陳 君

（襄陽(yáng)市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 襄陽(yáng) 441100）

骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗(yàn)法驗(yàn)證

陳 君

（襄陽(yáng)市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 襄陽(yáng) 441100）

目的 建立骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗(yàn)法。方法 按中國(guó)藥典2010年微生物限度檢查驗(yàn)證方法的驗(yàn)證，以回收率對(duì)方法有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 采用常規(guī)法，5種陽(yáng)性菌的回收率均＞70%，控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)均為陽(yáng)性。結(jié)論 骨炎敗毒丸其中藥成分在微生物限度檢查時(shí)不會(huì)干擾檢查結(jié)果，不具有抑菌活性，常規(guī)法用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢查可行性強(qiáng)，垂直操作簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗(yàn)。

骨炎敗毒丸；微生物限度檢查；驗(yàn)證；培養(yǎng)基稀釋法；回收率

本品為襄陽(yáng)市夏綠二骨炎風(fēng)濕病?？崎T診部自制制劑，有金銀花、蒲公英、苦地丁、連翹、黃柏等一共15味中藥制成，具行氣活血，化瘀通滯，清熱解毒的功效，用于急慢性骨髓炎，慢性化膿性骨髓炎，慢性硬化性骨髓炎，化膿性關(guān)節(jié)炎，一切化膿性炎癥［1］。其方中金銀花具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱［2］。其質(zhì)量控制一直使用其門診部自制標(biāo)準(zhǔn)，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)微生物限度檢查法的具體檢驗(yàn)方法，產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量得不到保證，本研究擬對(duì)骨炎敗毒丸的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終確認(rèn)對(duì)本品最科學(xué)的方法，為保證本品的質(zhì)量提供定量方法學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)［3］。

1　儀器與試藥

骨炎敗毒丸（襄陽(yáng)市夏綠二骨炎風(fēng)濕病?？崎T診部，20131002，60克/瓶），菌種包括大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；黑曲霉［CMCC（F）98003］均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯（130522）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（130521）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（130627）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（130421）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（130607）、改良馬丁液培養(yǎng)基（130522）。儀器：電熱恒溫干燥箱（202-2），立式滅菌器（LMQ.C）。

2　方法與結(jié)果

2.1菌液的制備

2.1.1分別將5種菌種接種至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2.1.2分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至50 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中；白色念珠菌至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，以上4種菌均培養(yǎng)24 h。

2.1.3黑曲霉至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d，加入3 mL含0.05%聚山梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)。

2.1.4以上5種培養(yǎng)好的菌，分別用相應(yīng)的稀釋溶液按10倍遞增稀釋法稀釋，制成含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液。

2.1.5所有菌液臨用現(xiàn)制并均放置于冰箱冷藏。24 h內(nèi)使用。

2.2適用性檢查：按中國(guó)藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項(xiàng)下計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查法操作，每個(gè)菌種在其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平行做2個(gè)平皿，培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間后計(jì)數(shù)，本次試驗(yàn)所用養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)均大于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，菌落形態(tài)大小均與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。培養(yǎng)基的適用性檢查通過(guò)。

2.3供試液的制備：取本品10 g，加稀釋液至100 mL，用勻漿儀2擋 1 min打碎混勻，做為1∶10的供試液，按遞增稀釋法制成1∶10、1∶102、1∶103共3個(gè)稀釋級(jí)的供試液。

2.4計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.4.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌驗(yàn)證試驗(yàn)［4］。①實(shí)驗(yàn)組：取1∶103供試液1 mL和制備好的的實(shí)驗(yàn)菌液1 mL，每種實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，分別加相應(yīng)的培養(yǎng)基，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。②菌液組：此組只加菌液，不加供試品，按實(shí)驗(yàn)組的方操作計(jì)數(shù)。③供試品對(duì)照組：按中國(guó)藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法——菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定本品菌數(shù)，3個(gè)稀釋級(jí)別每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。④稀釋劑對(duì)照組：此組用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品，按實(shí)驗(yàn)組的方操作計(jì)數(shù)。⑤陰性對(duì)照組：中國(guó)藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項(xiàng)下計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證中，未加入陰性對(duì)照組，此次試驗(yàn)筆者首次提出應(yīng)加入陰性對(duì)照組，以增加驗(yàn)證的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。試驗(yàn)用每種培養(yǎng)基均制備2個(gè)平皿，只加稀釋液，注入培養(yǎng)基后依法培養(yǎng)計(jì)數(shù)。陰性對(duì)照組均無(wú)菌落生長(zhǎng)。

以上實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。計(jì)算菌數(shù)回收率。菌數(shù)回收率見表1。稀釋劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)5種試驗(yàn)菌的回收率均＞70%。說(shuō)明本次試驗(yàn)制備供試液和計(jì)數(shù)的方法適用于骨炎敗毒丸的微生物限度檢驗(yàn)法。

2.4.2控制菌檢查方法的驗(yàn)證：取1∶10稀釋級(jí)的供試液10 mL及1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)菌液分別接種至膽鹽糖培養(yǎng)基和乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，按中國(guó)藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法項(xiàng)下大腸埃希菌和大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查，結(jié)果均為陽(yáng)性。說(shuō)明常規(guī)法即可適用于本品的控制菌檢查。同細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證一樣，本次試驗(yàn)，筆者也增加了陰性對(duì)照組，依法培養(yǎng)后均無(wú)菌生長(zhǎng)。

3　討 論

由驗(yàn)證結(jié)果可知，本品微生物限度采用常規(guī)法，對(duì)5種試驗(yàn)菌的回收率均＞70%，且控制菌驗(yàn)證結(jié)果大腸埃希菌及大腸菌群均為陽(yáng)性，說(shuō)明本品中含有的中藥成分不具有抑菌活性，不會(huì)干擾微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果，采用常規(guī)法即適用于本品的微生物限度檢查。此次驗(yàn)證，確立了骨炎敗毒丸的微生物限度檢查方法，為今后本制劑的質(zhì)量控制提供了有力的科學(xué)證據(jù)。同時(shí)，本次驗(yàn)證，筆者首次提出在依照中國(guó)藥典2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法驗(yàn)證同時(shí)，增加陰性對(duì)照組，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力和科學(xué)性。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:231.

表1　菌數(shù)回收率

［2］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（下冊(cè)）［M］.2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:1895.

［3］張美麗，楊曉東，鄧媛，等.中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證［J］.河南中醫(yī)，2014，34（3）:532.

［4］姚衛(wèi)紅，張麗娜，劉美秀.清熱解毒類中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證［J］.中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2013，8（2）:152.

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1671-8194（2015）20-0051-02