呂蕓，李曉玲

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院，陜西西安710004；2.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學，陜西西安710032）

重樓皂苷D抑制A549細胞轉移作用及機制研究

呂蕓1，李曉玲2

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院，陜西西安710004；2.中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學，陜西西安710032）

目的觀察重樓皂苷D對結腸癌細胞A549遷移與侵襲，以及基質金屬蛋白酶2及9（MMP-2，MMP-9）表達的影響。方法培養(yǎng)結腸癌細胞A549，加入不同質量濃度的重樓皂苷D（1，2μmol/L），采用劃痕試驗，Transwell侵襲試驗觀察重樓皂苷D對A549遷移與侵襲的影響，以免疫印跡試驗（Western Blot）法檢測細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達。結果與結論重樓皂苷D可有效抑制結腸癌細胞A549的遷移、增殖與侵襲，可濃度依賴性地降低MMP-2和MMP-9的表達。機制可能為其降低了MMP-2和MMP-9的表達。

重樓皂苷D；遷移；侵襲；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9

40%的肺癌患者初診時已發(fā)生淋巴結轉移，確診肺癌后5年生存率不足13%，這與肺癌易發(fā)生侵襲、轉移有關［1］。因此，尋找能有效抑制肺癌轉移的藥物，對于改善肺癌患者的生存質量具有重要意義。重樓又名七葉一枝花，為百合科植物，以根莖入藥，具有鎮(zhèn)咳平喘、消腫止痛、清熱定驚、敗毒抗癌等功效；主要用于針對癰腫肺癆久咳、淋巴結核、骨髓炎、跌打損傷、蛇蟲咬傷等癥；具有生物活性的主要成分是多種甾體皂苷［2-4］。本試驗中觀察了重樓皂苷D對肺癌細胞A549增殖與轉移的抑制作用，并初步研究了其相關作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

重樓皂苷D（純度＞98%）購自上海純優(yōu)生物有限公司。人肺癌細胞株A549購于美國ATCC公司；培養(yǎng)基（DMEM，Hyclone公司，批號為NAD1269）；胎牛血清（Thermo Fisher公司，批號為140202）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA，北京索萊寶公司，批號為20140211）；β-肌動蛋白（actin）抗體（Bioworld公司，批號為AP0060）；基質金屬蛋白酶（MMP）-2，9抗體（Epitomic公司，批號為ARE6040，ARE6041）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)及藥物處理人肺癌細胞：將A549細胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃及5%CO2細胞孵箱內培養(yǎng)。重樓皂苷D以DMSO配置為1mmol/L母液，置4℃冰箱保存，臨用前稀釋成工作濃度，工作濃度為1，3，10，30μmol/L。

MTT法檢測細胞增殖率：取生長良好的A549細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板內，置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞充分貼壁后隨機分組，每組設3個平行孔。給藥處理組分別加入含各種濃度的重樓皂苷培養(yǎng)液（1，3，10，30μmol/L）200μL，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/LMTT溶液20μL，再繼續(xù)孵育4 h。棄去孵育液，每孔加入150μLDMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10min，待結晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶標儀上檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（OD）值。計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（試驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。重復3次。

劃痕試驗：取生長良好、處于對數(shù)生長期的A549細胞，以2×105個/孔密度接種至24孔板中。待細胞貼壁生長至融合時（約24 h），用200μL移液頭在細胞層上劃出一道劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，加入含1.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下捕捉0 h劃痕圖片。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡再次捕捉劃痕圖片。

Transwell侵襲試驗：包被基底膜，50mg/L的基膜基質以1∶8稀釋，包被Transwell小室底膜的上表面（約80μL/孔），室溫風干；水化基底膜，吸出孔中殘余液體，每孔加入50μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育30min；接種細胞，制備細胞懸液，細胞濃度調整為5×105/mL，每孔膜的上層加入細胞懸液100μL，下層加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)12 h后，用4%多聚甲醛室溫固定膜下層細胞15min。PBS清洗3次后，行結晶紫染色，顯微鏡照相，捕捉圖片。

免疫印跡試驗（Western Blot）法測定MMP-2和MMP-9的表達：以細胞刮刮取對照組和重樓皂苷D處理24 h（1，2μmol/L）細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，蛋白定量、變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加兔抗MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）及鼠抗β-actin（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，PBS洗膜后加1∶7 000稀釋的相應辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，采用ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抑制A549細胞的增殖

以不同濃度重樓皂苷D處理A549細胞24 h后，采用MTT法測定各組OD值。結果顯示，與對照組相比，重樓皂苷D（1，3，10，30μmol/L）作用于細胞24 h后能顯著抑制A549細胞增殖，抑制率分別為（10.01±1.07）%，（17.67±3.01）%，（54.96±8.13）%，（71.66±4.61）%（P＜0.01），作用呈濃度依賴性，見圖1。

圖1 重樓皂苷D對A549細胞增殖的影響

2.2 抑制A549細胞的遷移

1μmol/L及2μmol/L的重樓皂苷D孵育細胞24 h后，細胞的遷移均受到明顯抑制，抑制率為（23.46±3.53）%和（48.92±4.26）%（P＜0.01），作用呈一定的濃度依賴性，見圖2。

圖2 重樓皂苷D對A549細胞遷移的影響

2.3 抑制A549細胞的侵襲

在對照組中，大量的A549細胞從上層侵入到下方的小室。在重樓皂苷D處理各組，從上層進入下方小室的細胞顯著減少（P＜0.01）。醋酸溶解結晶紫后，在570 nm波長處讀取OD值，發(fā)現(xiàn)該作用呈濃度依賴性，1μmol/L組和2μmol/L組侵襲抑制率分別為（21.33±4.63）%和（56.37±2.11）%（P＜0.01），見圖3。

圖3 重樓皂苷D對A549細胞侵襲的影響

2.4 對A549細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

Western Blot法檢測結果表明，重樓皂苷D可使A549細胞中MMP-2和MMP-9的表達水平呈濃度依賴性降低，見圖4。

圖4 重樓皂苷D對A549細胞中MMP-2，MMP-9表達的影響

3 討論

本試驗結果表明，重樓皂苷D可濃度依賴性地抑制A549的遷移和侵襲。腫瘤遷移和侵襲是決定腫瘤惡性程度的重要因素。腫瘤細胞外基質及基底膜的降解和破壞在腫瘤浸潤和轉移過程中發(fā)揮重要作用。MMPs是一類與鋅結合、能降解細胞外基質活性的酶類，在正常生理條件下，其合成、分泌及降解受到嚴格調控。而惡性腫瘤細胞分泌的MMPs酶活性明顯增強，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。在MMPs中，MMP-2和MMP-9是參與細胞外基質降解的主要成分，這兩者是不同形式的Ⅳ型膠原酶，又稱明膠酶A和明膠酶B。MMP-2主要由腫瘤間質細胞分泌，MMP-9則主要由腫瘤細胞分泌［5-10］。本研究結果顯示，重樓皂苷D可濃度依賴性地降低細胞中MMP-2和MMP-9的表達水平。

綜上所述，重樓皂苷D可能通過下調MMP-2和MMP-9的水平，從而發(fā)揮抑制A549細胞侵襲與遷移的作用。雖然重樓皂苷D的抑制結腸癌細胞轉移的活性與機制有待進一步研究，但該結果將為重樓及其成分開發(fā)提供依據(jù)。

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Effect and Mechanism of Polyphyllin D on Metastasis of A549 Cells

Lyu Yun1，Li Xiaoling2
（1.The Fourth hospital of Xi′an，Xi′an，Shaanxi，China 710004；2.The Fourth Military Medical Universtiy，Xi′an，Shaanxi，China 710032）

Objective To investigate the effects of Polyphyllin D on the migration and invasion and the expression MMP-2，MMP-9 in human lung cancer cells A549.Methods A549 cells were administered with different concentrations of Polyphyllin D（1，2μmol/L）. Cell migration and invasion were then evaluated by wound healing and trans well assays.MMP-2 and MMP-9 expression were assessed by Western blot.Results Polyphyllin D can inhibit the migration and invasion of A549 significantly.Polyphyllin D can reduce MMP-2 and MMP-9 expression in a concentration dependent manner.Conclusion Polyphyllin D can inhibit A549 migration and invasion，the mechanism may be the expression of MMP-2 and MMP-9 are affected.

Polyphyllin D；migration；invasion；MMP-2；MMP-9

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0035-02

2014-10-27；

2015-04-21）