王一超 姚慶智 朱和平 陳麗霞 郭欣 楊倩倩 閆偉

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特　010018）

樟子松外生菌根中NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶的酶學性質研究

王一超 姚慶智 朱和平 陳麗霞 郭欣 楊倩倩 閆偉

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特010018）

對褐環(huán)乳牛肝菌-樟子松菌根組織、樟子松根組織及褐環(huán)乳牛肝菌純培養(yǎng)菌絲的異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）進行純化和酶學性質鑒定。通過硫酸銨分級沉淀及葡聚糖凝膠層析純化后的IDH進行SDS-PAGE電泳檢測，并進行3種來源酶的酶學性質鑒定。菌根組織、根組織及真菌純培養(yǎng)菌絲NADP-IDH對NADP+的Km值分別為10.7 μmol/L、11.4 μmol/L和22.1 μmol/L；對異檸檬酸的Km值分別為71.7 μmol/L、79.3 μmol/L和87.8 μmol/L。最適pH 分別為8.2、8.0和7.5，略偏堿性。菌根IDH和根IDH的最適反應溫度為45℃，真菌IDH的最適反應溫度為42℃。3種IDH的活性依賴于不同的二價金屬陽離子的存在，Mn2+、Mg2+存在時酶活性最強，Ca2+、Co2+、Cu2+和Zn2+對酶的活性有較強抑制作用。菌根真菌與樟子松形成外生菌根之后異檸檬酸脫氫酶的蛋白含量及酶活力都得到了提高。

樟子松；共生菌根；異檸檬酸脫氫酶；酶學性質

樟子松（Pinus sylvestris L.var.mongolica）是歐洲赤松（P. sylvestris L.）的一個地理變種，為松科松屬高大常綠喬木，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應性強和較速生等優(yōu)良特性，是我國“三北”重要的造林主要樹種之一［1，2］。近年來，在樟子松外生菌根真菌的篩選和鑒定中發(fā)現褐環(huán)乳牛肝菌（Suillusluteus（L.Fr）Gary，簡稱：SP.）與樟子松根系快速形成菌根，對樟子松幼苗的早期生長有明顯的促進作用，是樟子松菌根化育苗首選的菌根真菌［3］。

外生菌根的形成及其功能改變真菌和植物的基因表達，從而產生新的蛋白質模式和高度協(xié)調的代謝相互作用。外生菌根改變C和N同化酶的生物合成和分布，這些變化的性質取決于植物和真菌的共生。這些變化影響N-同化途徑的酶（如NADP-谷氨酸脫氫酶）糖酵解和磷酸戊糖途徑，導致菌根的氨基酸和碳水化合物含量大幅改變。因此，了解真菌和宿主植物的生化途徑和菌根功能的規(guī)律有助于了解外生菌根真菌共生對宿主植物代謝調節(jié)的影響。

異檸檬脫氫酶（isocitrate dehydrogenases，IDHs）在三羧酸（TCA）循環(huán)中催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸可為植物對氨的同化提供碳骨架，而NADPH可以維系細胞內的氧化還原平衡，幫助植物抵御氧化脅迫。目前IDH是國際上公認的研究蛋白質結構與功能關系、酶的催化與調節(jié)機制、蛋白質分子進化機制的最好模型之一［4］。根據輔酶特異性，IDH分為NAD-依賴型IDH和NADP-依賴型IDH［5］。目前為止，研究發(fā)現在生物體內NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶（NADP-IDH）有兩種方式存在，其中一種位于線粒體基質中，另一種位于細胞漿中，包括葉綠體和過氧化物酶體［5，6］。根據亞基組成，異檸檬酸脫氫酶可以分為兩種，第一種是單體異檸檬酸脫氫酶，這種類型的酶占極少數，分子量在80-100 kD之間；第二種是同源二聚體異檸檬酸脫氫酶，這種類型的酶占大多數，亞基分子量在40-50 kD之間［7］。大多數真核生物異檸檬酸脫氫酶屬于第二種類型，即同源二聚體［8］。目前國外關于IDH在裸子植物中的表達機制鮮有報道。國內關于樟子松外生菌根的研究大量集中于如何提高苗木質量，菌根真菌多樣性、菌根共生體的接種效應、組培苗菌根化等研究方向，而對樟子松與外生菌根真菌共生代謝機制還沒有相關報道。本研究分別從樟子松-褐環(huán)乳牛肝菌共生菌根組織、根組織及真菌純培養(yǎng)菌絲中提取純化IDH，并進行酶學性質研究，為深入了解樟子松IDH催化機制及共生真菌對樟子松IDH催化機制，功能和代謝的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樟子松根組織、外生菌根及褐環(huán)乳牛肝菌均為本實驗室人工無菌培養(yǎng)和保存。通用蛋白裂解抽提試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒、透析袋（截留分子量6 000-8 000）均購自上海捷瑞生物工程有限公司，葡聚糖凝膠Sephadex G-75購自Pharmacia公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1 粗酶液的提取及純化 將樣品液氮充分研磨后按通用蛋白裂解抽提試劑進行操作提取粗酶液，將上述粗酶液預冷至4℃，緩慢加入固體硫酸銨粉末至飽和度為25%，4℃靜置1 h后，4 ℃ 14 000 r/min離心15 min，取上清液加入固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，重復上述操作，每隔5%飽和度鹽析一次，直到終濃度至70%飽和度為止。所有沉淀均用20 mmol/L PBS（pH7.4）緩沖液溶解，裝入透析袋，在4℃，20 mmol/L PBS（pH7.4）緩沖液中透析。分級沉淀得到的蛋白液再用葡聚糖凝膠Sephadex G-75再次進行純化。SDS-PAGE鑒定純化后的純度。

1.2.2 酶活性測定 蛋白濃度的測定使用上海捷瑞生物工程有限公司生產的BCA法蛋白定量試劑盒，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）為標準蛋白，參照試劑盒操作手冊按Bradford法［9］操作。采用分光光度法測定酶活性，IDH的酶活測定體系為 20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L DL-isocitric acid trisodium或 0.5 mmol/L DL-isocitric acid trisodium、0.5 mmol/L NADP+。在25℃下，使用紫外分光光度計檢測反應過程中340 nm處光吸收值的變化。1個酶活力單位（U）是指在特定條件（25℃，其它為最適條件）下，在1 min內能轉化1 μmoL底物的酶量。

1.2.3 酶動力學參數測定 保持反應液體系中其它組分的終濃度不變，分別取不同濃度的NADP+或底物異檸檬酸的終濃度，用紫外分光光度計，25℃下檢測A340的變化，根據Lineweaver-Burk雙倒數法計算各酶對NADP+的Km值并計算催化常數Kcat。

1.2.4 最適反應pH測定 在標準的反應體系中以Mn2+為激活劑，NADP+為輔酶，在20 mmol/L（pH6.0-10.0）的Tris-HCl緩沖液中，25℃下測定各酶活性；每個pH設置3個平行，統(tǒng)計結果并依據公式計算出酶活性，把酶活力最高點設為100%，以pH值為橫坐標，以相對酶活力為縱坐標作圖，求出最適 pH。

1.2.5 酶最適溫度的測定及熱穩(wěn)定性測定 在標準的反應體系中以Mn2+為激活劑，NADP+為輔酶，在25-55℃之間，以5℃為間隔，測定IDH酶活力。以溫度為橫坐標，以相對酶活力為縱坐標繪圖，求出酶的最適反應溫度。將IDH在25-60℃之間，每隔5℃水浴20 min后立即放在冰上冷卻，測定酶殘余活力，以溫度為橫坐標，以相對殘余酶活力為縱坐標繪圖，確定不同溫度對酶活力的影響。

1.2.6 金屬離子依賴性的測定 25℃條件下，無Mn2+為激活劑，維持標準的反應溶液體系中其他成分不變，在體系中分別加入終濃度為5 mmol/L的MgCl2、MnCl2、CoCl2、CaCl2、ZnSO4、CuCl2、NaCl和KCl測定IDH活力，實驗獨立重復3次，統(tǒng)計結果并依據公式計算3種來源的異檸檬酸脫氫酶的酶活性。在已含有終濃度為5 mmol/L MnCl2的標準反應溶液體系中再分別加入上述離子，確定各金屬離子單獨存在或同時存在時對IDH活力的影響。

2 結果

2.1 SDS-PAGE電泳檢測

經多步純化后，SDS-PAGE電泳（圖1）顯示蛋白均為單一條帶。菌根組織和真菌純培養(yǎng)菌絲中的異檸檬酸脫氫酶亞基相對分子質量約46 kD左右，根組織中大小約45 kD左右。菌根和根組織IDH純化結果對應的硫酸銨分級沉淀梯度范圍是40%-45%，真菌純培養(yǎng)菌絲IDH對應的沉淀梯度為35%-40%。

圖1 異檸檬酸脫氫酶的SDS-PAGE電泳圖

2.2 酶動力學性質測定

由表1可知，當以Mn2+為激活劑時，菌根組織、根組織和真菌中IDH對NADP+的Km分別為10.7 μmol/L、11.4 μmol/L和22.1 μmol/L。菌根組織中IDH對NADP+的親和力分別高于根組織和真菌中IDH對NADP+的親和力，由Kcat/Km比值得出菌根組織中IDH對NADP+催化速率高于根和真菌中的IDH。

表1 異檸檬酸脫氫酶對NADP+的酶動力學參數

由表2可知，當以Mn2+為激活劑時，菌根組織中IDH對異檸檬酸的親和力分別高于根組織和真菌中IDH對NADP+的親和力，菌根組織中IDH對NADP+催化速率高于根和真菌中的IDH。菌根組織中的IDH對NADP+的親和力高于對異檸檬酸的親和力。

表2 異檸檬酸脫氫酶對異檸檬酸的酶動力學參數

2.3 NADP+-IDH的最適pH

在pH6.0-10.0的緩沖液中測定酶的活力，結果見圖2，菌根組織、根組織及真菌純培養(yǎng)菌絲NADP+-IDH的最適pH分別為8.2、8.0和7.5。菌根組織IDH、根組織IDH和真菌純培養(yǎng)菌絲IDH的最適pH都略偏堿性。

2.4 NADP+-IDH的最適溫度

采用標準測定體系，在25-55℃條件下分別測定酶活力，結果見圖3。菌根組織和根組織IDH的最適反應溫度為45℃，真菌純培養(yǎng)菌絲IDH的最適反應溫度為42℃。菌根組織IDH在35-50℃之間保持80%以上的活力，當溫度大于50℃時，菌根組織IDH活力下降緩慢，而根組織和真菌IDH活力下降較快。

圖2 pH對異檸檬酸脫氫酶活力的影響

圖3 溫度對3種異檸檬酸脫氫酶活力的影響

2.5 NADP+-IDH的熱穩(wěn)定性

將3種IDH在25-60℃之間處理20 min，分別測定酶的殘余活力，結果見圖4。菌根組織、根組織及真菌純培養(yǎng)菌絲NADP+-IDH在25-35℃之間活力較為穩(wěn)定，并在35℃時具有最大殘余活力，隨后酶活力顯著下降。在55℃時菌根IDH和根IDH酶活喪失了約80%，而真菌純培養(yǎng)菌絲IDH酶活下降了約90%。在40℃真菌純培養(yǎng)菌絲IDH的酶活下降了約50%，根組織IDH的活力下降了40%，而菌根組織IDH只下降了10%。在25-40℃之間，菌根組織IDH的活力要比根組織IDH和真菌純培養(yǎng)菌絲IDH的活力保持的較為穩(wěn)定。

圖4 溫度對異檸檬酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響

2.6 金屬離子對NADP+-IDH活性的影響

金屬離子對異檸檬酸脫氫酶活性影響的結果見表3。3種IDH均在Mn2+存在時酶活性最強，其次為Mg2+。Ca2+、Co2+、Cu2+和Zn2+都能使IDH活性損失80%-90%，其中Ca2+使真菌純培養(yǎng)菌絲IDH完全失活。K+和Na+也是IDH的強抑制劑。當反應液中已經有Mn2+存在的情況下再加入K+或Na+時，NADP+-IDH的酶活能夠完全恢復，Mn2+還可以部分恢復Co2+和Ca2+對菌根組織、根組織和真菌純培養(yǎng)菌絲IDH的抑制作用，但不能恢復Cu2+、Zn2+對菌根組織、根組織和真菌純培養(yǎng)菌絲IDH活性的影響。

表3 不同金屬離子對異檸檬酸脫氫酶活性的影響

3 討論

異檸檬酸脫氫酶是起源古老的一大類酶家族，從原核生物的真細菌（Eubacteria）、古菌（Archaea）到真核生物的真菌、動物及植物都有分布。它是研究蛋白質結構與功能關系、酶的催化與調節(jié)機制、蛋白質分子進化機制的良好模型之一［10］。

在本研究中，SDS-PAGE電泳結果與對應序列堿基理論值大小相符，表明3種酶均為異檸檬酸脫氫酶。3種來源的異檸檬酸脫氫酶的最適pH分別為8.2、8.0和7.5，表明樟子松在形成外生菌根后耐堿性有所提高。最適溫度分別為45℃、45℃和42℃。IDH在無離子存在下沒有活性，金屬離子依賴性表明3種來源的IDH是典型的二價金屬陽離子依賴型異檸檬酸脫氫酶，Mn2+是異檸檬酸脫氫酶的最強激活劑，其次為Mg2+，因此IDH實際催化的底物是異檸檬酸與Mn2+或Mg2+形成復合物。酶動力學參數結果為NADP-IDH對NADP+的Km值分別為10.7 μmol/L、11.4 μmol/L和22.1 μmol/L，對底物異檸檬酸的Km值分別為71.7 μmol/L、79.3 μmol/L和87.8 μmol/L，表明菌根IDH對底物的親和力都要高于根組織IDH和真菌純培養(yǎng)菌絲IDH。由以上結果分析表明，外生菌根的形成促進了異檸檬酸脫氫酶的活性和穩(wěn)定，這為在樟子松菌根系統(tǒng)中研究異檸檬酸脫氫酶基因功能、表達調控機制以及異檸檬酸脫氫酶與樟子松能量代謝之間的關系提供了有力的條件。本實驗只對樟子松外生菌根中異檸檬酸脫氫酶做了一個初步的探討，該酶的結構、功能、體內合成、運轉、儲存情況及表達等方面還有待于進一步研究。

4 結論

樟子松與褐環(huán)乳牛肝菌形成共生菌根之后，其菌根組織內異檸檬酸脫氫酶的蛋白含量、酶活力都得到了提高，這可能是由于樟子松形成外生菌根之后使其體內的異檸檬酸脫氫酶活性增強。

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（責任編輯 李楠）

Enzymatic Characterization of NADP-dependent Isocitrate Dehydrogenization in Pinus sylvestris var. mongolica Ectom ycorrhiza

Wang Yichao Yao Qingzhi Zhu Heping Chen Lixia Guo Xin Yang Qianqian Yan Wei
（Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018）

The purpose of the work is to purify the isocitrate dehydrogenase（IDH）in mycorrhizal tissue of Suillus luteus-Pinus sylvestris var. mongolica， root tissue of P. sylvestris var. mongolica and cultured fungal mycelia of S. luteus， and identify their enzymatic characterizations. The IDHs of 3 sources were purified by ammonium sulfate precipitation and glucan gel chromatography and tested by SDSPAGE electrophoresis， and enzymatic characterizations were studied. The Kmfor NADP+of mycorrhiza， root and cultured fungal mycelia were 10.7 μmol/L， 11.4 μmol/L and 22.1 μmol/L， respectively；the Kmfor isocitrate were 71.7 μmol/L， 79.3 μmol/L and 87.8 μmol/L， respectively. The optimal pH of mycorrhiza， root and cultured fungal mycelia were 8.2， 8.0 and 7.5 respectively；they were all slightly in alkaline. The optimal temperatures of the IDHs were 45℃ for mycorrhiza and root， and 42℃ for the fungus. The activities of 3 IDHs relied on the binding of divalent metal ions， the maximum activities of IDHs were observed when assayed with Mn2+or Mg2+as metal cofactor；however， Ca2+， Co2+， Cu2+and Zn2+dramatically inhibited the activity of IDHs. Conclusively， protein content and enzyme activity of mycorrhizal IDH have been increased.

Pinus sylvestris var. mongolica；mycorrhiza；isocitrate dehydrogenase；enzymatic characterization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.017

2014-11-26

內蒙古自治區(qū)自然科學基金項目（2012MS0509）

王一超，男，碩士，研究方向：微生物；E-mail：490999366@qq.com

姚慶智，男，博士，研究方向：微生物；E-mail：yaoqingzhi@163.com