秦 燕，李文豪，汪 斌，何冰芳

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

光學(xué)純的α-苯乙醇及其衍生物是許多醫(yī)藥、精細(xì)化學(xué)品及香料等物質(zhì)的合成中間體［1］，其中對位取代的α-苯乙醇作為代表，其R和S兩種對映異構(gòu)體均為重要的醫(yī)藥中間體，(S)-1-(4-甲基苯基)乙醇是合成食品添加劑姜黃酮的中間體［2］;(S)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇是1-(4-甲基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-乙硫醇的中間體［3］;(R)-1-(4-甲基苯基)乙醇則可以用來合成具有防癌功能的硒化合物［4］，(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇可以合成環(huán)丙烷甲酸中間體，進(jìn)而合成用于治療癌癥的溶血磷脂酸受體的異惡唑基拮抗劑［5］等。目前，對位取代α-苯乙醇衍生物的單一對映體可以通過不對稱合成、化學(xué)拆分和酶法拆分等獲得，其中酶法催化的拆分反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、手性選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，因而越來越受到人們的重視［6］。

脂肪酶是一類廣泛應(yīng)用于類脂化合物水解、合成以及酯交換的高效生物催化劑，多數(shù)脂肪酶在催化過程中具有高度的區(qū)域選擇性、立體選擇性，并且在反應(yīng)中不需要添加輔因子等特點(diǎn)。另外，脂肪酶可以接受眾多復(fù)雜的非天然化合物作為底物，因此，利用脂肪酶的高度立體選擇性，在有機(jī)相中通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行對位取代的α-苯乙醇衍生物的手性拆分備受人們的關(guān)注。然而現(xiàn)有報道中對1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的酶法拆分的研究比較少，其中Hatzakis等［7］對脂肪酶拆分1-(4-甲氧基苯基)乙醇做過初步研究，但是其在拆分過程中轉(zhuǎn)化率較低且產(chǎn)物e.e.p值僅為88%;王晨等［8］研究了多種脂肪酶對1-(4-甲氧基苯基)乙醇拆分，其中Novozyme 435及PS IM(P.cepacia)脂肪酶顯示了很好的拆分效果，然而在整個反應(yīng)體系中底物濃度低，酶用量大。因而，進(jìn)一步開發(fā)能夠高效拆分1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的脂肪酶具有重大意義。

本課題組Yao等［9］篩選獲得1株耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌Burholderia ambifaria YCJ01，該菌株所產(chǎn)的脂肪酶YCJ01不僅在60℃下穩(wěn)定而且用25%(體積分?jǐn)?shù))有機(jī)溶劑(甲醇、二甲基亞砜(DMSO)等)處理60 d后仍有較高的活力，展現(xiàn)出了優(yōu)異的溫度穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性。在有機(jī)相催化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

本文中，筆者擬采用脂肪酶YCJ01對1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的選擇性酯化拆分，優(yōu)化反應(yīng)工藝，以期實(shí)現(xiàn)這兩種醫(yī)藥中間體的高效手性拆分。

1 材料與方法

1.1 材料

脂肪酶產(chǎn)生菌B.ambifaria YCJ01(CCTCC No:2011058)，該脂肪酶核酸序列GenBank登錄號為JQ733583［10］。1-(4-甲基苯基)乙醇購于東京化成工業(yè)株式會社。1-(4-甲氧基苯基)乙醇購于阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司。其他試劑均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，g/L):酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂 20。

發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精8 g/L、酵母粉5.2 g/L、牛肉膏7.8 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO42 g/L、菜籽油5 mL/L、TritonX-1000.75 mL/L。pH 8.0。

1.3 脂肪酶粗酶粉的制備

從凍存管中接菌株B.ambifaria YCJ01于LB平板上，30℃培養(yǎng)12 h后，接取一環(huán)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)72 h。

取脂肪酶發(fā)酵上清液，置冰水浴中，收集(NH4)2SO4飽和度為65%時沉淀下來的蛋白，在pH7.0、50 mmol/L的磷酸緩沖液中透析1 d后，冷凍干燥得脂肪酶YCJ01粗酶粉。

1.4 脂肪酶催化拆分對位取代α-苯乙醇

轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)在5 mL具塞反應(yīng)瓶中進(jìn)行。初始反應(yīng)體系為2 mL預(yù)脫水的異丙醚，拆分底物(R，S)-α-苯乙醇衍生物 30 mmol/L，?；w(乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯)300 mmol/L，添加脂肪酶YCJ01酶粉10 mg。在180 r/min的恒溫?fù)u床中反應(yīng)一定時間，檢測底物的轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度。

采用戴安P680型高效液相色譜(HPLC)檢測。1-(4-甲基苯基)乙醇的檢測條件:色譜柱為Chiral OJ-H柱(4.6 mm×250 mm);流動相為正己烷/異丙醇溶液(體積比為95∶5)。［1-(4-甲氧基苯基)乙醇的檢測條件:色譜柱為Chiral AD-H柱(4.6 mm×250 mm);流動相為正己烷/異丙醇溶液(體積比為85∶15)］。其余條件如下:流速1 mL/min;檢測波長220 nm;柱溫30℃。底物1-(4-甲基苯基)乙醇的R型及S型對映體的保留時間分別為10.9 min和12.6 min，產(chǎn)物酯的R型及S型對映體的保留時間分別為6.7和7.1 min;底物1-(4-甲氧基苯基)乙醇的R型及S型對映體的保留時間分別為6.2和6.4 min，產(chǎn)物酯的R型及S型對映體的保留時間分別為3.9和4.4 min。

底物 轉(zhuǎn) 化 率 (C)=e.e.s/(e.e.s+e.e.p)×100%，底物對映體過量值(e.e.s)=(cS－cR)/(cS+cR)×100%，產(chǎn)物對映體過量值(e.e.p)=(cS1－cR1)/(cS1+cR1)×100%，對映體選擇率E=ln［1－C(1+e.e.p)/ln［1 －C(1 －e.e.p)］。式中:cR、cS為反應(yīng)后殘留2個對映體的濃度(mmol/L)，cR1、cS1為反應(yīng)后生成的酯的2個對映體的濃度(mmol/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法催化對位取代α-苯乙醇手性拆分反應(yīng)中酯化產(chǎn)物構(gòu)型分析

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于α-苯乙醇衍生物分析的相關(guān)報道，筆者采用Chiral OD-H柱(4.6 mm×250 mm)對反應(yīng)中底物和產(chǎn)物的構(gòu)型進(jìn)行了分析，結(jié)合文獻(xiàn)［8，11］可知，對于(R，S)-1-(4-甲基苯基)乙醇，脂肪酶YCJ01可以選擇性地催化S型的底物生成酯化產(chǎn)物S型的乙酰-對甲基苯乙酯，光學(xué)純的R-1-(4-甲基苯基)乙醇并未發(fā)生反應(yīng)。而對于(R，S)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇則結(jié)果相反，脂肪酶YCJ01優(yōu)先選擇催化R型底物生成R型的丁酰-對甲氧基苯乙酯，S型的1-(4-甲氧基苯基)乙醇未發(fā)生反應(yīng)，其相關(guān)選擇性的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。據(jù)此可以判斷其2種底物的反應(yīng)式，如圖1所示。

圖1 脂肪酶YCJ01拆分對位取代α-苯乙醇Fig.1 Lipase YCJ01 catalyzed transesterification resolution of para-(R，S)-α-phenylethanol

2.2 溫度對拆分反應(yīng)的影響

在生物催化反應(yīng)中，溫度既影響酶的活力，也影響酶的立體選擇性，因而對反應(yīng)的影響很大［12］?？疾鞙囟葘χ久竃CJ01拆分1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇反應(yīng)的影響，反應(yīng)6 h的結(jié)果見圖2。由圖2可知:隨著溫度的升高底物1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的轉(zhuǎn)化率和e.e.s值均呈現(xiàn)先升后降的過程，但是e.e.p值在整個升溫過程中變化不大，說明脂肪酶YCJ01的選擇性并沒有發(fā)生變化。1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別在50、30℃下達(dá)到最高，分別為49.59%和49.34%。所以，脂肪酶 YCJ01拆分1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的最適反應(yīng)溫度分別為50、30℃。

2.3 ?；w與底物摩爾比對拆分反應(yīng)的影響

圖2 溫度對拆分反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of temperature on chiral resolution of α-phenylethanol

對于拆分反應(yīng)而言，不同的底物有不同的最佳?；w且酰基供體的濃度直接影響酶催化反應(yīng)的平衡，從而影響反應(yīng)的速度［13］。因此，考察1-(4-甲基苯基)乙醇與乙酸乙烯酯的摩爾比和1-(4-甲氧基苯基)乙醇與丁酸乙烯酯的摩爾比對脂肪酶YCJ01催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響，反應(yīng)6 h的結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著?；w比例的提高，底物轉(zhuǎn)化率和e.e.s值先升后降。這可能是由于隨著?；w比例的提高，反應(yīng)平衡向正方向進(jìn)行，但過高的比例引起底物抑制且降低了反應(yīng)速率，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和e.e.s值下降。E值變化不大，說明脂肪酶YCJ01的選擇性并沒有發(fā)生變化。當(dāng)1-(4-甲基苯基)乙醇與乙酸乙烯酯和1-(4-甲氧基苯基)乙醇與丁酸乙烯酯的摩爾比分別為1∶6和1∶5時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，分別為49.64%和49.79%。所以分別選取1-(4-甲基苯基)乙醇與乙酸乙烯酯的摩爾比為1∶6和1-(4-甲氧基苯基)乙醇與丁酸乙烯酯的摩爾比為1∶5時為最適反應(yīng)摩爾比。

圖3 ?；w與底物的摩爾比對拆分反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of mole ratio of acyl doner to substrate on chiral resolution

2.4 底物濃度對拆分反應(yīng)的影響

在普通的生物催化體系中，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，不存在底物抑制現(xiàn)象，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定程度或過高時，可能會存在底物抑制和酶活性中心的使用效率受限［14］。本研究分別在上述優(yōu)化反應(yīng)條件下，考察了1-(4-甲基苯基)乙醇的濃度和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的濃度對反應(yīng)的影響，反應(yīng)6 h的結(jié)果見圖4。由圖4可知:當(dāng)1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇處于低濃度時，反應(yīng)速率隨著底物濃度的提高而加快，當(dāng)?shù)孜餄舛确謩e增加到180和150 mmol/L時，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，繼續(xù)提高時，反應(yīng)速率下降。e.e.p值變化不大，說明脂肪酶YCJ01的選擇性并沒有發(fā)生變化。所以1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的濃度分別為180 mmol/L(24.5 g/L)和150 mmol/L(22.8 g/L)時為反應(yīng)的最適底物濃度。

圖4 底物濃度對拆分反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of substrate concentration on chiral resolution

2.5 脂肪酶YCJ01拆分對位取代α-苯乙醇的進(jìn)程曲線

在上述優(yōu)化條件下分別研究了1-(4-甲基苯基)乙醇和1-(4-甲氧基苯基)乙醇的拆分反應(yīng)進(jìn)程曲線，結(jié)果見圖5。由圖5可知:1-(4-甲基苯基)乙醇的拆分體系反應(yīng)21 h后，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.96% ，e.e.s值為 97.1% 、e.e.p值為 97.2% ，對映體的選擇性(E)＞200;1-(4-甲氧基苯基)乙醇的拆分體系反應(yīng)12 h后，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.82%，e.e.s值為 97.7%、e.e.p值為98.4%，對映體的選擇性(E)＞200。Hatzakis等［7］利用脂肪酶拆分 1-(4-甲氧基苯基)乙醇，其轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物e.e.p均較低;王晨等［8］篩選了對1-(4-甲氧苯基)乙醇選擇性較高的脂肪酶，而底物濃度僅為1 mmol/L，脂肪酶用量為50 U/mL，時空產(chǎn)率低;本研究利用自主研發(fā)的脂肪酶粗酶粉手性拆分對位取代α-苯乙醇，底物濃度分別達(dá)到了180和150 mmol/L，表明脂肪酶YCJ01對對位取代α-苯乙醇具有很高的催化效率。

圖5 反應(yīng)時間對拆分反應(yīng)的影響Fig.5 Effects of feaction time on chiral resolution

3 結(jié)論

采用脂肪酶YCJ01在非水相體系中拆分對位取代α-苯乙醇，在異丙醚體系中，1-(4-甲基苯基)乙醇和乙酸乙烯酯的濃度分別為180 mmol/L和1080 mmol/L，反應(yīng)21 h后，產(chǎn)物為S型的乙酰-對甲基苯乙酯和 R型的對甲基苯乙醇，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.96% ，e.e.s為 97.1% 、e.e.p為 97.2% ，對映體的選擇性E＞200;1-(4-甲氧基苯基)乙醇和丁酸乙烯酯的濃度分別為150 mmol/L和750 mmol/L，反應(yīng)12 h后，產(chǎn)物為R型的丁酰-對甲氧基苯乙酯和S型的對甲氧基苯乙醇，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.82%，e.e.s為97.7%，e.e.p為98.4%，對映體的選擇性(E)＞200。本實(shí)驗(yàn)中一直采用游離游離脂肪酶YCJ01做研究，不可重復(fù)利用，在后續(xù)的工作中，將對脂肪酶YCJ01進(jìn)行固定化研究，以期提高其在催化過程中的重復(fù)利用率。

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