蔡磊 余露軍 陳小曲 葉惠欣 陳琳 李建軍

（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所　廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510663）

諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選及特征分析

蔡磊 余露軍 陳小曲 葉惠欣 陳琳 李建軍

（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510663）

旨在為大規(guī)模開(kāi)發(fā)諸氏鯔蝦虎魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果共獲得47 979條Unigenes，利用微衛(wèi)星查找程序在47 979條Unigenes中共獲得6 225個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（12.97%），平均每7.02 kb就出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。6 225個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)由226種重復(fù)基序組成，主要分布在三、四和五堿基重復(fù)類(lèi)型中。在數(shù)量上，單堿基重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星位點(diǎn)最多，占42.49%，二堿基和三堿基重復(fù)類(lèi)型所占比例相似，分別為25.22%和26.27%，四、五、六重復(fù)類(lèi)型較少，合計(jì)占6.03%。單堿基重復(fù)序列中最多的類(lèi)型為A/T，二堿基重復(fù)序列中以AG/CT重復(fù)單元為主，三堿基重復(fù)序列中以AGC/TCG為優(yōu)勢(shì)類(lèi)型。挑選部分二、三和四單元重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星序列，共設(shè)計(jì)76對(duì)引物，可穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的有55對(duì)，其中32對(duì)具有多態(tài)性。結(jié)果表明，利用諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可快速大量開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。

諸氏鯔蝦虎魚(yú)；轉(zhuǎn)錄組序列；微衛(wèi)星；篩選；分布特征

微衛(wèi)星DNA，又稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），是一種廣泛分布于原核和真核生物基因組中的遺傳標(biāo)記，由于其具有共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，已在群體遺傳學(xué)研究中得到大量應(yīng)用［1，2］。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法主要是從構(gòu)建的基因組文庫(kù)中富集、回收、克隆微衛(wèi)星序列，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且陽(yáng)性克隆率較低。因此對(duì)于基因組背景信息較少的物種，傳統(tǒng)方法在進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開(kāi)發(fā)方面就受到一定的限制。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的成熟及成本的下降，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)正逐漸顯露出來(lái)。首先，與基因組測(cè)序相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序費(fèi)用低、周期短、獲得的信息量足夠豐富可完全滿(mǎn)足標(biāo)記開(kāi)發(fā)需要。其次，來(lái)源于轉(zhuǎn)錄組的微衛(wèi)星標(biāo)記與功能基因緊密連鎖，可為后續(xù)基因的定位、性狀關(guān)聯(lián)分析等提供有用信息。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法已在動(dòng)植物中被大量報(bào)道［3，4］。

諸氏鯔蝦虎魚(yú)（Mugilogobius chulae）是具有我國(guó)特色的一種小型海水魚(yú)類(lèi)，經(jīng)過(guò)近10年比較研究發(fā)現(xiàn)諸氏鯔蝦虎魚(yú)在各種生物學(xué)性狀方面均較具實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的開(kāi)發(fā)潛力［5，6］，如個(gè)體小、繁殖周期短、繁殖力強(qiáng)、便于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)管理以及對(duì)污染物生物毒性敏感等。目前實(shí)驗(yàn)室封閉群已經(jīng)繁殖到第14代，近交系已培育至第6代，諸氏鯔蝦虎魚(yú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化將會(huì)是對(duì)國(guó)際海洋模式魚(yú)類(lèi)空白的填補(bǔ)。目前公共數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于諸氏鯔蝦虎魚(yú)基因組信息資源極其匱乏，且多為線粒體序列，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足諸氏鯔蝦虎魚(yú)遺傳質(zhì)量控制和種質(zhì)資源保護(hù)的需求。為更好地了解諸氏鯔蝦虎魚(yú)遺傳背景知識(shí)，指導(dǎo)諸氏鯔蝦虎魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在封閉群建群過(guò)程中的遺傳質(zhì)量控制以及近交系近交過(guò)程中遺傳純合度檢測(cè)，本研究利用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行初步篩選和分析，以期為諸氏鯔蝦虎魚(yú)功能基因及遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及微衛(wèi)星引物篩選所用的諸氏鯔蝦虎魚(yú)樣本均取自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所海洋生物保種基地，共20尾，平均體重（0.63±0.15）g，全長(zhǎng)范圍在2.6-4.1 cm之間。挑選10尾諸氏鯔蝦虎魚(yú)樣本分別取新鮮肝臟組織并混合，液氮冷凍保存，用于總RNA提取。另取10尾樣本固定于無(wú)水乙醇中，-20℃保存，用于DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 參照 Trizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）說(shuō)明書(shū)提取肝臟總RNA，利用華大基因科技服務(wù)有限公司Illumina HiSeq2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行RNAseq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。用SOAPdenove軟件［7］對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝獲得大量Unigenes。

1.2.2 微衛(wèi)星序列的查找及引物設(shè)計(jì) 使用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件對(duì)組裝的Unigenes進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找和篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)螇A基重復(fù)次數(shù)在12次或12次以上，兩堿基在6次或者6次以上，三和四堿基在5次或者5次以上，五和六堿基在4次或者4次以上。用Primer 3.0批量設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，設(shè)計(jì)好的引物送上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 微衛(wèi)星引物的篩選 微衛(wèi)星引物篩選所用諸氏鯔蝦虎魚(yú)樣本共10尾，按照廣州欣研生物科技有限公司生產(chǎn)的組織DNA提取試劑盒進(jìn)行樣品基因組DNA的提取，并檢測(cè)純度和濃度。PCR擴(kuò)增總體系為25 μL，包括Premix TaqTMVersion 2.0（TaKaRa）12.5 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，DNA模板200 ng，無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃ 40 s，退火（溫度依據(jù)引物而定）30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在濃度為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，硝酸銀染色。用NR、Swiss-Port、KEGG和COG蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)含有多態(tài)性的序列進(jìn)行基因注釋。

2 結(jié)果

2.1 諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星的數(shù)量和分布特點(diǎn)

利用SOAPdenove軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，共獲得47 979條Unigenes，總長(zhǎng)度為43.7 Mbp，平均長(zhǎng)度911 bp，N50達(dá)到1 658 bp。對(duì)獲得的Unigenes進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的查找，共得到6 225個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（12.97%），分布在5 868個(gè)Unigenes上，其中有297條Unigenes含有兩個(gè)及以上微衛(wèi)星位點(diǎn)（5.1%），諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列中平均每7.02 kb就出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。最短的微衛(wèi)星序列為12bp，最長(zhǎng)的為393 bp。重復(fù)單元類(lèi)型中1-6堿基重復(fù)類(lèi)型均有出現(xiàn)，且分布數(shù)量不均。

2.2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星的重復(fù)類(lèi)型及特征

諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星重復(fù)基序共226種，1-6堿基重復(fù)類(lèi)型數(shù)量分別為3、11、59、61、53和39個(gè)。其中單堿基重復(fù)類(lèi)型最多，有2 645個(gè)，占42.49%，其次為三堿基和二堿基重復(fù)，分別為1 635和1 570個(gè)，占26.27%和25.22%，四、五和六堿基重復(fù)類(lèi)型數(shù)量較少，總共占6.03%。單堿基重復(fù)序列中除1個(gè)為C/G重復(fù)單元外，其余全為A/T重復(fù)單元，二堿基重復(fù)序列中以AG/CT和AC/ GT重復(fù)單元為主，分別占59.8%和28.5%，三堿基重復(fù)序列中以AGC/TCG、AAG/CTT和AGG/CCT為優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，分別占32.4%、14.6%和13.5%，其余重復(fù)單元各種重復(fù)類(lèi)型分布較均勻，具體分布見(jiàn)圖1。在重復(fù)次數(shù)上，單堿基微衛(wèi)星的核心重復(fù)次數(shù)主要集中在12-17次，二、三堿基核心序列重復(fù)次數(shù)主要集中在5-8次，四堿基以5和6次重復(fù)為主，五和六堿基以4次重復(fù)為主，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中不同微衛(wèi)星重復(fù)單元類(lèi)型分布

表1 諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星重復(fù)單元的數(shù)量和類(lèi)型

2.3 微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)及多態(tài)性引物的初步篩選

利用Primer3對(duì)獲得的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)引物2 671對(duì)，挑選部分二、三和四單元重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星引物共76對(duì)送出合成，其中二堿基重復(fù)次數(shù)≥9次，三堿基重復(fù)次數(shù)≥7次，四堿基重復(fù)次數(shù)≥6次。以10個(gè)諸氏鯔蝦虎魚(yú)野生群樣本基因組DNA為模板，對(duì)76對(duì)引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。可穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的有55對(duì)，其中有32對(duì)具有多態(tài)性，23對(duì)為單態(tài)，部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖2。初步篩選獲得的具有多態(tài)性的32個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物序列，見(jiàn)表2，相關(guān)序列已上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）。

圖2 引物2153-1、2368-4和2489-2在10尾諸氏鯔蝦虎魚(yú)野生群體中的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的功能注釋

利用NR、Swiss-Port、KEGG和COG蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)32對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星序列進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)灿?0個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)獲得注釋?zhuān)婕暗?0個(gè)已知的功能基因，包括到轉(zhuǎn)錄因子、受體、激酶和一些細(xì)胞組成成分等重要功能基因（表2）。

3 討論

本研究在47 979條，總長(zhǎng)度為43.7 Mbp 的Unignges中共發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)6 225個(gè)，平均每7.02 kb就出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，發(fā)生頻率為12.97%。與其他海洋魚(yú)類(lèi)相比，諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中大于二堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的出現(xiàn)頻率介于中間狀態(tài)（7.46%），比斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）（11.2%）［8］和紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）（11.5%）［9］低，但又高于真鯛（Chrysophrys major）（4%）［10］和大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）（4.24%）［11］，與牙鲆（Paralichthys olivaceus）（7.95%）［12］相似。在出現(xiàn)密度上，與其他魚(yú)類(lèi)的差異較小，如鮸魚(yú)（Miichthys miiuy） 為1/6.04 kb［13］、 鯽 魚(yú)（Carassius auratus）為1/6.39 kb［14］， 牙 鲆（Paralichthys olivaceus） 為1/7.9 kb［12］。這種出現(xiàn)頻率和密度上的差異可能與微衛(wèi)星查找所選用數(shù)據(jù)量的大小、數(shù)據(jù)拼裝的質(zhì)量、組織來(lái)源以及物種間差異有關(guān)。

一般認(rèn)為微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性與重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)呈正相關(guān)［15］。對(duì)本研究獲得的微衛(wèi)星序列統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，除單堿基重復(fù)微衛(wèi)星外，其余微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)范圍在5-8次之間，比來(lái)源于基因組的微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)低。推測(cè)可能是由轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星主要來(lái)自編碼區(qū)導(dǎo)致，與基因組中非編碼序列相比，編碼區(qū)序列受到選擇壓力更大，相對(duì)不易發(fā)生變異［16］。

在微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型上，除單堿基微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型外，多數(shù)物種中是以二堿基重復(fù)類(lèi)型為主［17］，本研究發(fā)現(xiàn)諸氏鯔蝦虎魚(yú)轉(zhuǎn)錄組序列微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型中以三堿基重復(fù)類(lèi)型為最多，結(jié)果與之存在差異。這種現(xiàn)象在大黃魚(yú)、鮸魚(yú)和縊蟶（Sinonovacula constricta）中也見(jiàn)報(bào)道［11，13，18］。由于轉(zhuǎn)錄組序列主要來(lái)源于外顯子，自然選擇機(jī)制對(duì)轉(zhuǎn)錄區(qū)的三核苷酸基序表現(xiàn)出積極選擇作用，導(dǎo)致在編碼區(qū)由于受重大突變壓力的影響而存在豐富的三核苷酸重復(fù)序列［19，20］。在重復(fù)類(lèi)型分布上，單堿基、二堿基和三堿基均表現(xiàn)出一定的偏倚性，單堿基重復(fù)類(lèi)型中除發(fā)現(xiàn)1個(gè)C/G類(lèi)型外，其余均為A/T類(lèi)型，在二堿基重復(fù)序列中，AG/CT占主要優(yōu)勢(shì)，三堿基重復(fù)類(lèi)型中最多的是AGC/TCG，這種二、三重復(fù)單元的重復(fù)類(lèi)別在不同物種間差異較大［13，14，21］，這種重復(fù)單元數(shù)量的偏倚以及類(lèi)型的差異性可能與物種間差異性有關(guān)［22］。另外，在二堿基重復(fù)類(lèi)型中還檢測(cè)到18個(gè)比較罕見(jiàn)的GC/GC類(lèi)型。

考慮到標(biāo)記多態(tài)性問(wèn)題，在進(jìn)行微衛(wèi)星引物篩選時(shí)，為避免盲目，盡量選取重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)較高的序列進(jìn)行篩選。本研究挑選部分二堿基重復(fù)次數(shù)≥9次、三堿基重復(fù)次數(shù)≥7次、四堿基重復(fù)次數(shù)≥6次的序列，共設(shè)計(jì)76對(duì)微衛(wèi)星引物，以10個(gè)諸氏鯔蝦虎魚(yú)野生保種群體樣本基因組DNA為模板，對(duì)76對(duì)引物進(jìn)行了初步篩選。其中能穩(wěn)定擴(kuò)增出目的片段的引物有55對(duì)，剩余21對(duì)未擴(kuò)增或者擴(kuò)增非目的片段。55對(duì)有效擴(kuò)增引物中有32對(duì)具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)比例達(dá)到42.67%。分布上僅見(jiàn)于二和三堿基重復(fù)類(lèi)型，四堿基重復(fù)類(lèi)型序列沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，可能是選用的位點(diǎn)數(shù)量較少導(dǎo)致。通過(guò)對(duì)獲得的32個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行蛋白庫(kù)比對(duì)，共有20個(gè)位點(diǎn)獲得注釋?zhuān)@種位于外顯子區(qū)域的微衛(wèi)星位點(diǎn)更適合用于功能基因的定位和表達(dá)調(diào)控分析。初步開(kāi)發(fā)的32個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，為諸氏鯔蝦虎魚(yú)種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析、封閉群和近交系群體的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

表2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)32個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記特征

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)首次對(duì)諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，共獲得了47 979條Unigenes。在47 979條Unigenes中共查找到6 225個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，主要以單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)類(lèi)型為主。挑選部分二、三和四單元重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星序列，共設(shè)計(jì)76對(duì)引物，可穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的有55對(duì)，其中32對(duì)具有多態(tài)性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Prelim inary Screening and Characteristic Analysis of M icrosatellite M arkers from Transcriptome Sequences in Mugilogobius chulae

Cai Lei Yu Lujun Chen Xiaoqu Ye Huixin Chen Lin Li Jianjun
（Key Laboratory of Guangdong Laboratory Animals，Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangzhou510663）

In order to explore microsatellite markers in large-scale， the liver transcriptome of Mugilogobius chulae was sequenced by highthroughput sequencing technology. A total of 6 225（12.97%）microsatellite markers were screened from 47 979 Unigenes by microsatellite software， averagely 1 microsatellite marker in every 7.02 kb. The 6 225 microsatellite markers consisted of 226 repeat motifs， which mainly distributed in tri-nucleotide， quad-nucleotide and penta-nucleotide repeats. The mono-nucleotide repeats were of the most by number， accounting for 42.49% of all the microsatellite markers， the di-nucleotide repeats and tri-nucleotide repeats had the similar proportion（25.22% and 26.27% of all the markers， respectively）， the rest were the quad-nucleotide， penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeats， together accounting for 6.03%. A/T， AG/CT and AGC/TCG were the most frequent motifs in mono-nucleotide， di-nucleotide and tri-nucleotide repeats， respectively. In this research， 76 pairs of primers were designed and synthesized， by 55 pairs of them the target bands were successfully amplified， and 32 loci were of polymorphism. The results suggested that it was feasible to explore a number of microsatellite markers quickly based on the transcriptome sequences of M. chulae.

Mugilogobius chulae；transcriptome sequence；microsatellites；screening；distribution characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.020

2014-12-13

廣東省中國(guó)科學(xué)院全面戰(zhàn)略合作項(xiàng)目（2011B090300099），廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A020602008），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAK11B902）

蔡磊，男，碩士研究生，研究方向：水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制；E-mail：cailei17@163.com

李建軍，男，高級(jí)工程師，研究方向：水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及生態(tài)毒理學(xué)；E-mail：lijianjun1125@126.com