付建紅，祁 瑞，鄭 靜，周晨婕，陳清西

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實驗室，新疆 烏魯木齊 830054;2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基的含銅氧化還原酶［1］，廣泛存在于微生物和動植物中。它能夠催化單酚羥化成二酚(單酚酶活性)，并把二酚氧化成醌(二酚酶活性);醌在非酶促條件下形成反應(yīng)終產(chǎn)物黑色素［2］。由于酪氨酸酶既是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，又與昆蟲的傷口愈合與發(fā)育［3］，果蔬的褐變［4］有密切關(guān)系，所以抑制酪氨酸酶活性是降低產(chǎn)生的黑色素量、防止褐變的有效途徑之一。篩選高效、安全的酪氨酸酶抑制劑，對于果蔬保鮮、皮膚美白和生物殺蟲劑的研制都具有重要意義。國內(nèi)外對酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分離純化、催化機(jī)制、活性調(diào)控以及酪氨酸酶基因在生物體內(nèi)的生理作用等方面，目前其三維結(jié)構(gòu)仍未得到［1］。對于該酶抑制劑的研究，國內(nèi)外很多學(xué)者致力于尋找特異的、高效的酪氨酸酶抑制劑，研究其抑制作用機(jī)制及抑制劑的應(yīng)用［5］。

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，尤其是許多中藥材中含量豐富，屬于酚類化合物。研究表明:黃酮具有多種藥理活性，其中包括抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因誘變作用等［6］。Kubo 等［7］從天然植物(茴芹、腰果等)中提取了一系列酪氨酸酶抑制劑，經(jīng)檢測主要為黃酮類天然產(chǎn)物，測定了它們對蘑菇酪氨酸酶的效應(yīng)機(jī)制。Xie等［8］研究了一系列黃酮類化合物對酪氨酸酶活力的影響，實驗結(jié)果表明:櫟精、高良姜精、非瑟酮、3，7，4-三羥基黃酮和桑色素等黃酮醇都是酪氨酸酶的競爭性抑制劑。天山花楸(Sorbus tianshanica Ruprer)為薔薇科花楸屬的多年生小喬木或灌木，主產(chǎn)新疆。天山花楸是傳統(tǒng)的民族藥用植物，主治肺結(jié)核、哮喘、咳嗽、胃炎、胃痛、維生素A和 C缺乏癥［9］，主要含有黃酮類、氰苷類、萜類、有機(jī)酸、甾體化合物和多種酶等，其中黃酮類化合物是其主要活性成分［10］。目前尚未見有關(guān)天山花楸提取物抑制酪氨酸酶活力的報道。筆者采用超聲波輔助法提取天山花楸黃酮類物質(zhì)。以天山花楸黃酮類物質(zhì)作為效應(yīng)物，研究其對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影響及抑制作用機(jī)制，探討抑制劑和酶分子間結(jié)合作用的分子模型，以期為天山花楸黃酮類物質(zhì)在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

天山花楸的莖枝采自新疆巴里坤天山山脈南麓;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所;蘑菇酪氨酸酶(比活力為6680 U/mg)、L-多巴(LDOPA)、二甲亞砜(DMSO)均購自Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;使用的蒸餾水為去離子重蒸水，無特別說明，該文中溶液均為去離子重蒸水配制。

1.2 主要儀器

KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;DU800型分光光度計，美國貝克曼庫爾特有限公司;DKB-501A型超級恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;高速粉碎機(jī)，姜堰市銀河儀器廠。

1.3 天山花楸黃酮類物質(zhì)的提取

將天山花楸枝條洗凈、低溫干燥后粉碎。稱取天山花楸枝粉末6 g，加入300 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液攪拌均勻，置于超聲波清洗器中進(jìn)行超聲波處理，超聲波功率為200 W，超聲溫度為30℃，超聲時間為120 min;真空抽濾提取物，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后得到天山花楸黃酮提取物。將提取物用含體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO的磷酸鹽緩沖液溶解，制成15 mg/mL的提取物溶液，再分別吸取0、25、50、75 和 100 μL 提取物溶液加入到3.0 mL酪氨酸酶測活體系中，得到質(zhì)量濃度分別為0、0.125、0.25、0.375 和 0.5 mg/mL 的天山花楸黃酮提取物溶液。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定參照文獻(xiàn)［11］。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品13.2 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液溶解，配制質(zhì)量濃度為0.528 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL置于10 mL容量瓶內(nèi)，分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 和 0 mL 體積分?jǐn)?shù)為 60% 乙醇溶液;在此體系中依次分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaNO2溶液0.5 mL(搖勻靜置6 min)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Al(NO3)3溶液0.5 mL(放置6 min)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液4.0 mL，最后用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液定容，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測定吸光度(A510)。用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液作空白參比液，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 對酪氨酸酶二酚酶活力影響的測定

酪氨酸酶二酚酶活力的測定參照文獻(xiàn)［12］。以0.5 mmol/L的L-DOPA為底物，在0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)的3.0 mL酶測活體系中，先加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度的提取物溶液于比色杯中，再加入2.8 mL底物溶液和0.1 mL蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混勻，在30℃恒溫條件下測定A475隨時間的增長直線，從直線斜率即可求得二酚酶活力，產(chǎn)物的消光系數(shù)(ε)按 ε =3700 L/(mol·cm)計算［13］。酶活力單位(U)定義為每分鐘催化L-DOPA氧化產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物的酶量。以相對酶活力對提取物濃度作圖，得到提取物的濃度效應(yīng)曲線。

相對酶活力按式(1)計算。

式中:Vc為對照組(不含提取物)的酶活力(OD475·min－1)，Vs為樣品組(含有不同質(zhì)量濃度的提取物)的酶活力(OD475·min－1)。

1.6 對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制機(jī)制考察

在酶活力測定體系中，固定底物(L-DOPA)濃度為0.5 mmol/L，加入不同質(zhì)量濃度的天山花楸黃酮提取物溶液，改變酪氨酸酶的加入量，測定酶活力與酶質(zhì)量濃度的關(guān)系，進(jìn)而測定酶促反應(yīng)速率與酶質(zhì)量濃度的關(guān)系。根據(jù)酶促反應(yīng)速度與酶質(zhì)量濃度的相關(guān)性判斷天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用機(jī)制。

在測活體系中固定酪氨酸酶的質(zhì)量濃度，加入不同質(zhì)量濃度的天山花楸黃酮提取物溶液，改變底物(L-DOPA)的濃度，測定不同濃度底物下的酶促反應(yīng)初速率，初速率是通過吸光度的改變值求得，即酶反應(yīng)初速率=1000A475/3.7。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，比較酶催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，包括表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(vmax)的變化來判斷抑制類型，并以直線斜率和縱軸截距對抑制劑(提取物)濃度二次作圖，求得對游離酶的抑制常數(shù)(KI)和對酶－底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)。

1.7 體外抗氧化活性的測定

采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)法測定天山花楸黃酮提取物清除自由基的能力［14］。在3.0 mL測活體系中，依次加入1.0 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH5.5)，1.87 mL無水乙醇，0.1 mL 3 mmol/L的DPPH·(溶于乙醇)，最后加入0.03 mL終質(zhì)量濃度為0～0.525 mg/mL的天山花楸黃酮提取物溶液，立刻混勻，在25℃恒溫條件下反應(yīng)20 min，測定517 nm處的吸光度值。以加入Vc為對照，計算DPPH·的相對活性，計算方法參照文獻(xiàn)［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 天山花楸黃酮的提取工藝

以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A=11.425ρ－0.0179，相關(guān)系數(shù) R=0.9999，表明在0.02～0.10 mg/mL內(nèi)吸光度和蘆丁質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

天山花楸黃酮類物質(zhì)提取的單因素試驗主要考察提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、超聲時間和料液比對黃酮得率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，確定超聲波輔助法提取天山花楸黃酮的最佳提取工藝為6 g天山花楸枝條粉末，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液300 mL，攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理，超聲波功率為200 W，超聲溫度30℃，超聲時間120 min。最后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解天山花楸黃酮提取物，于510 nm下測定吸光值。根據(jù)回歸方程得到天山花楸提取物中黃酮的質(zhì)量濃度，黃酮得率為2.75%。

2.2 對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影響

以天山花楸黃酮提取物為效應(yīng)物，研究它對蘑菇酪氨酸酶活力的影響。在以L-DOPA為底物的測活體系中，加入不同質(zhì)量濃度的天山花楸黃酮提取物(效應(yīng)物)溶液，以不加效應(yīng)物為對照，測定相對酶活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:天山花楸黃酮提取物導(dǎo)致酶活力下降一半的濃度(IC50)為0.27 mg/mL，對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，隨著效應(yīng)物質(zhì)量濃度的增大，相對酶活力呈指數(shù)下降。

2.3 對蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用機(jī)制的判斷

在固定底物(L-DOPA)濃度的測活體系中，加入不同質(zhì)量濃度的天山花楸黃酮提取物溶液，改變酶的加入量，測定經(jīng)天山花楸黃酮提取物作用后酪氨酸酶二酚酶活力與加入酶量之間的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:酶活力對酶量作圖得到一組通過原點的直線。隨著天山花楸黃酮提取物質(zhì)量濃度的增大，直線的斜率逐漸下降，說明天山花楸黃酮提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過程。也就是說天山花楸黃酮提取物是通過抑制酶活力而導(dǎo)致催化效率降低，而不是通過減少有效酶量導(dǎo)致酶活力下降。

圖1 天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶二酚酶活力的影響Fig.1 Effect of flavonoid extract of Sorbus tianschanica Ruper stems on activity of diphenolase of tyrosinase

圖2 天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用機(jī)制Fig.2 Determination of the inhibitory mechanism of flavonoid extract from Sorbus tianschanica Ruper on diphenolase of tyrosinase

2.4 對蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制類型和抑制常數(shù)的測定

在酶活力測定體系中，固定酪氨酸酶的質(zhì)量濃度，改變底物L(fēng)-DOPA濃度，測定不同濃度底物對酶促反應(yīng)速度的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來判斷抑制機(jī)制類型，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:隨著天山花楸黃酮提取物質(zhì)量濃度的增大，直線的斜率和截距也相應(yīng)增大，Km增大而vmax減小，表明效應(yīng)物既影響酶對底物的親和力也影響酶的催化作用。天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制類型表現(xiàn)為混合型，說明該提取物既能與游離酶(E)結(jié)合，也能與酶-底物配位化合物(ES)結(jié)合，但抑制作用強(qiáng)度不同。以雙倒數(shù)直線的斜率(圖3(b))和縱軸截距(圖3(c))對天山花楸黃酮提取物質(zhì)量濃度二次作圖，均為直線，分別求出天山花楸黃酮提取物對游離酶的抑制常數(shù)(KI)為0.218 mg/mL和對酶-底物配位化合物的抑制常數(shù)(KIS)為0.313 mg/mL。KI＜KIS，說明天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶游離酶的抑制作用較對酶-底物配位化合物的抑制作用強(qiáng)，底物對酶被天山花楸黃酮提取物的抑制有一定的保護(hù)作用。

圖3 天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶二酚酶的抑制類型和抑制常數(shù)的測定Fig.3 Detemination of inhibition type and inhibition constant of flavonoid extract from Sorbus tianschanica Ruper on diphenolase of tyrosinase

2.5 天山花楸黃酮提取物的體外抗氧化活性

采用DPPH·法研究天山花楸黃酮提取物清除自由基的活性。在DPPH·活性的測定體系中，加入不同質(zhì)量濃度的天山花楸黃酮提取物溶液，以不加提取物為對照，測定DPPH·的相對活性，實驗結(jié)果見圖4。由圖4可知:導(dǎo)致DPPH·活性下降一半的天山花楸黃酮提取物的質(zhì)量濃度(IC50)為0.18 mg/mL，同時測定了陽性對照 Vc的 IC50為0.021 mg/mL(圖5)，可見天山花楸黃酮提取物具有一定的清除DPPH·的能力。

圖4 天山花楸黃酮提取物的抗氧化活性Fig.4 Effect of flavonoid extract from Sorbus tianschanica Ruper on activity of antioxidation

圖5 Vc的抗氧化活性Fig.5 Effect of vitamin C on activity of antioxidation

3 結(jié)論

1)以天山花楸枝條為原料，結(jié)合超聲波輔助乙醇方法對天山花楸中的黃酮進(jìn)行提取，將加入到體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液的天山花楸枝條粉末，攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理，在超聲波功率200 W，超聲溫度30℃，超聲時間120 min的工藝條件下黃酮得率最高。

2)天山花楸黃酮提取物對蘑菇酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制活性，導(dǎo)致酪氨酸酶二酚酶活力下降50%所需的提取物濃度(IC50)為0.27 mg/mL。酶的抑制動力學(xué)研究表明，天山花楸黃酮提取物對酪氨酸酶二酚酶表現(xiàn)為混合型可逆抑制，即該提取物既通過與底物L(fēng)-DOPA競爭蘑菇酪氨酸酶的活性中心來抑制酶活性，又通過反應(yīng)產(chǎn)生酶-底物-抑制劑三元配位化合物(EIS)而產(chǎn)生抑制作用。DPPH·實驗顯示天山花楸黃酮提取物具有一定的抗氧化活性，其對酶的抑制作用機(jī)制可能與其抗氧化活性作用機(jī)制相關(guān)。

天山花楸作為新疆豐富且尚未充分利用的資源，若能妥善加以利用，研制新型的酪氨酸酶抑制劑，則能擴(kuò)大資源的利用范圍，具有較高的實際應(yīng)用價值。

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