扶文君，袁麗紅，施金晶

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

西紅花(Crocus sativus L.)為鳶尾科植物，作為藥用植物、珍貴調味劑、香料和染料具悠久歷史［1］?，F(xiàn)代藥理學研究表明西紅花柱頭提取物及其提純組分西紅花素、西紅花苦素、西紅花酸等在抗腫瘤［2］、免疫調節(jié)［3］、治療心腦血管系統(tǒng)疾?。?］以及抗抑郁［5］等方面具有良好功效。因此，西紅花已成為新藥開發(fā)的熱點。

傳統(tǒng)栽培條件下西紅花主要以球莖繁殖，但球莖繁殖系數低，退化現(xiàn)象嚴重，導致西紅花種源嚴重缺乏，并且西紅花的有效成分主要集中于柱頭，柱頭產量極低。利用植物細胞培養(yǎng)技術大規(guī)模生產西紅花素等藥理活性物質，是解決西紅花資源短缺的有效方法之一。

國內外有學者先后開展了西紅花細胞培養(yǎng)生產西紅花色素的研究工作并取得一定進展。Chen等［6－8］以西紅花芽、葉和花為外植體進行愈傷組織誘導，并從229株細胞系中篩選出生長快，不易褐化的細胞系Corm1，發(fā)現(xiàn)西紅花素1(Crocin)含量為1.677 mg/g，并采用了氣升式反應器和鼓泡塔式反應器對西紅花細胞液體懸浮培養(yǎng)生產西紅花素進行了初步研究。Visvanath等［9］以花芽為外植體，在含0.5 mg/L激動素和2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的MS培養(yǎng)基上誘導獲得紅色球狀愈傷組織和柱頭狀物，發(fā)現(xiàn)愈傷組織中西紅花苦素的含量高于天然柱頭，西紅花醛的含量與天然柱頭中含量相當，而西紅花素的含量卻低于天然柱頭。

對植物細胞懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長、產物形成和營養(yǎng)物質消耗動態(tài)規(guī)律的認識對于優(yōu)化和控制培養(yǎng)過程具有重要意義。陳書安等［12］對西紅花懸浮培養(yǎng)動力學的研究發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)時細胞的生長周期約為20 d，在20 d時生物量達到最大，為12.3 g/L，但是西紅花素的合成周期大約為28 d，在28 d時西紅花素的含量和產量達到最大，分別為95.8 mg/g和0.92 g/L，西紅花素的積累與細胞的生長之間的關系為部分耦聯(lián)型。

在植物細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基組分是影響細胞生長和代謝產物合成的主要因素。磷是構成核酸和磷脂的主要成分，也可用于合成高能磷酸化物ATP。因此，磷對能量代謝、細胞生長及代謝產物合成具有主要的調節(jié)作用［13］。較高濃度的磷能促進細胞生長，但會抑制次級代謝產物的合成，可能是由于多數次級代謝產物是通過磷酸化的中間產物合成的，而磷抑制了磷酸酶的活性［14］。Curtis等［15］研究發(fā)現(xiàn)罌粟細胞生長速率與胞內磷水平有關。本文研究了不同初始磷濃度對懸浮培養(yǎng)西紅花細胞生長、色素合成以及營養(yǎng)物質消耗規(guī)律的影響，以期為西紅花細胞培養(yǎng)生產西紅花色素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以無菌芽為外植體誘導和篩選得到的性狀優(yōu)良細胞系 S2［16］。

1.2 培養(yǎng)方法

將MS培養(yǎng)基(附加2 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤、30 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，滅菌前調pH 6.0～6.1)上培養(yǎng)30 d的西紅花細胞接種于3種不同初始磷濃度(低磷0.272 mmol/L、中磷0.544 mmol/L和高磷0.816 mmol/L)的1/2B5培養(yǎng)基(KNO3、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4和 NaH2PO4·H2O 減半，附加2 mg/L吲哚-3-乙酸、0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤和20 g/L蔗糖，滅菌前調pH 6.0～6.1)中，100 mL培養(yǎng)基接種15 g鮮細胞，(20±0.5)℃振蕩培養(yǎng)，轉速150 r/min。每隔2 d取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞生長的測定

收獲西紅花細胞培養(yǎng)物，離心，稱沉淀的細胞質量。準確稱取1.00 g鮮細胞置于烘箱(60℃)烘干至恒質量并稱質量，計算收獲干細胞的質量。

1.3.2 色素的測定

稱取1.50 g鮮細胞，加10 mL體積分數為60%甲醇，研磨至勻漿，8000 r/min離心15 min，量取色素溶液體積，測440 nm 處的吸光值 OD440［17］，測定時進行適當稀釋。每克干細胞中西紅花色素含量(mg/g)以相同色強下西紅花干燥柱頭質量(E1%1cm(440 nm)=150)表示。

1.3.3 營養(yǎng)物質的測定

蔗糖和果糖的測定采用蒽酮試劑法［18］測定，葡萄糖使用生物傳感儀測定采用水楊酸-濃硫酸法［19］測定采用苯酚-次氯酸鹽法［20］測定，磷采用磷鉬藍比色法［21］測定。

1.4 數據分析

1)所有實驗結果均為3次重復的平均值。

2)細胞比生長率(μ)的計算。細胞比生長率μ=(dX/dt)/X，式中X為細胞生物量(g/L)，t為時間(d)，dX/dt為瞬時生長率。因此，μ可由瞬時生長率求出。瞬時生長率由細胞生長模型求出。根據本實驗測定的西紅花細胞培養(yǎng)過程中“t-細胞生物量”結果確定描述細胞生長特征的生長模型并對其進行擬合，利用SPSS軟件進行非線性回歸分析求出模型參數，再由生長模型求得瞬時生長率表達式，根據該表達式計算出各時間下瞬時生長率，最后求出細胞比生長率μ。

3)色素比合成率(ρ)的計算。色素比合成率ρ=(dP/dt)/X，式中P為色素產量(mg/L)，由生物量與色素含量計算求得，dP/dt為色素瞬時合成率。瞬時合成率由產物合成模型求出。根據本實驗測定的西紅花細胞培養(yǎng)過程中“t-色素產量”結果確定描述細胞色素合成特征的產物合成模型并對其進行擬合，利用SPSS軟件進行非線性回歸分析求出模型參數，再由產物模型求得瞬時合成率表達式，根據該表達式計算出各時間下瞬時合成率，最后求出色素比合成率ρ。

2 結果與討論

2.1 不同初始磷濃度下西紅花細胞生長和色素合成

西紅花細胞的生長過程曲線如圖1(a)。由圖1(a)可知:不同初始磷濃度下細胞生長曲線均呈S形，0～3 d表現(xiàn)短暫延滯期，生物量變化不大，3 d后進入快速生長期，低磷和中磷濃度下細胞在15～21 d處于穩(wěn)定期，最大生物量分別為9.87和11.00 g/L，而高磷濃度下細胞在12～18 d處于穩(wěn)定期，最大生物量為11.26 g/L，隨后細胞進入衰亡期，生物量呈下降趨勢。不同初始磷濃度對西紅花細胞的生長有一定影響，隨著磷濃度的增加，細胞的生物量增加，并且高磷濃度下穩(wěn)定期提前。

圖1 初始磷濃度對細胞生長和色素含量的影響Fig.1 Effects of initial phosphate concentrations on cell growth and pigment content

西紅花的色素合成特征如圖1(b)。由圖1(b)可知:不同初始磷濃度下西紅花細胞色素含量的變化趨勢基本相同，在延滯期色素含量變化不大，隨著細胞的快速生長，色素含量快速上升，細胞到達衰亡期時，色素含量仍持續(xù)上升，當細胞處于衰亡期后期時，色素含量快速下降，色素可能被后期細胞自溶所釋放的酶降解。高磷濃度下，色素含量在27 d達到最高，為49.25 mg/g，低磷和中磷濃度下，色素含量均在30 d達到最高，分別為41.23和44.72 mg/g。不同初始磷濃度對西紅花細胞的色素合成能力也具有一定影響，隨著磷濃度的增加，色素含量提高。

為了進一步比較磷對西紅花細胞生長以及色素合成的影響，計算了培養(yǎng)過程中的比生長率與比合成率。

比生長率是描述細胞生長的一個重要參數。由圖1(a)可以看出:細胞生長近似于S形曲線，通常采用Von Bertalanffy生長公式(X=k(1 －ea－rt)3)、Gompertz曲線(X=ke－e^(a－rt))和 Logistic 方程(X=k/(1+ea－rt))描述 S 形生長過程;a，r，t表示常數。根據本實驗測定的西紅花細胞培養(yǎng)過程中“t-細胞生物量”結果對3種曲線進行擬合，低磷、中磷和高磷情況下擬合優(yōu)度(R2)分別為0.899、0.954、0.914(Logistic方程)，0.892、0.949、0.904(Von Bertalanffy 生長公式)，0.894、0.950、0.907(Gompertz 曲 線)?？?見Logistic方程的擬合結果優(yōu)于其他2種S形曲線。因此，選用Logistic方程對生長曲線進行擬合。利用SPSS軟件進行非線性回歸分析，采用的計算方法為麥夸法。所得生長模型見式(1)～(3)。

根據式(1)～(3)求得瞬時生長率(IGR)的表達式見式(4)～(6)。

根據式(4)～(6)計算瞬時生長率(IGR)與比生長率(μ)見圖 2。

圖2 初始磷濃度對瞬時生長率和比生長率的影響Fig.2 Effects of initial phosphate concentrations on instantaneous growth rate and specific growth rate

由圖2可以看出:培養(yǎng)過程中不同初始磷濃度下比生長率隨著時間變化而呈下降趨勢，但不同磷濃度下比生長率及其變化表現(xiàn)不同。9 d前高磷濃度下細胞比生長率較高，9 d后瞬時比生長率低于中磷水平，說明在9 d前高磷濃度有利于細胞生長，9 d后中磷濃度適宜。

比合成率是描述色素合成的一個重要參數。由圖1可以看出，西紅花細胞生長與色素合成不完全同步，屬于部分耦聯(lián)型，因此采用Luedeking-Piret方程(式(7))對衰亡期前色素合成動力學進行描述。

式中:α表示與細胞生長有關的產物合成常數;β表示與生物量相關的產物合成常數。

根據本實驗測定的西紅花細胞培養(yǎng)過程中“t-色素產量”結果對方程進行擬合，利用SPSS軟件進行非線性回歸計算，計算方法為麥夸法。所得色素合成模型見式(8)～(10)。

低磷、中磷和高磷情況下擬合優(yōu)度(R2)分別為0.988、0.988、0.983。根據式(8)～ (10)求得色素瞬時合成率(ISR)的表達式見式(11)～(13)。

根據式(11)～(13)計算色素瞬時合成率(ISR)和比合成率(ρ)見圖3。

圖3 初始磷濃度對色素瞬時合成率和比合成率的影響Fig.3 Effects of initial phosphate concentrations on pigment instantaneous biosynthesis rate and specific biosynthesis rate

由圖3可以看出:不同初始磷濃度下比合成率隨著時間變化而呈上升趨勢，說明該培養(yǎng)基有利于色素的合成。但過高、過低磷濃度下的色素比合成率都低于中磷濃度，說明中磷濃度最有利于色素的合成。不同培養(yǎng)階段，色素比合成率的變化趨勢也不同，在9 d前色素比合成率上升較為平緩，9 d后色素比合成率快速上升，并且高磷濃度下比合成率上升較快，15 d時高于低磷濃度。

2.2 不同初始磷濃度下營養(yǎng)物質的吸收利用及其與細胞生長和色素合成的關系

2.2.1 不同初始磷濃度下碳源的吸收利用

蔗糖是西紅花細胞培養(yǎng)的主要碳源。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液中蔗糖變化見圖4。由圖4可知:在快速生長期前期(6 d)質量分數為95%蔗糖被降解，磷對其降解速率沒有影響。0～3 d時由于蔗糖快速降解，培養(yǎng)液中的葡萄糖和果糖含量快速提高。隨后由于葡萄糖和果糖被吸收利用，培養(yǎng)液中葡萄糖和果糖濃度下降。葡萄糖在6～9 d時被迅速吸收利用，9 d時50%葡萄糖被吸收利用，隨后吸收利用速率降低，18 d時質量分數85%葡萄糖被吸收利用。果糖在3～21 d幾乎以一定的速率被細胞吸收利用，21 d時質量分數85%果糖被細胞吸收利用，可見西紅花細胞優(yōu)先吸收利用葡萄糖。不同初始磷濃度對蔗糖降解和葡萄糖的吸收利用沒有明顯影響，但隨著磷濃度的提高，果糖的吸收利用速率提高。在西紅花細胞培養(yǎng)過程中蔗糖消耗是蔗糖先被降解成葡萄糖與果糖，再以葡萄糖與果糖的形式被細胞吸收利用。

圖4 不同初始磷濃度下碳源的變化曲線Fig.4 Curves of carbon sources at different initial phosphate concentrations

2.2.2 不同初始磷濃度下氮源的吸收利用

圖5 不同初始磷濃度下氮源的變化曲線Fig.5 Curves of nitrogen sources at different initial phosphate concentrations

2.2.3 營養(yǎng)物質的消耗與細胞生長、色素合成的關系

綜上所述，18 d時85%葡萄糖被吸收利用，21 d時85%果糖被吸收利用，21 d時80%被吸收利用，穩(wěn)定期后期碳、氮源基本被消耗完，此時生物量不再增加，色素含量繼續(xù)上升，說明碳、氮源的不足影響了細胞生長，但對色素合成影響不大。從圖5(b)和圖6可以看出，在高磷條件下培養(yǎng)0～9 d時細胞對的吸收率明顯高于低磷和中磷，并且隨著的吸收率的提高，色素比合成率增長率亦隨之提高，因此，提高的吸收率是提高色素合成能力的關鍵。

3 結論

不同初始磷濃度下細胞生長曲線均呈S形，均經歷衰亡期、快速生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。隨初始磷濃度的提高細胞生物量提高，高磷濃度下細胞最大生物量達11.26 g/L。不同初始磷濃度下比生長率呈下降趨勢，磷對比生長率有一定影響，在培養(yǎng)前9 d高磷濃度比生長率最高，9 d后中磷濃度比生長率最高。進入快速生長期色素開始合成，到衰亡期色素仍繼續(xù)合成，并且色素含量達到最高，隨后色素開始降解，含量下降，色素合成期比細胞生長期長。因此，西紅花細胞培養(yǎng)過程中色素合成與細胞生長的關系為部分耦聯(lián)型。隨初始磷濃度的提高色素含量提高，高磷濃度下色素含量最高達49.25 mg/g。在培養(yǎng)過程中色素比合成率呈上升趨勢，磷對色素比合成率有一定影響，中磷濃度下比合成率最高。

圖6 不同初始磷濃度下比合成率與吸收的關系Fig.6 Relationship between specific biosynthesis rate andabsorption at different initial phosphorus concentration

在培養(yǎng)過程中，快速生長期前期(6 d)蔗糖被降解為葡萄糖和果糖而被迅速吸收利用。培養(yǎng)18 d時85%葡萄糖被吸收利用，21 d時85%果糖被細胞吸收利用。培養(yǎng)3 d時胞外95%被細胞迅速吸收利用，而吸收利用較為緩慢，21 d時80%被吸收利用。提高初始磷濃度，對蔗糖的降解、葡萄糖與的吸收利用沒有明顯影響，但果糖和的吸收利用速率提高。在高磷濃度下培養(yǎng)0～9 d時細胞對的吸收率明顯高于低磷和中磷。提高的吸收率是提高色素合成能力的關鍵。穩(wěn)定期后期碳、氮源的不足影響了細胞生長，但對色素合成影響不大。

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