，菌株LAY可能產(chǎn)生了某種可破壞真菌細胞壁的抗菌物質(zhì)。

通過長期的自然選擇與進化，生長在鹽（堿）湖、海水等鹽域環(huán)境中的微生物形成了獨特的環(huán)境適應(yīng)機制，極有可能會產(chǎn)生某些具有獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性的代謝產(chǎn)物，因此可作為發(fā)現(xiàn)新型天然化合物的潛在資源。隨著科學(xué)研究的廣泛開展，來源于極端環(huán)境中的抗菌活性微生物也將被不斷發(fā)現(xiàn)和鑒定。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，今后將著重針對菌株LAY所產(chǎn)代謝產(chǎn)物進行分離純化及結(jié)構(gòu)解析等相關(guān)工作，為其在農(nóng)業(yè)生防或醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從運城鹽湖黑泥樣品中篩選獲得一株對白色念珠菌具有明顯抗菌活性的菌株LAY，通過16S rRNA基因序列分析鑒定其為Bacillus屬成員?？咕钚匝芯拷Y(jié)果表明，菌株LAY發(fā)酵上清液活性較為穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的耐熱性、抗酸堿及耐鹽性等?？咕锨逡禾幚戆咨钪榫?，可導(dǎo)致其細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常。通過功能基因的PCR篩查，發(fā)現(xiàn)Bacillus sp. LAY基因組中含有聚酮合酶（PKS）基因，表明該菌可產(chǎn)聚酮類化合物的。綜合上述研究表明，鹽域環(huán)境中的嗜/耐鹽微生物資源可能是獲得新型抗菌活性物質(zhì)的重要資源。

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（責任編輯 馬鑫）

Identification of Bacillus sp. LAY and Its Antim icrobial Activity Against Candida albicans

Cao Jianbin Yu Huiying Li Xin
（College of Life Sciences，Yuncheng University，Yuncheng044000）

The goal of this work is to identify a halotolerant bacterium LAY isolated from Yuncheng Salt Lake and study its antimicrobial properties. The strain LAY was identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Using Candida albicans as the indicator， the antimicrobial activity of the fermentation broth of strain LAY was detected by cylinder plate method， and meanwhile the effects of different factors on the activities were studied. Morphological and ultra-structural changes of treated cells were observed by scanning electron microscopy（SEM）and transmission electron microscopy（TEM）. PCR screening of functional genes were also carried out. The results of phylogenetic analysis indicated that it was a halotolerant bacterium， and characterized as the genus of Bacillus， and named as Bacillus sp. LAY. The observation by electron spectroscopy discovered that morphological and ultra-structural changes of C. albicans after treatment by fermentation broth of Bacillus sp. LAY were significant. Antimicrobial properties of the strain LAY indicated that the activity of fermentation broth was stable， and showed excellent tolerance towards temperature， pH， NaCl and ultraviolet. Using specific primers， a gene for polyketide synthase（PKS）was detected by PCR technique， indicating that the strain LAY possessed the potential of producing polyketide. In conclusion， results from the study showed that extremophiles from salt lake might be developed as a potential new source of antimicrobial active substances.

halotolerant bacteria；Bacillus；Candida albicans；antimicrobial activity；functional gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.023

2015-01-14

國家青年科學(xué)基金項目（31300002），運城學(xué)院博士啟動基金項目（YQ-2011043）

曹建斌，男，碩士，講師，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：caojianbin2006@126.com

李新，男，博士，副教授，研究方向：極端微生物學(xué)；E-mail：lixin-eva@163.com