鄧斌格　成佳威

（湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425199）

黃杯杜鵑總黃酮提取工藝研究

鄧斌格成佳威

（湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425199）

研究黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝。采用回流提取黃杯杜鵑總黃酮，紫外分光光度計測定總黃酮提取率。通過單因素試驗研究乙醇體積分數(shù)、液料比、提取次數(shù)、提取時間對總黃酮提取含量的影響，通過正交試驗進一步優(yōu)選最佳提取工藝。單因素試驗結果顯示，乙醇體積分數(shù)50%、提取次數(shù)3次、提取時間3h、液料比1:20(g/ml)條件下黃杯杜鵑總黃酮提取率高；正交試驗結果表明：黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝為提取時間2 h、乙醇體積分數(shù)60%、提取1次、料液比1 :25的條件下黃杯杜鵑總黃酮提取率較高；本工藝簡單可行，有較好的參考價值。

黃杯杜鵑；總黃酮；提取工藝；正交試驗

杜鵑花屬(Rhododendron Linn.)是杜鵑花科(Ericaceae) 中最大的一個屬，全世界約有960種，廣布于歐、亞、北美的溫帶地區(qū)[1]。我國是杜鵑花屬植物種類最豐富的國家，是世界杜鵑花屬植物的主要分布中心[2]。該屬植物具有較高的藥用價值，如祛痰止咳[3-7]、抗菌消炎[8]、鎮(zhèn)痛[9-10]、對心血管系統(tǒng)的保護[11-13]等具有顯著作用，因此有廣闊的開發(fā)應用前景。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，黃杯杜鵑富含黃酮類成分，其枝葉粗提物中總黃酮含量高達4.9%。本研究和實驗的目的是通過對黃杯杜鵑總黃酮提取，優(yōu)化其最優(yōu)提取工藝，得到黃酮純度高的粗提物，為合理開發(fā)利用黃杯杜鵑植物資源提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

黃杯杜鵑葉（R.wardii）: 采自四川雅安，經(jīng)湖南科技學院姜紅宇博士鑒定。

蘆丁標準品（上海生化試劑公司）、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、二氯甲烷、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁，以上試劑均為分析純，全部購于天津市福晨化學試劑廠。

UV 2800紫外可見光分光光度計舜宇恒平有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III循環(huán)水多用真空泵鄭州市長盛實驗儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備

稱取蘆丁對照品10.0 mg，用80 %的甲醇定容至50 ml量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.2mg?ml-1的對照品溶液。

1.2.2總黃酮定量測定 參考文獻[14]分光光度計法

1.2.3標準曲線的繪制

吸取上述蘆丁標準液0.0、4. 0、5. 0、6. 0、8. 0、10. 0和12. 0 ml于25ml容量瓶中，各加入1. 25ml 5%亞硝酸鈉，搖勻。放置5min后再各加入10%硝酸鋁1. 25ml，搖勻。5min后再加入4%的氫氧化鈉溶液10ml，混勻并用80%甲醇稀釋至刻度。15min后于510nm處測吸光度（A），試劑為空白參比，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=10.274x+0.0461（R2=0.9939）。

圖1　蘆丁對照品標準曲線

1.2.4總黃酮提取的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定以乙醇體積分數(shù)(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)、液料比(D)為試驗因素進行正交設計，每因素3 個水平(表1)，按照L9(34)正交表進行試驗(表2) ，優(yōu)化黃杯杜鵑總黃酮的提取工藝。

表1　黃杯杜鵑總黃酮提取工藝正交試驗因素水平

1.2.5最佳提取工藝驗證實驗

為進一步驗證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，精密稱取黃杯杜鵑粉末1.00g（平行3份），在1.2.4節(jié)所得最佳提取工藝條件下提取黃杯杜鵑總黃酮，計算總黃酮提取率。

2　結果與分析

2.1影響總黃酮提取含量的單因素試驗

2.1.1料液比對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)70%、提取時間2h、提取2次的條件下，研究料液比對黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結果表明：隨溶劑量的增加，總黃酮提取含量明顯升高，當料液比大于1:20(g/ml)時，提取含量升高速度減慢；小于1:20(g/ml)時，提取含量隨液料比的增加而增加。隨著溶劑量增加，質(zhì)量濃度梯度增大，總黃酮溶出速率和含量變大。當總黃酮充分溶出后，即使繼續(xù)加大溶劑量，總黃酮的提取率基本趨于穩(wěn)定，甚至下降。在實際操作中考慮總黃酮的充分溶出同時也避免溶劑的浪費，故正交試驗設計中料液比設置為1:10～1:30(g/ml)。

圖2　液料比對總黃酮提取含量的影響

2.1.2乙醇體積分數(shù)對黃杯杜鵑總黃酮提取率的影響

在料液比1:20、提取時間2h、提取2次的條件下，研究乙醇體積分數(shù)對黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結果表明：當乙醇體積分數(shù)較小時，總黃酮提取含量隨著乙醇體積分數(shù)的增大而升高，當乙醇體積分數(shù)50% 時達到最高值；當乙醇體積分數(shù)大于50% 時，總黃酮提取含量反而有所降低。造成這種現(xiàn)象可能是由于乙醇體積分數(shù)過大時，水溶性黃酮的溶出減少而脂溶性雜質(zhì)如色素、鞣質(zhì)等溶出增多，由于雜質(zhì)與脂溶性黃酮競爭溶劑，從而使黃酮提取量下降。故在正交試驗設計中

乙醇體積分數(shù)設置為30%～70%。

圖3　乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取含量的影響

2.1.3提取時間對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)70%、料液比1:20、提取2次的條件下，研究提取時間對黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結果表明：黃杯杜鵑總黃酮提取含量隨提取時間的延長而升高，當提取時間大于2h 后總黃酮提取含量趨于穩(wěn)定。在選擇提取時間時既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意過長時間的高溫提取對化合物結構的影響，故正交試驗設計中設置提取時間為1.0～3.0h。

圖4　提取時間對總黃酮提取含量的影響

2.1.4提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)70%、料液比1:20、提取2h的條件下，研究提取次數(shù)對黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結果表明：黃杯杜鵑總黃酮提取含量隨提取次數(shù)的加大而升高，當提取次數(shù)大于3次后總黃酮提取含量趨于穩(wěn)定。在選擇提取次數(shù)時既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意多次的高溫提取對化合物結構的影響，故正交試驗設計中設置提取時間為1～4次。

圖5　提取次數(shù)對總黃酮提取含量的影響

2.2正交試驗優(yōu)選黃杯杜鵑總黃酮提取工藝

表2　總黃酮提取工藝正交試驗設計及結果

根據(jù)單因素試驗結果，選擇溫度、乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)、液料比等較優(yōu)水平，按L9( 34) 設計正交試驗。結果表明：乙醇體積分數(shù)對黃杯杜鵑總黃酮提取率影響最大，提取次數(shù)對黃杯杜鵑總黃酮提取率影響較大，其次，液料比對總黃酮的提取有一定影響，4個因素中，以提取時間影響最??；由正交試驗結果得出最優(yōu)因素水平組合為A3B3C1D3，即乙醇體積分數(shù)60%、提取時間2 h、提取次數(shù)1次、料液比1 :25。

2.3驗證試驗

為進一步驗證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取5份黃杯杜鵑粗粉，沒份1.00g，按上述最優(yōu)工藝條件進行驗證實驗，測得平均總黃酮提取率為9.18%，相對標準偏差（RSD）為0.75%。所得總黃酮回收率高，適宜于生產(chǎn)應用。

3　結　論

本實驗以乙醇為溶劑，以黃杯杜鵑總黃酮提取率為考察指標，通過對提取次數(shù)、乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比進行單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選出黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝為A3B3C1D3，即乙醇體積分數(shù)60%、提取時間2 h、提取次數(shù)1次、料液比1 :25。該工藝操作簡便、成本低、收率高，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，可為黃杯杜鵑總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

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(責任編校：何俊華)

R284.2

A

1673-2219（2015）05-0069-04

2015－01－11

鄧斌格（1994－），男，成佳威，湖南科技學院學生。