田祥學(xué)

（黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖北 黃岡 438000）

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

田祥學(xué)

（黃岡市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖北 黃岡 438000）

注射用藥品對(duì)于熱原質(zhì)的檢查傳統(tǒng)方法是家兔法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相對(duì)于傳統(tǒng)方法有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。鱟試驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的技術(shù)，由于其快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)、可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益，中、美、英、日等國(guó)的藥典均有收載，是現(xiàn)行常用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之一。

細(xì)菌內(nèi)毒素；藥品檢驗(yàn)；鱟試驗(yàn)法

1　基本原理

細(xì)菌內(nèi)毒素，英文稱(chēng)作Endotoxin，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁個(gè)層上的特有結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細(xì)胞等，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。靜脈注射用藥品所含細(xì)菌內(nèi)毒素超過(guò)一定的濃度會(huì)使人體體溫升高發(fā)生熱原反應(yīng)，對(duì)用藥安全產(chǎn)生影響。鱟試驗(yàn)法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素是美國(guó)科學(xué)家Levin和Bang1968年所建立的［1］。研究表明，細(xì)菌內(nèi)毒素可以激活鱟試劑中鱟血細(xì)胞溶解物一系列凝集酶的反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的凝固蛋白凝膠。利用這一原理用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。

2　細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

2.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位（IU）相當(dāng)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。每1ng工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)應(yīng)不小于2EU，不大于50EU，并具備均一性和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：將玻璃器皿放入酪酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗劑中充分浸泡［2］，然后控干洗液，用蒸餾水沖洗3遍以上；置入干燥箱，在250 ℃干烤30 min以上，以除去可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素的干擾。

2.3鱟試劑靈敏度復(fù)核：根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），利用漩渦混合器將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品與專(zhuān)門(mén)的檢查水混合溶解15 min，逐級(jí)2倍稀釋?zhuān)⒂?jì)算鱟試劑靈敏度測(cè)定值（λC）。靈敏度檢驗(yàn)復(fù)核嚴(yán)格執(zhí)行于每批新的鱟試劑。此外稀釋倍數(shù)加大的試劑可進(jìn)行不干擾試驗(yàn)可以排除干擾因素的影響。

2.4實(shí)驗(yàn)方法：取4支試管，分別加入鱟試劑0.1 mL，再分別加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 mL溶解。其中2支加入按最大稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液0.1 mL作為供試品管，1支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL作為陽(yáng)性對(duì)照管，1支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 mL作為陰性對(duì)照管。將試管混勻封口后置于（37±1） ℃水浴保溫1 h［2］。取出慢慢倒轉(zhuǎn)180°觀(guān)察，若管內(nèi)凝膠附著管壁無(wú)明顯改變記為陽(yáng)性（+），否則記為陰性（-）。供試品兩管均為（-），應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定。

2.5實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)前需用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒［2］；移液管取樣時(shí)要注意防止氣體混入；反應(yīng)過(guò)程中避免試管震動(dòng)，以免凝膠破碎造成假陰性結(jié)果；靈敏度復(fù)核及干擾試驗(yàn)時(shí)兩組應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該在清潔環(huán)境中進(jìn)行，防止微生物污染。

3　與傳統(tǒng)方法對(duì)比

我們從方法的用時(shí)，操作難度、成本、靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)化難度幾個(gè)方面與傳統(tǒng)家兔法進(jìn)行對(duì)比，不難看出它的優(yōu)點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1　鱟試劑法與家兔法對(duì)比

4　細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用

1980年美國(guó)藥典最先收載了凝膠法，并作為仲裁法分別應(yīng)用美歐日等多國(guó)的藥品檢驗(yàn)。隨后動(dòng)態(tài)濁度法、顯色基質(zhì)法、電泳法、酶聯(lián)免疫等應(yīng)用有了較快的發(fā)展，其優(yōu)點(diǎn)在于降低了無(wú)關(guān)干擾且檢查速度較快。方法的自動(dòng)化在不斷發(fā)展，動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法和動(dòng)態(tài)濁度法已實(shí)現(xiàn)儀器自動(dòng)化檢測(cè)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，美國(guó)LAL4000、日本的Toxinometer201以及我國(guó)的BET-32型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀［3］相繼出臺(tái)。另外，細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)梭魚(yú)的試劑量及樣品量要求在不斷降低，如酶聯(lián)免疫吸附法，所需的鱟試劑只需要凝膠法的百分之一，且具有更好的靈敏度和抗干擾能力［4］。

我國(guó)1991年首次收入部頒標(biāo)準(zhǔn)，1995年正式收載于中國(guó)藥典二部附錄，近20年來(lái)每版藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的藥品都在成倍增長(zhǎng)，中、美藥典收載品種情況見(jiàn)表2。

表2　中、美藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查數(shù)量情況對(duì)比

從對(duì)比情況來(lái)看，我國(guó)現(xiàn)行藥典收載品種數(shù)已經(jīng)接近美國(guó)藥典25版水平。同時(shí)在藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制和藥品檢驗(yàn)中已廣泛應(yīng)用于化學(xué)制劑、抗生素、原料藥及生物制劑，對(duì)中藥注射用的應(yīng)用研究也在進(jìn)行之中。

5　影響發(fā)展的因素與對(duì)策

不同藥物具有不同的特性，細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法在藥品檢驗(yàn)中有明顯局限性。在藥品檢驗(yàn)過(guò)程中不僅要對(duì)每類(lèi)藥品的各自特性進(jìn)行全面分析，還要對(duì)藥品的每種成分進(jìn)行毒性試驗(yàn)，對(duì)于不同藥品的相互作用進(jìn)行檢驗(yàn)；隨著藥品種類(lèi)的不斷增多以及藥品藥效的差異性增大，對(duì)于藥品檢驗(yàn)技術(shù)的要求也日益增高。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在實(shí)驗(yàn)的具體操作中必須盡量避免雜菌的干擾，然而實(shí)際操作中很難做到。因此需要對(duì)檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行不斷改進(jìn)。要加強(qiáng)培養(yǎng)優(yōu)秀的檢驗(yàn)技術(shù)人，要探索比凝膠法更全面的檢驗(yàn)方法，加強(qiáng)相關(guān)研究，并及時(shí)更新檢驗(yàn)設(shè)備，提高方法的應(yīng)用價(jià)值。

6　總 結(jié)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法已被多國(guó)藥典收載，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，越來(lái)越多的藥品采用這種方法取代傳統(tǒng)的家兔法，我國(guó)藥典自2000年版以來(lái)不斷增加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的品種，2010年版藥典還對(duì)用于無(wú)菌分裝靜脈用注射劑的原料藥增加了細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，同時(shí)還擴(kuò)展到了生物制劑的應(yīng)用。目前國(guó)外細(xì)菌內(nèi)毒素定量法的使用率達(dá)到65%以上，超過(guò)了凝膠法，與國(guó)外相比還存在一定的差距。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，技術(shù)研究的不斷深入，檢驗(yàn)檢測(cè)儀器設(shè)備的更新?lián)Q代，以及廣大醫(yī)藥工作不懈努力，相信細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用領(lǐng)域與檢驗(yàn)技術(shù)將得到更加廣泛的發(fā)展，不久將趕超世界先進(jìn)水平。

［1］肖貴南，孫清萍，盛英美，等.如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（32）:159-160.

［2］中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［S］.2010.

［3］唐先明，何志一，劉建輝，等.熱原檢查用兔細(xì)菌內(nèi)毒素敏感性研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）:1052-1055.

［4］孫哲.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)［J］.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘（電子版），2012，（9）:128.

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1671-8194（2015）23-0278-02