張桂芝，方向群

（中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853）

紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸的機制研究

張桂芝，方向群

（中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853）

目的分析紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸機制，為治療肺部腫瘤提供參考。方法采用Lewis肺癌細胞株和紫杉醇（5×108mol/L）處理細胞株抗原肽轉(zhuǎn)運體（TAP），通過流式單抗TAP1及TAP2進行體外試驗檢測，體內(nèi)試驗分為腫瘤組和化療組，并設(shè)置空白對照組，化療組小鼠采用Lewis肺癌細胞株經(jīng)尾靜脈注射成瘤，取小鼠肺部組織，采用流式三染法測定調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）。結(jié)果經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細胞株紫杉醇組表面TAP1表達為（5.68±0.65）%，TAP2表達為（89.54±4.81）%，顯著高于Lewis肺癌細胞株組的（1.93±0.25）%和（66.84±5.16）%（P＜0.05）；正常小鼠Treg細胞表達為（12.45±1.53）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達的（25.49±2.29）%（P＜0.01）；紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細胞表達為（17.52±2.28）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達（P＜0.05）。結(jié)論紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇可能通過消除腫瘤局部Treg的產(chǎn)生，部分參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸機制。

肺部腫瘤；調(diào)節(jié)性T細胞；紫杉醇

在腫瘤常規(guī)治療中，常用的化學(xué)療法主要通過最大限度殺傷腫瘤細胞達到治療目的［1］。但化療藥物的使用會在不同程度上損壞機體免疫系統(tǒng)［2-3］。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物對患者自身免疫并無太大影響，但能增強腫瘤細胞的免疫活性，并抑制調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），增強機體免疫力［4］。紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇就是一個代表。本研究中以小鼠為研究對象，探討了紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸的機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與動物

小牛血清（美國Gibco公司）；重組鼠源性GM-CSF，IL-4（Peprotech公司）；PE-CD11b，APC-B220，PEFoxP3等（Biolegend公司）；FITC-MB1，F(xiàn)ITC-Calreticulin，F(xiàn)ITC-TAP2等流式一抗（Biotechnologies公司）；流式二抗（DAKO公司）。

1.2 試驗方法

將培養(yǎng)的腫瘤細胞分為兩組，Lewis肺癌細胞株（3LL，中科院細胞研究所）組的細胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)，放置在培養(yǎng)箱中（溫度37℃，5%CO2）培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后細胞消化貼壁生長。另外一組細胞為紫杉醇組，采用與Lewis肺癌細胞株同樣的培養(yǎng)方法，在細胞貼壁生長5 d后，在培養(yǎng)液中加入5×108mol/L紫杉醇（上海施貴寶制藥有限公司，批準(zhǔn)文號H20080613，規(guī)格為每支16.7mL∶100mg），培養(yǎng)2 d后收集細胞。小鼠購自河北省實驗動物中心，許可證編號：SCXK（冀），20080103，C57BL/6，雄性，體重24～35 g；飼養(yǎng)條件為溫度20～26℃，相對濕度50%，光照12 h，水瓶每周更換2次。將兩組細胞制成細胞懸液，每支細胞懸液管加單細胞（2～5）×106mol/L，采用PBS（北京生物制品研究所，國藥準(zhǔn)字S10850002，規(guī)格為1.0mL）洗滌，在常溫下采用多聚甲醛（2%）固定20min，洗滌轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，微波處理直至沸騰，冰浴冷凍，采用PBS（含1%BSA）洗滌，樣品采用BSA（1%）和PBS（0.1%皂角苷）滲透0.5 h，加入同型對照，加入FITC-TAP1和FITC-TAP2，室溫下作用30min，分別采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗滌2次，加入流式二抗，室溫下作用30min，再次采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗滌2次，采用多聚甲醛（0.5%）固定，檢測。

取0.3×1063LL腫瘤細胞，加入500μL PBS溶液制成懸浮液，通過小鼠尾靜脈注入懸浮液，接種后，將小鼠隨機分為化療組、腫瘤組和對照組，3組小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞8 d后，化療組小鼠每只接種0.012 5mg紫杉醇，加入500μL PBS溶液制成懸浮液。腫瘤組小鼠胸腔內(nèi)注射PBS溶液（500μL），作用21 d后，分別取3組小鼠肺部細胞，重復(fù)試驗3次，空白組小鼠注射等量生理鹽水。

混合透明質(zhì)酸酶、DNA酶和膠原酶，取出小鼠肺部組織細胞，采用眼科手術(shù)剪剪碎肺部組織，將組織放置在4.5 mL混合酶中，在培養(yǎng)箱（溫度37℃，5%CO2）中培養(yǎng)20 min，取出磨碎，將磨碎后的細胞制成單細胞懸浮液，濃度設(shè)定在1×106個/mL。FACS緩沖液洗滌→加入FoxP3固定液→室溫作用20 min→緩沖液洗滌→懸浮液→避光反應(yīng)15min→洗滌，將懸浮液分為5管，設(shè)置同型對照，在試管中分別加入FITC-CD11b，PE-CD11b，APC-B220，APC-B220+FITCCD4+PE-FoxP3和生理鹽水等各20μL，室溫下避光反應(yīng)30 min，洗滌后分析。CD25及CD4雙陽性細胞采用二維點陣圖勾勒，確定FoxP3細胞與Treg細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。小鼠肺部腫瘤細胞表現(xiàn)抗原肽轉(zhuǎn)運體（TAP）表達、肺部Treg細胞表達以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺部腫瘤細胞表面TAP表達

經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細胞株表面TAP1與TAP2表達顯著高于Lewis肺癌細胞株組（P＜0.05），詳見表1。

表1 肺部腫瘤細胞表面TAP表達（±s，%）

表1 肺部腫瘤細胞表面TAP表達（±s，%）

組別紫杉醇組Lewis肺癌細胞株組P值TAP1 5.68±0.65 1.93±0.25 0.006 TAP2 89.54±4.81 66.84±5.16 0.036

2.2 流式分析定義Treg細胞

前向散射儀和側(cè)向散射儀參數(shù)勾勒所需分析的細胞定為R1，見圖1 A；CD25和CD4雙陽性細胞定為R2，見圖1 B；Treg細胞為R2陽性表達細胞，見圖1 C。

圖1 Trep細胞流式分析圖

2.3 肺部腫瘤局部Treg細胞表達

肺部腫瘤局部Treg細胞表達見圖2。其中圖2 A為正常小鼠肺部Treg細胞表達，圖2 B為生理鹽水治療小鼠肺部Treg細胞表達，圖2 C為紫杉醇治療后小鼠Treg細胞表達，圖中黑色表示CD25+CD4+FoxP3+Treg細胞。正常小鼠Treg細胞表達為（12.45±1.53）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達的（25.49±2.29）%（P＜0.01），紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細胞表達為（17.52±2.28）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達（P=0.004）。

圖2 肺部腫瘤局部Trep細胞表達圖

3 討論

紫杉醇是從紫衫樹皮中提取的具有高效抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，具有明確的抗腫瘤效果，是目前公認(rèn)的新型抗腫瘤藥物［5］。目前對紫杉醇抗癌機制的研究一直是熱點，研究紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸機制具有顯著的理論和應(yīng)用價值。

紫杉醇是目前肺部腫瘤化療首選藥物，一般認(rèn)為，紫杉醇能結(jié)合到β-微管蛋白N端31位氨基酸，促進微管聚合穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致細胞周期停滯在G2/M期，實現(xiàn)腫瘤細胞的快速分裂、死亡［6］。也有研究指出，紫杉醇在阻滯腫瘤細胞有絲分裂中，可能通過抑制有絲分裂所需要的微管網(wǎng)正常動態(tài)再生而實現(xiàn)抗腫瘤作用。本研究中試圖通過紫杉醇對逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤逃脫免疫監(jiān)視來揭示紫杉醇的抗腫瘤作用。

在以往的分析中，關(guān)于紫杉醇參與調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）逆轉(zhuǎn)肺癌免疫逃逸的研究國內(nèi)很少報道。國外有研究指出，紫杉醇可抑制腫瘤細胞誘導(dǎo)巨噬細胞免疫抑制，達到巨噬細胞恢復(fù)免疫因子能力［7］。體外研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能促進白細胞介素（IL）-12的產(chǎn)生，糾正腫瘤誘導(dǎo)引起的免疫功能失常。本研究中主要分析紫杉醇對TAP表達和Treg的影響來反映抗腫瘤機制。TAP是參與腫瘤抗原傳遞重要蛋白質(zhì)，TAP1和TAP2是其2個重要亞單位，主要負(fù)責(zé)細胞抗原肽段的轉(zhuǎn)運［8］，其表達下降意味著腫瘤組織復(fù)合物表達下降，也就是腫瘤復(fù)制出現(xiàn)異常，若腫瘤呈現(xiàn)出弱抗原性，將會導(dǎo)致抗原無法被正常傳遞給CD8+，從而實現(xiàn)監(jiān)管免疫。在以往的分析中，腫瘤免疫逃脫機制也包括外周耐受［9］，即腫瘤免疫逃逸通過Treg作用實現(xiàn)，Treg可通過細胞基礎(chǔ)依賴性機制抑制免疫細胞功能，也可通過與效應(yīng)細胞競爭抑制腫瘤細胞的增殖［10］。鐘華等［11］在研究紫杉醇作用機制中，通過調(diào)節(jié)TAP表達可達到抗腫瘤效果，以往研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。5×108mol/L紫杉醇曾被認(rèn)為能刺激體內(nèi)抗原遞呈細胞發(fā)揮作用，故在本研究中，紫杉醇組小鼠體外注射紫杉醇濃度為5×108mol/L，每只小鼠0.012 5mg，結(jié)果經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細胞株表面TAP1和TAP2表達顯著高于Lewis肺癌細胞株組（P＜0.05），提示紫杉醇能上調(diào)腫瘤細胞表面MHC-I類分子的表達。在分析紫杉醇對局部Treg細胞表達中，Treg細胞檢測分析采用流式三染法技術(shù)，結(jié)果正常小鼠Treg細胞表達顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達（P＜0.01），紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細胞表達顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細胞表達（P=0.004），表明紫杉醇具有抑制消除Treg效果，證實了化療與自身機體的免疫并不是簡單的對抗關(guān)系，在藥物和劑量合適情況下，能促進腫瘤抗原的暴露，從而促進抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生。

總之，紫杉醇可能部分參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細胞免疫逃逸機制，能消除腫瘤局部Treg的產(chǎn)生，化學(xué)治療藥物能系統(tǒng)清除腫瘤抗原，提高腫瘤抗原特異性效應(yīng)細胞比例，提高自身免疫。

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［11］鐘華，韓寶惠.紫杉醇通過上調(diào)TAP-1，TAP-2以及消除調(diào)節(jié)性T細胞逆轉(zhuǎn)肺癌免疫逃逸［J］.中國肺癌雜志，2010，13（10）：937-941.

Immune Escape Mechanism s of Paclitaxel Involved in Reversal Lung Cancer Cells

Zhang Guizhi，F(xiàn)ang Xiangqun
（Department of Respiration，South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing，China 100853）

Objective To analyze immune escape mechanisms of paclitaxel involved in reversal lung cancer cells.Methods The cell line antigen peptide transporter（TAP）was processed adopted Lewis lung carcinoma cells lines and paclitaxel 5×108mol/L，in vitro assay was performed by flow through monoclonal TAP1，TAP2.In vivo test was divided into the tumor group and the chemotherapy group，and control group was set.The chemotherapy group was adopted Lewis lung carcinoma cell lines via the tail vein injection into the tumor，the mice lung tissue was selected，the flow was determined by three-regulatory T cells staining（Treg）.Results The TAP1 and TAP2 of Lewis lung cell surface treated by paclitaxel was（5.68±0.65）%and（89.54±4.81）%，which were significantly higher than（1.93±0.25）%and（66.84±5.16）%of the Lewis lung carcinoma cell line group，respectively（P＜0.05），the Treg cells of normal mice was（12.45±1.53）%，which was significantly lower than（25.49±2.29）%of mice lung Treg cells（P＜0.05）；the Treg of cells paclitaxel mice lung was（17.52±2.28）%，which was significantly lower than that of mice lung cells（P＜0.05）.Conclusion Taxol anticancer drugs paclitaxel may eliminate tumors Treg by local regulatory T cells，and partly involved in reversing lung tumor cell immune escape mechanisms.

lung cancer；regulatory T cells；paclitaxel

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0041-03

張桂芝（1970-），女，江蘇豐縣人，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向為肺部腫瘤診治，（電話）010-66876230；方向群（1967-），男，浙江淳安人，博士研究生，主任醫(yī)師，主要研究方向為肺部感染，本文通訊作者，（電話）010-66876230。

2015-05-13；

2015-08-19）