王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶400030）

CaMKⅡ-p38通路在異丙酚誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用

王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶400030）

目的分析不同濃度異丙酚對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用。方法取孕14 d大鼠分離胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，分為異丙酚低、中、高濃度組（A1，A2，A3組），對照組（B組）及溶劑組（C組），A1，A2，A3組分別給予質(zhì)量濃度2.5，5.0及10.0μg/mL異丙酚處理，B組不作處理，C組給予脂肪乳替代異丙酚，分析各組細(xì)胞增殖及凋亡情況，Western Blot法分析CaMKⅡ及p38的表達(dá)情況。結(jié)果A組處理12 h后細(xì)胞增殖率無顯著性差異（P＞0.05），處理48，72 h后呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性；與B組相比，C組細(xì)胞凋亡率與死亡率無顯著性差異（P＞0.05），A1，A2，A3組凋亡率和死亡率顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；隨著異丙酚處理濃度的提高，P-p38及P-CaMKⅡ的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論不同濃度異丙酚處理會抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡，CaMKⅡ-p38通路有重要作用，為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎(chǔ)。

異丙酚；神經(jīng)干細(xì)胞；凋亡；CaMKⅡ；p38

異丙酚是廣泛應(yīng)用于臨床麻醉誘導(dǎo)和維持以及重癥患者鎮(zhèn)靜的靜脈麻醉藥物［1］，通過激活γ-氨基丁酸（GABA）受體-氯離子復(fù)合物發(fā)揮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。近期研究顯示，異丙酚能改變突觸的可塑性，對患者記憶和認(rèn)知功能造成不利影響，其神經(jīng)毒性作用可能會引起患者術(shù)后認(rèn)知功能的減退［2］。本研究以體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞為模型，探討不同濃度的異丙酚對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和凋亡的影響以及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

C57/BL小鼠購自南京君科生物科技有限公司（貨號為J006）；DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone公司；異丙酚（批號為ET763，10 mg/mL，AstraZeneca公司）；p38，p-CaMKⅡ抗體購自Avcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)購自Thermo公司，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad，流式細(xì)胞儀購自BD公司。

1.2 方法

神經(jīng)肝細(xì)胞培養(yǎng)：成年C57/BL小鼠20只，其中雌性15只，雄性5只，體重20 g，10～12周齡，顆粒飼料室溫23℃，濕度55%喂養(yǎng)，按雌雄比2∶1合籠交配，孕鼠分籠喂養(yǎng)。取孕14 d小鼠，以頸椎脫臼法處死，無菌下剪開皮膚和肌肉層，暴露子宮，將胎鼠轉(zhuǎn)移至裝有4℃Hanks液的培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺中，剪開子宮，取胎鼠大腦皮層，在顯微鏡下剝離大腦皮層外膜。機(jī)械消化法制備單細(xì)胞懸液，取少數(shù)細(xì)胞懸液臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞比例，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，鑒定并置37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)。

藥物處理：取神經(jīng)干細(xì)胞懸液孵育6 h，待完全貼壁后，隨機(jī)分為5組，每組3孔，分別為異丙酚低、中、高濃度組（A1，A2，A3組），對照組（B組）及溶劑組（C組），A1，A2，A3組分別給予2.5，5.0，10.0μg/mL異丙酚，B組不作處理，C組給予脂肪乳替代異丙酚，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)12，48，72 h。

四氮唑鹽（MTT）法測定增殖活性［2］：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至1×106/mL個細(xì)胞。每孔加入MTT溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以1 000 r/min的速率離心10min，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μL，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光度。增殖抑制率=（1-試驗組OD值/對照組OD值）×100%。

流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況：直接收集懸浮細(xì)胞到10mL的離心管中，每個樣本有（1～5）×106/mL個細(xì)胞，以1 000 r/min的速率離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min離心5min。用100μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15min。500～1000 r/min離心5min，沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測異硫氰酸熒光素（FITC）熒光，另一波長于560 nm的濾器檢測磺化丙啶（PI），左上象限為死亡細(xì)胞，右上及右下象限為凋亡細(xì)胞。

Western Blot法檢測相關(guān)蛋白：收集細(xì)胞，加200μL裂解液［50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），0.1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40），蛋白酶抑制劑］。4℃12 000 r/min離心15min，取上清液，采用Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50μg上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

以MTT法對不同組別細(xì)胞增殖活性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，B組及C組細(xì)胞生長活躍，采用不同濃度的異丙酚處理12 h后細(xì)胞增殖率無顯著性差異（P＞0.05），處理48，72 h后增殖抑制率呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，見圖1。

圖1 不同細(xì)胞增殖情況

2.2 細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞處理48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。與B組相比，C組細(xì)胞凋亡率與死亡率無顯著性差異（P＞0.05），A組凋亡率和死亡率顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡情況（±s，%）

表1 各組細(xì)胞凋亡情況（±s，%）

注：與B組相比，*P＜0.05。

死亡率1.62±0.18 1.71±0.20 2.82±0.42*4.02±0.51*6.28±0.66*組別B組C組A1組A2組A3組凋亡率3.81±0.19 4.02±0.26 11.17±3.84*21.59±4.92*35.27±5.11*

2.3 W estern Blot法相關(guān)蛋白分析

采用Western Blot法對各組細(xì)胞中p38及CaMKⅡ表達(dá)水平進(jìn)行分析。與B組相比，各組p38及CaMKⅡ的表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05），而隨著異丙酚處理濃度的提高，p-p38及p-CaMKⅡ的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 異丙酚對各組細(xì)胞P38及CaMKⅡ表達(dá)的影響

3 討論

異丙酚因起效快、蘇醒迅速及完全的特性被廣泛用于臨床靜脈麻醉［3］，單獨使用異丙酚進(jìn)行靜脈麻醉可能會降低術(shù)后嘔吐及眩暈的發(fā)生；此外，異丙酚的免疫調(diào)節(jié)、抗焦慮、促進(jìn)一氧化氮（NO）合成［4］、抗氧化、抗血小板聚集［5］及神經(jīng)保護(hù)作用［6］也被研究人員所發(fā)現(xiàn)。近年的研究顯示，異丙酚能誘發(fā)神經(jīng)元凋亡［7］，引起突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，損害學(xué)習(xí)和記憶能力。通過體外試驗研究不同濃度異丙酚對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制，可為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎(chǔ)。

異丙酚對細(xì)胞凋亡早期啟動階段的作用及關(guān)鍵靶點研究較少，異丙酚在短時間內(nèi)能激活ERK信號通路，改變線粒體凋亡相關(guān)通路基因的轉(zhuǎn)錄水平。絲裂原信號激酶（MAPK）在細(xì)胞的凋亡中往往扮演著重要角色，MAPK家族中的細(xì)胞外信號激酶（ERK），p38及c-jun氨基端激酶（JNK）在化學(xué)物質(zhì)和應(yīng)激條件下活化，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切?；罨腗APK引起線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程序，伴隨細(xì)胞色素C的釋放及半胱天冬酶的激活。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞信號分子，各種刺激會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)作用，包括遷移、增殖及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是Ca2+信號通路中重要的分子［8］，與Ca2+結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化［9］，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。多項研究表明，Ca2+-CaMKⅡ途徑的激活會進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶（TAK1），激活MAPK家族的p38激酶［10-11］，進(jìn)而應(yīng)激活化激酶（JNK）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］，CaMKⅡ可引起線粒體去極化，釋放細(xì)胞色素C，激活半胱天冬酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究中分析了不同劑量的異丙酚對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，結(jié)果顯示，不同濃度的異丙酚處理12 h后細(xì)胞增殖率無顯著性差異，處理48 h及72 h后呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，表明高濃度的異丙酚能抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，而隨著異丙酚處理濃度的增加p38及CaMKⅡ的表達(dá)水平較對照組無顯著性改變；但p38及CaMKⅡ的表達(dá)量顯著升高，表明異丙酚通過促進(jìn)p38及CaMKⅡ的磷酸化，激活CaMKⅡ-p38通路，在異丙酚誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的過程中扮演重要角色。

綜上所述，異丙酚作為臨床常用的靜脈麻醉藥物，高于臨床有效血藥濃度處理神經(jīng)干細(xì)胞會抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。Ca2+誘導(dǎo)的CaMKⅡ-p38通路在其誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中有重要作用，可為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎(chǔ)。

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Role of CaMKⅡ-p38 Pathway in the Apoptosis of Propofol Induced Neural Stem Cell

Wang Hongmei
（Chongqing Institute of Tumor，Chongqing，China 400030）

Objective To analyze the effect of different concentrations of propofol on neural stem cell apoptosis and the role of CaMKⅡ-p38 pathway.Methods Rats embryonic neural stem cells and pregnant 14 d were selected and divided into low，medium and high concentrations of propofol 2.5，5.0 and 10.0μg/mL propofol，the control group（no treatment）and the solvent group（fat emulsion）and analyzed the cell proliferation and apoptosis.The expression of CaMKⅡand p38 was analyzed by Western Blot.Results The cell proliferation had no significant difference after 12 h of different concentrations of propofol（P＞0.05），48 h and 72 h after treatment showed concentration and time dependent；compared with the control group，the apoptosis rate and mortality of the solvent group had no significant difference（P＞0.05），while the apoptosis rate and mortality were significantly increased in different concentrations of propofol（P＜0.05），and showed a dosage-dependent manner；with the increase of propofol concentrations，P-P38 and P-CaMKⅡexpression were significantly increased（P＜0.05）.Conclusions Different concentrations of propofol can inhibit proliferation of neural stem cells，induce apoptosis；CaMKⅡ-p38 pathway has an important role on providing an experimental basis for the rational and safe clinical anesthesia medication.

propofol；neural stem cells；apoptosis；CaMKⅡ；p38

R962；R971+.1

A

1006-4931（2015）22-0073-03

王洪梅，大學(xué)本科，藥師，研究方向為臨床藥學(xué)，（電話）023-65301592（電子信箱）31767834@qq.com。

2015-07-03）