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        細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其在藥品檢驗中的應(yīng)用

        2015-10-25 10:29:49田祥學(xué)
        中國醫(yī)藥指南 2015年23期
        關(guān)鍵詞:檢查法內(nèi)毒素藥典

        田祥學(xué)

        (黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗中心,湖北 黃岡 438000)

        細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其在藥品檢驗中的應(yīng)用

        田祥學(xué)

        (黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗中心,湖北 黃岡 438000)

        注射用藥品對于熱原質(zhì)的檢查傳統(tǒng)方法是家兔法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相對于傳統(tǒng)方法有靈敏度高、操作簡便等諸多優(yōu)點。鱟試驗法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的技術(shù),由于其快捷、靈敏、經(jīng)濟、可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點可帶來良好的經(jīng)濟及社會效益,中、美、英、日等國的藥典均有收載,是現(xiàn)行常用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之一。

        細(xì)菌內(nèi)毒素;藥品檢驗;鱟試驗法

        1 基本原理

        細(xì)菌內(nèi)毒素,英文稱作Endotoxin,是革蘭陰性菌細(xì)胞壁個層上的特有結(jié)構(gòu),內(nèi)毒素為外源性致熱原,它可激活中性粒細(xì)胞等,使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì),作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。靜脈注射用藥品所含細(xì)菌內(nèi)毒素超過一定的濃度會使人體體溫升高發(fā)生熱原反應(yīng),對用藥安全產(chǎn)生影響。鱟試驗法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素是美國科學(xué)家Levin和Bang1968年所建立的[1]。研究表明,細(xì)菌內(nèi)毒素可以激活鱟試劑中鱟血細(xì)胞溶解物一系列凝集酶的反應(yīng),形成肉眼可見的凝固蛋白凝膠。利用這一原理用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素,以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。

        2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

        2.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品:細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成,用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示,1EU與1個內(nèi)毒素國際單位(IU)相當(dāng)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價,用于試驗中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。每1ng工作標(biāo)準(zhǔn)品效價應(yīng)不小于2EU,不大于50EU,并具備均一性和穩(wěn)定性的實驗數(shù)據(jù)。

        2.2實驗準(zhǔn)備:將玻璃器皿放入酪酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗劑中充分浸泡[2],然后控干洗液,用蒸餾水沖洗3遍以上;置入干燥箱,在250 ℃干烤30 min以上,以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素的干擾。

        2.3鱟試劑靈敏度復(fù)核:根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ),利用漩渦混合器將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品與專門的檢查水混合溶解15 min,逐級2倍稀釋,并計算鱟試劑靈敏度測定值(λC)。靈敏度檢驗復(fù)核嚴(yán)格執(zhí)行于每批新的鱟試劑。此外稀釋倍數(shù)加大的試劑可進行不干擾試驗可以排除干擾因素的影響。

        2.4實驗方法:取4支試管,分別加入鱟試劑0.1 mL,再分別加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 mL溶解。其中2支加入按最大稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液0.1 mL作為供試品管,1支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL作為陽性對照管,1支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 mL作為陰性對照管。將試管混勻封口后置于(37±1) ℃水浴保溫1 h[2]。取出慢慢倒轉(zhuǎn)180°觀察,若管內(nèi)凝膠附著管壁無明顯改變記為陽性(+),否則記為陰性(-)。供試品兩管均為(-),應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定。

        2.5實驗中的注意事項:實驗前需用肥皂洗手,用75%乙醇棉球消毒[2];移液管取樣時要注意防止氣體混入;反應(yīng)過程中避免試管震動,以免凝膠破碎造成假陰性結(jié)果;靈敏度復(fù)核及干擾試驗時兩組應(yīng)同時進行;實驗操作應(yīng)該在清潔環(huán)境中進行,防止微生物污染。

        3 與傳統(tǒng)方法對比

        我們從方法的用時,操作難度、成本、靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)化難度幾個方面與傳統(tǒng)家兔法進行對比,不難看出它的優(yōu)點。見表1。

        表1 鱟試劑法與家兔法對比

        4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用

        1980年美國藥典最先收載了凝膠法,并作為仲裁法分別應(yīng)用美歐日等多國的藥品檢驗。隨后動態(tài)濁度法、顯色基質(zhì)法、電泳法、酶聯(lián)免疫等應(yīng)用有了較快的發(fā)展,其優(yōu)點在于降低了無關(guān)干擾且檢查速度較快。方法的自動化在不斷發(fā)展,動態(tài)顯色基質(zhì)法和動態(tài)濁度法已實現(xiàn)儀器自動化檢測并進行數(shù)據(jù)處理,美國LAL4000、日本的Toxinometer201以及我國的BET-32型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀[3]相繼出臺。另外,細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗梭魚的試劑量及樣品量要求在不斷降低,如酶聯(lián)免疫吸附法,所需的鱟試劑只需要凝膠法的百分之一,且具有更好的靈敏度和抗干擾能力[4]。

        我國1991年首次收入部頒標(biāo)準(zhǔn),1995年正式收載于中國藥典二部附錄,近20年來每版藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的藥品都在成倍增長,中、美藥典收載品種情況見表2。

        表2 中、美藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查數(shù)量情況對比

        從對比情況來看,我國現(xiàn)行藥典收載品種數(shù)已經(jīng)接近美國藥典25版水平。同時在藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制和藥品檢驗中已廣泛應(yīng)用于化學(xué)制劑、抗生素、原料藥及生物制劑,對中藥注射用的應(yīng)用研究也在進行之中。

        5 影響發(fā)展的因素與對策

        不同藥物具有不同的特性,細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗法在藥品檢驗中有明顯局限性。在藥品檢驗過程中不僅要對每類藥品的各自特性進行全面分析,還要對藥品的每種成分進行毒性試驗,對于不同藥品的相互作用進行檢驗;隨著藥品種類的不斷增多以及藥品藥效的差異性增大,對于藥品檢驗技術(shù)的要求也日益增高。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在實驗的具體操作中必須盡量避免雜菌的干擾,然而實際操作中很難做到。因此需要對檢驗技術(shù)進行不斷改進。要加強培養(yǎng)優(yōu)秀的檢驗技術(shù)人,要探索比凝膠法更全面的檢驗方法,加強相關(guān)研究,并及時更新檢驗設(shè)備,提高方法的應(yīng)用價值。

        6 總 結(jié)

        細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法已被多國藥典收載,通過方法學(xué)驗證,越來越多的藥品采用這種方法取代傳統(tǒng)的家兔法,我國藥典自2000年版以來不斷增加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的品種,2010年版藥典還對用于無菌分裝靜脈用注射劑的原料藥增加了細(xì)菌內(nèi)毒素的控制,同時還擴展到了生物制劑的應(yīng)用。目前國外細(xì)菌內(nèi)毒素定量法的使用率達到65%以上,超過了凝膠法,與國外相比還存在一定的差距。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展,技術(shù)研究的不斷深入,檢驗檢測儀器設(shè)備的更新?lián)Q代,以及廣大醫(yī)藥工作不懈努力,相信細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的在藥品檢驗中的應(yīng)用領(lǐng)域與檢驗技術(shù)將得到更加廣泛的發(fā)展,不久將趕超世界先進水平。

        [1]肖貴南,孫清萍,盛英美,等.如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(32):159-160.

        [2]中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[S].2010.

        [3]唐先明,何志一,劉建輝,等.熱原檢查用兔細(xì)菌內(nèi)毒素敏感性研究[J].黑龍江醫(yī)藥,2014,27(1):1052-1055.

        [4]孫哲.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘(電子版),2012,(9):128.

        R927

        A

        1671-8194(2015)23-0278-02

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