趙如奎，吳劍榮，詹曉北，朱 莉

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院糖 化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2.無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫 214125)

熊果苷(arbutin)屬氫醌苷化合物，化學(xué)名為4-羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質(zhì)［1－2］。熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，可減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對皮膚有美白、防色變和祛斑的功效［3］。另外，熊果苷具有兩種同分異構(gòu)體，分別是 α-熊果苷和 β-熊果苷。相關(guān)應(yīng)用研究表明，α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10 倍以上［4－7］。α-熊果苷的美白機制是直接抑制酪氨酸酶活性，從而減少黑色素的生成，而不是通過抑制細(xì)胞生長或酪氨酸酶基因表達(dá)的方式來達(dá)到減少黑色素生成的目的。由于α-熊果苷是一種更高效、更安全的美白活性物質(zhì)，國內(nèi)外許多家化妝品公司已采用α-熊果苷代替β-熊果苷作為美白添加劑［8－9］。

與β-熊果苷可通過植物提取、植物細(xì)胞培養(yǎng)和化學(xué)合成等方法來獲得的方式不同，α-熊果苷一般只能通過微生物細(xì)胞或者酶進(jìn)行催化葡萄糖基糖轉(zhuǎn)移到氫醌上形成單一的α-熊果苷［10-12］。已報道用于合成α-熊果苷的酶包括從釀酒酵母中分離的α-葡萄糖苷酶［13］，從腸膜明串珠菌分離的葡聚糖蔗糖酶［14］以及淀粉蔗糖酶等［15］;葡萄糖基供體包括蔗糖、麥芽糖、濾紙粉、葡萄糖和對硝基葡萄糖苷等，α-熊果苷最高產(chǎn)量僅為 2.3 g/L［16-19］。另外，野油菜黃單胞菌由于含有轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶，其凍干細(xì)胞或者細(xì)胞破碎懸液也可以用于催化α-熊果苷合成，產(chǎn)量分別為0.42 g/L和6.58 g/L，但是細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L，底物糖濃度比較高，糖轉(zhuǎn)化率低，給后續(xù)提取造成困難［4，20］。為了提高轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶作用效率，Wu等［21］將野油菜黃單胞菌的轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶基因表達(dá)并錨定在大腸桿菌表面，全細(xì)胞催化后，α-熊果苷產(chǎn)量可達(dá)21 g/L，氫醌轉(zhuǎn)化率為76%。另外，劉春巧課題組以嗜麥芽黃單胞菌為催化劑，嘗試采用發(fā)酵法和游離細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，α-熊果苷可達(dá)12～16 g/L;進(jìn)一步采用固定氫醌在樹脂方后進(jìn)行全細(xì)胞催化，最終產(chǎn)量可達(dá)到65.9 g/L，氫醌轉(zhuǎn)化率為95.2%［22－25］。雖然發(fā)酵法或全細(xì)胞催化能夠得到較高濃度產(chǎn)物，但是發(fā)酵液復(fù)雜的成分給后續(xù)提取造成困難，且培養(yǎng)細(xì)胞和催化反應(yīng)都需要較長時間。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransfer，CGT酶，EC2.4.1.19)是一種胞外酶，可以分成 α-、β-和 γ-3 種類型，多用于制備α-、β-和 γ-環(huán)糊精［26］。CGT酶是一種多功能型酶，它能催化4種不同的反應(yīng):3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng))和水解反應(yīng)［27］。研究發(fā)現(xiàn)α-CGT酶還可以通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)催化轉(zhuǎn)苷，生成如維生素C葡萄糖苷、α-熊果苷等產(chǎn)物［28－31］。相比其他用于催化合成α-熊果苷的酶，α-CGT酶底物專一性較廣，轉(zhuǎn)葡萄糖基過程不需要耗能。

本文中，筆者嘗試?yán)脟a(chǎn)安琪酵母公司的α-CGT酶為催化劑，以廉價麥芽糊精為葡萄糖基供體進(jìn)行合成，再通過淀粉葡萄糖苷酶水解獲得α-熊果苷，為以商品化α-CGT酶生產(chǎn)制備α-熊果苷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

α-CGT酶，安琪酵母公司;淀粉葡萄糖苷酶，無錫杰能科生物工程公司;對苯二酚(HQ)、麥芽糖、CaCl2、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;麥芽糊精為市售產(chǎn)品(dextrose equivalent值(DE)分別4% ～6%、8% ～10%、10% ～15%);α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司。

1.2 α-熊果苷的合成

轉(zhuǎn)葡萄糖糖基反應(yīng):在20 mmol/L pH 6.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液體系中加入CaCl2(5 mmol/L)，對苯二酚(150 mmol/L)，麥芽糊精60 g/L和0.025 mg/mL α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，于40℃、100 r/min水浴搖床中反應(yīng)24 h，樣品沸水浴5 min滅活。

水解反應(yīng):高溫滅活后的樣品中加入淀粉葡萄糖苷酶，于40℃、100 r/min水浴搖床中反應(yīng)4 h后，再次沸水浴5 min滅活，離心后經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析。

1.3 α-熊果苷的分析

取0.8 mL樣品，加入0.2 mL甲醇，在8000 r/min條件下離心10 min，上清液用LC-2010A型高效液相色譜檢測(日本島津)。色譜條件:色譜柱為島津 C18柱(4.6 mm ×25 cm，5 μm);柱溫為 30 ℃;流動相為H2O-CH3OH溶液，其體積比為80∶20;流速為0.6 mL/min;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為 280 nm;進(jìn)樣量為 10 μL。

1.4 對苯二酚轉(zhuǎn)化率計算

對苯二酚的轉(zhuǎn)化率計算見式(1)。

式中:n1為加入到發(fā)酵液中對苯二酚物質(zhì)的量，n2為反應(yīng)后發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的對苯二酚物質(zhì)的量。

1.5 α-熊果苷的純化

樣品經(jīng)8000 r/min離心10 min，取上清液加入2倍體積乙酸乙酯，收集水相，再加入2倍體積正丁醇，收集水相，分別萃取3次，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后收集樣品，即得初步純化的α-熊果苷。

1.6 α-熊果苷的結(jié)構(gòu)測定

通過高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LCESI-MS/MS，TSQ Quantum Ultra EMR，Thermo Fisher Scientific)對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

色譜條件:色譜柱為Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱溫為 30 ℃;流動相為水(A)-甲醇(B)溶液。梯度洗脫(0～2 min 10%B、2～10 min 20%B、10 ～13 min 80%B、13 ～15 min 10%B);流速為 0.2 mL/min，進(jìn)樣量為 1 μL。質(zhì)譜條件:ESI離子源，正離子監(jiān)測模式檢測;噴霧電壓為3.2 kV;霧化器壓力為0.208 MPa;輔助氣壓力為0.208 MPa;離子傳輸毛細(xì)管溫度為350℃;數(shù)據(jù)采集掃描時間為0.50 s;分辨率Q1和Q3均為0.7 amu(FWHM);碰撞能量為15 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 對苯二酚的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)

考察安琪酵母的α-CGT酶催化對苯二酚與麥芽糊精的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:α-CGT酶能夠使對苯二酚糖基化，形成具有不同葡萄糖基的糖苷混合物(HQGn)，其葡萄糖基的數(shù)量不等，保留時間均小于對苯二酚。首先，麥芽糊精作為供體與α-CGT酶的活性位點結(jié)合形成中間酶，通過水解不同的糖苷鍵，釋放出單糖、雙糖或低聚糖。然后，中間酶又與對苯二酚結(jié)合，對苯二酚的羥基與單糖、雙糖或低聚糖結(jié)合生成HQGn。同樣，HQGn也可以作為供體底物。當(dāng)HQGn作為供體底物，對苯二酚(HQ)作為受體底物時，α-CGT酶切斷不同的糖苷鍵，從而也可生成HQG1～HQG4［31］。

圖1 α-CGT酶催化對苯二酚轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的產(chǎn)物液相色譜Fig.1 Transglycosylation of hydroquinone with α-CGT by HPLC

2.2 糖苷的水解反應(yīng)

淀粉葡萄糖苷酶(糖化酶)可以切斷α-糖苷鍵，將該酶加入上述轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)混合液中，可以將長鏈的葡萄糖切除，使得HQGn生成HQG1(α-熊果苷)。液相色譜分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，圖中的峰分別為HQG1和未反應(yīng)的對苯二酚HQ。因此，通過α-CGT酶和淀粉葡萄糖苷酶的兩步酶法反應(yīng)體系，可以用于合成α-熊果苷。

圖2 糖化酶催化糖苷水解反應(yīng)的產(chǎn)物液相色譜Fig.2 Hydrolysis of glycoside with glucoamylase by HPLC

2.3 催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 不同供體底物對反應(yīng)的影響

分別考察葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精(DE值4% ～6%、8% ～10%、10% ～15%)作為 α-熊果苷的供體底物對反應(yīng)的影響，結(jié)果見表1。由表1可知:所選底物中除葡萄糖外，麥芽糖、麥芽糊精均可作為供體底物生成α-熊果苷，其中采用DE值8% ～10%麥芽糊精的α-熊果苷產(chǎn)量最高，達(dá)到2.61 g/L。DE值4% ～6%麥芽糊精水溶性較差，水溶液黏度高，溶于水易形成凝膠。采用DE值10% ～15%麥芽糊精時，低分子葡萄糖較多，高分子葡萄糖較少，α-熊果苷產(chǎn)量要低于DE值8% ～10%麥芽糊精;麥芽糖僅由2個葡萄糖基組成，α-CGT也能催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成少量α-熊果苷，表明該α-CGT的底物專一性不強，底物選擇范圍較大。作為參照，葡萄糖做為單糖無法被α-CGT識別［4］，未能檢測到α-熊果苷。相比多數(shù)研究以蔗糖、麥芽糖為葡萄糖基供體的酶催化反應(yīng)［16-19］，本研究使用的麥芽糊精價格更低廉，并且α-熊果苷產(chǎn)量較高，但對苯二酚的轉(zhuǎn)化率要低很多。

2.3.2 麥芽糊精濃度對反應(yīng)的影響

考察不同質(zhì)量濃度的DE值為8%～10%麥芽糊精為底物對催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:在一定麥芽糊精濃度范圍內(nèi)，α-熊果苷的產(chǎn)量隨著麥芽糊精濃度的升高而增加，當(dāng)麥芽糊精達(dá)到60 g/L時，α-熊果苷的產(chǎn)量達(dá)到最大值2.58 g/L，對苯二酚轉(zhuǎn)化率為6.34%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)，繼續(xù)增加麥芽糊精用量，由于底物抑制作用，α-熊果苷產(chǎn)量基本不變，所以較適的麥芽糊精為60 g/L。該底物濃度與Shimoda等［30］所用的5%的濾紙粉用量相差不大。

表1 不同供體底物對α-CGT酶催化反應(yīng)的影響Table 1 Effects of different substrates on the reaction catalyzed by α-CGT

圖3 麥芽糊精濃度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.3 Effect of maltodextrin concentration on the synthesis of α-arbutin

2.3.3 對苯二酚濃度對反應(yīng)的影響

圖4 對苯二酚濃度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.4 Effect of hydroquinone concentration on the synthesis of α-arbutin

由于對苯二酚對酶具有抑制作用，當(dāng)緩沖液中對苯二酚濃度超過一定量時，酶活性會下降。圖4為對苯二酚濃度對催化合成α-熊果苷的影響結(jié)果。由圖4可知:在一定對苯二酚濃度范圍內(nèi)，α-熊果苷的產(chǎn)量隨著對苯二酚濃度的增加而增加，最高產(chǎn)量為2.67 g/L，此時對苯二酚轉(zhuǎn)化率為6.54%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。但當(dāng)對苯二酚濃度超過150 mmol/L時，α-熊果苷的產(chǎn)量開始下降。這可能是由于對苯二酚的羥基比較活潑，對酶的活性中心和結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生影響，濃度過高會導(dǎo)致部分α-CGT酶活性下降甚至失活，最終導(dǎo)致α-熊果苷產(chǎn)量下降。與全細(xì)胞催化、細(xì)胞破碎懸液和發(fā)酵法制備α-熊果苷相比而言，商品化的α-CGT酶對對苯二酚的耐受性大大提高［19－20，22－23］。

2.3.4 溫度對反應(yīng)的影響

考察反應(yīng)溫度對催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:α-熊果苷的最適反應(yīng)溫度為40℃，此時產(chǎn)量達(dá) 2.59 g/L，對苯二酚轉(zhuǎn)化率為6.35%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度有利于提高酶的活性，當(dāng)反應(yīng)溫度過高時，會導(dǎo)致酶的催化能力下降。同時，隨著溫度的升高，對苯二酚氧化速度加快，反應(yīng)體系中對苯二酚濃度下降，最終導(dǎo)致α-熊果苷產(chǎn)量下降。

圖5 溫度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.5 Effect of temperature on the synthesis of α-arbutin

2.3.5 緩沖溶液pH對反應(yīng)的影響

其他條件不變，考察不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液反應(yīng)體系對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:當(dāng)檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液的pH在6.0時，α-熊果苷的產(chǎn)量最高為2.62 g/L，對苯二酚轉(zhuǎn)化率為6.42%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)，這說明α-CGT酶在pH為6.0的緩沖溶液體系中活性達(dá)到最大。

圖6 緩沖液pH對催化合成α-熊果苷的影響Fig.6 Effect of buffer solution pH value on the synthesis of α-arbutin

2.3.6 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

圖7為反應(yīng)時間對催化反應(yīng)的影響結(jié)果。由圖7可知:α-熊果苷產(chǎn)量隨著反應(yīng)時間的延長先升高后降低，當(dāng)反應(yīng)時間為24 h時，α-熊果苷產(chǎn)量達(dá)到最高2.65 g/L，對苯二酚轉(zhuǎn)化率6.50%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。隨著反應(yīng)時間的延長，α-熊果苷產(chǎn)量有所下降，這是因為α-熊果苷存在一個緩慢的水解過程。所以最佳反應(yīng)時間為24 h。相比以往酶催化反應(yīng)所需時間(48～96 h)和生產(chǎn)速率(8.33×10－4～1.53 ×10－2g/(L·h))，本研究的反應(yīng)時間大大縮短，而生產(chǎn)速率提高一個數(shù)量級［22－25］。

圖7 反應(yīng)時間對催化合成α-熊果苷的影響Fig.7 Effect of reaction time on the synthesis of α-arbutin

2.4 α-熊果苷的純化與鑒定

把反應(yīng)所得到的樣品首先經(jīng)乙酸乙酯萃取，再經(jīng)正丁醇萃取，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干收集，得到的樣品再經(jīng)過離心，上清液用HPLC進(jìn)行分析，并與α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)樣品與α-熊果苷有相同的保留時間，所以初步推斷樣品中含有α-熊果苷。再把萃取純化后的產(chǎn)物通過LC-ESI-MS/MS的正離子模式進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知:α-熊果苷實際相對分子質(zhì)量為272，產(chǎn)物相對分子質(zhì)量與α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量均為295，這是由于形成陽離子加合物［M+Na］+的結(jié)果。所以，可以確定產(chǎn)物為 α-熊果苷。

圖8 α-熊果苷的LC-ESI-MS譜圖Fig.8 Spectra of α-arbutin by LC-ESI-MS

3 結(jié)論

1)通過實驗證明了α-CGT酶能催化將麥芽糊精上葡萄糖轉(zhuǎn)糖基到對苯二酚上，合成α-熊果苷。較優(yōu)反應(yīng)條件:DE 8%～10%的麥芽糊精作為供體底物，對苯二酚150 mmol/L，麥芽糊精60 g/L，pH 6.0，在40℃下反應(yīng)24 h。通過對產(chǎn)物的分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定，確定該產(chǎn)物為α-熊果苷。

2)單純利用α-CGT酶也可催化合成α-熊果苷，但產(chǎn)量相對較低，并且副產(chǎn)物較多，給分離純化帶來困難。α-CGT酶和淀粉葡萄糖苷酶的雙酶催化法，不僅提高了α-熊果苷的產(chǎn)量，減少了副產(chǎn)物的生成，并且降低了分離純化難度，獨具優(yōu)勢。

3)酶法催化原料簡單，生產(chǎn)周期短，提取純化方便，但酶無法重復(fù)利用。下一步可考慮采用固定化酶催化合成α-熊果苷，固定化酶可重復(fù)利用，節(jié)約生產(chǎn)成本。

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