錢芳，劉志輝，陸超

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

高效液相色譜法測(cè)定黃蜀葵花總黃酮固體分散體中金絲桃苷含量*

錢芳，劉志輝，陸超

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

目的建立測(cè)定黃蜀葵花總黃酮固體分散體中金絲桃苷含量的高效液相色譜法。方法色譜柱為Hedera C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30℃。結(jié)果金絲桃苷的質(zhì)量濃度在1.140 6～72.998μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好（r=1.000 0），平均加樣回收率為99.01%，RSD為1.94%（n=9）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于測(cè)定黃蜀葵花總黃酮固體分散體中金絲桃苷的含量。

黃蜀葵花總黃酮；固體分散體；高效液相色譜法；金絲桃苷

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic的干燥花，主要功效為消腫解毒、清利濕熱，內(nèi)服用于治療水腫淋濁、濕熱壅遏，外用治療水火燙傷、癰疽腫毒［1］。黃酮類化合物為主要活性成分，其中以金絲桃苷、異槲皮苷的含量較高［2-3］。黃蜀葵花黃酮類成分吸收較差［4］，影響療效。將其制成固體分散體，能較好地提高黃酮類化合物的溶解度，從而提高其生物利用度。本試驗(yàn)中，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定黃蜀葵花總黃酮固體分散體中金絲桃苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀（G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測(cè)器，Agilent ChemStation，美國安捷倫公司）；BP-211D型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ-1000E型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（江蘇省南通市滬通制藥機(jī)械設(shè)備有限公司）；HH-4型數(shù)顯型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。金絲桃苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111521-201205，供含量測(cè)定用）；黃蜀葵花總黃酮固體分散體（批號(hào)為150511，150512，150514，本實(shí)驗(yàn)室制備）；液相色譜用試劑為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［1］

色譜柱：Hedera C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，0～35min時(shí)（17∶83），35～37min時(shí)（30∶70），37～53min時(shí)（30∶70），53～55min時(shí)（17∶83），55～60min時(shí)（17∶83）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取金絲桃苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇溶解，制成1 mL含20μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。精密稱取樣品90 mg，置25mL容量瓶中，加甲醇，超聲30min，放冷，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取處方比例的輔料，按供試品溶液制備方法制成空白輔料溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，分別進(jìn)樣10μL。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上顯相應(yīng)峰，而空白輔料溶液色譜中無此峰，說明輔料對(duì)金絲桃苷的含量測(cè)定無干擾。金絲桃苷與樣品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，理論板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)在10 000以上，分離度大于2.0。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋至質(zhì)量濃度為72.998，36.499，18.249 5，9.124 8，4.562 4，2.281 2，1.140 6μg/mL的溶液，由樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=22.009X-0.9407，r=1.000 0（n=7）。結(jié)果表明，金絲桃苷質(zhì)量濃度在1.140 6～72.998μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算峰面積。結(jié)果的RSD為1.20%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為0.17%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為150511）樣品約90mg，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以金絲桃苷含量計(jì)算。結(jié)果的RSD為1.01%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為150511）約47mg，共9份，精密稱定，加入金絲桃苷對(duì)照品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 金絲桃苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，每批2份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為150511，150512，150514的供試品中，金絲桃苷含量分別為2.57，2.46，2.51mg/g。

3 討論

黃蜀葵花的主要活性成分為黃酮類化合物，其中以金絲桃苷含量較高，故以金絲桃苷為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

參考2010年版《中國藥典（一部）》［5］，以乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相，結(jié)果分離效果不佳。文獻(xiàn)［6-9］報(bào)道的金絲桃苷的含量測(cè)定方法，試驗(yàn)中金絲桃苷未能有效分離，且分析時(shí)間過長(zhǎng)。曾比較乙腈-四氫呋喃-冰醋酸溶液為流動(dòng)相［10］，四氫呋喃-甲醇-乙腈-冰醋酸溶液為流動(dòng)相［11］。通過反復(fù)摸索，最后以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了較好的分離效果。

本試驗(yàn)中采用超聲處理提取樣品，比較了超聲20，30，40min金絲桃苷的提取率，結(jié)果30min與40min提取的得率相同，故確定提取時(shí)間為30min。

本試驗(yàn)中建立的高效液相色譜法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能有效控制黃蜀葵花總黃酮固體分散體中金絲桃苷的含量。

［1］劉爽，江蔚新，吳斌.黃蜀葵花化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代中藥，2010，12（8）：5-9.

［2］劉子修，李燕思，周艷萍，等.黃蜀葵花化學(xué)成分與藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展［J］.中南藥學(xué)，2012，10（11）：839-841.

［3］張?jiān)?，賈曉妮，曹永翔，等.黃蜀葵花化學(xué)成分研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2008，23（2）：80-82.

［4］薛彩福，郭建明，錢大瑋，等.黃葵醇提物中黃酮類成分在體腸吸收研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（4）：454-459.

［5］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：287.

［6］曹廣尚，楊培民，李芳.HPLC測(cè)定貫葉金絲桃滴丸中金絲桃苷含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（7）：67-68.

［7］方慧祥，楊坤芬，馮玉茹.RP-HPLC法測(cè)定補(bǔ)腎強(qiáng)身片中金絲桃苷的含量［J］.中國藥房，2015，26（3）：413-415.

［8］田元春，劉倩，韋水林，等.HPLC測(cè)定參杞強(qiáng)精膠囊中金絲桃苷含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（14）：149-151.

［9］崔慧芳，常欣.高效液相色譜法測(cè)定月季花中金絲桃苷含量［J］.中國藥業(yè)，2013，22（11）：4-5.

［10］劉麗娜，李勇軍，何迅，等.高效液相色譜法測(cè)定葒葉心通軟膠囊中金絲桃苷含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17（10）：25-26.

［11］李標(biāo)，張鍇，曹文丁，等.高效液相色譜法測(cè)定山楂葉中金絲桃苷的含量［J］.中國藥業(yè)，2003，12（12）：37-38.

Determination of Hyperin in Solid Dispersion of Abelmoschus Manihot Total Flavones by HPLC

Qian Fang，Liu Zhihui，Lu Chao
（Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029）

Objective To establish a method for the determination of hyperin in solid dispersion of Abelmoschus Manihot total flavones by HPLC.Methods The Hedera C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）was used，the mobile phase was acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 360 nm，and column temperature was 30℃.Results The linear range of hyperin was 1.140 6-72.998μg/mL（r=1.000 0），the average recovery rate was 99.01%，and RSD was 1.94%（n=9）.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and reliable.It can be used for the content determination of hyperin in solid dispersion of Abelmoschus Manihot total flavones.

Abelmoschus Manihot total flavones；solid dispersion；HPLC；hyperin

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）22-0112-03

錢芳（1975-），副主任中藥師，主要從事中藥制劑和新藥研究工作，（電子信箱）qfss1024@126.com。

2015-06-23）

*江蘇省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：LZ13063。