雷震，雷攀，，杜士明，，楊光義，魏晉寶，葉方，張晨寧

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065）

盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的不同提取方法比較研究*

雷震1，雷攀1，2，杜士明1，2，楊光義2，魏晉寶2，葉方2，張晨寧2

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065）

目的對(duì)盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的5種常用提取方法進(jìn)行比較研究，為后期新方法新工藝的建立及工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。方法以薯蕷皂苷元得率、純度為指標(biāo)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，以綜合評(píng)價(jià)值（W）對(duì)直接酸水解法、階梯生物酶法、復(fù)合生物酶法、預(yù)發(fā)酵法、浸提分離法5種提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果5種方法W值由大到小順序?yàn)椋弘A梯生物酶法＞復(fù)合生物酶法＞浸提分離法＞預(yù)發(fā)酵法＞直接酸水解法。結(jié)論階梯生物酶法提取盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元效果較好。

盾葉薯蕷；薯蕷皂苷元；提取方法

薯蕷皂苷元亦稱薯蕷皂素，主要由薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino、盾葉薯蕷Dioscorea zingiberensis C.H.Wright根莖中所含的薯蕷皂苷（Dioscin，Dio）水解脫去糖基而得，是一種重要的藥物中間體［1］。目前，以薯蕷皂苷元為原料合成的口服避孕藥、腎上腺皮質(zhì)激素類藥物有100余種，其需求量?jī)H次于抗菌藥物［2-3］。在工業(yè)生產(chǎn)中，主要采用酸水解法獲取薯蕷皂苷元，此法先以強(qiáng)酸水解薯蕷皂苷糖苷鍵，再以汽油為溶劑萃取皂苷元，其主要缺點(diǎn)是污染環(huán)境、存在安全隱患，也浪費(fèi)水資源，且薯蕷皂苷元得率較低（1.3%左右）［4］。因此，需建立一種清潔、安全、高效的提取方法。近年關(guān)于薯蕷皂苷元提取新方法的研究報(bào)道較多，不同方法薯蕷皂苷元得率差異較大。本課題組對(duì)5種常用提取方法進(jìn)行了比較研究，為后期新方法、新工藝的建立及工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

戴安UltiMateTM3000型高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、Chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)戴安公司）；SPX-2501-G型微電腦光照培養(yǎng)箱；ZHWY-2102C型立式雙層恒溫?fù)u床；AUW-120D型電子分析天平（日本島津）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TDL-5A型離心機(jī)（德國(guó)菲恰爾公司）；VORTEX-5型漩渦混合器；pHS-25型數(shù)顯pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SKFO-0型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱。盾葉薯蕷由湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司提供，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室主任陳吉炎教授鑒定為薯蕷科植物盾葉薯蕷Dioscorea zingiberensis C.H.Wright的根莖，粉碎，過4號(hào)篩，備用；薯蕷皂苷元化學(xué)對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111539-200001）；復(fù)合纖維素酶（Viscozyme L）、淀粉酶（BAN 480L）、糖化酶（AMG 300L）均購(gòu)自諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；甲醇為色譜純，水為純化水，環(huán)己烷、硫酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

直接酸水解法［5］：取盾葉薯蕷粉末50 g，置500mL圓底燒瓶中，加2mol/LH2SO4溶液200mL，進(jìn)行后處理。100℃水解4 h，3 000 r/min離心3min，棄上清液；取沉淀以10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，離心，棄上清液；沉淀100℃烘干，研碎，加環(huán)己烷回流提取4 h，離心，收集上清液，沉淀加適量環(huán)己烷洗滌，離心，2次上清液合并，減壓回收環(huán)己烷，收集結(jié)晶，100℃烘干，稱重，得樣品A1，備用。

階梯生物酶法［6］：取盾葉薯蕷粉末50 g，置500mL圓底燒瓶中，加150mL水混勻，以NaH2PO4溶液調(diào)pH至6.0，加復(fù)合纖維素酶500μL，置培養(yǎng)箱中50℃酶解2 h；取出，調(diào)pH至5.5，加淀粉酶750μL，75℃酶解2 h；取出，加糖化酶500μL，60℃酶解2 h。3 000 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀100℃烘干，研碎，稱重，加2mol/LH2SO4溶液90mL。后續(xù)處理同直接酸水解法，得樣品A2，備用。

復(fù)合生物酶法［7-8］：取盾葉薯蕷粉末50 g，置500 mL圓底燒瓶中，加150 mL水混勻，以NaH2PO4溶液調(diào)pH至5.5。依次加入復(fù)合纖維素酶500μL，淀粉酶750μL，糖化酶500μL，置培養(yǎng)箱中50℃酶解2 h后升溫至65℃酶解4 h。3 000 r/min離心3min，棄上清液，沉淀100℃烘干，研碎，稱重，加2mol/LH2SO4溶液90mL。后續(xù)處理同直接酸水解法，得樣品A3，備用。

預(yù)發(fā)酵法［9-10］：取盾葉薯蕷粉末50 g，置500 mL圓底燒瓶中，加200mL水混勻，置發(fā)酵搖床中，35℃，200 r/min發(fā)酵48 h。3 000 r/min離心3min，棄上清液，沉淀100℃烘干，研碎，稱重，加2 mol/L H2SO4溶液180 mL。后續(xù)處理同直接酸水解法，得樣品A4，備用。

浸提分離法［11-13］：取盾葉薯蕷粉末50 g，置500 mL圓底燒瓶中，以1∶7料液比加90%乙醇溶液，80℃回流提取2 h，3 000 r/min離心3min，收集上清液，沉淀再提取2次，合并3次上清液，回收乙醇，得浸膏，干燥，研碎，稱重，加2mol/LH2SO4溶液25mL。后續(xù)處理同直接酸水解法，得樣品A5，備用。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），前加Waters Atlantis T3預(yù)柱（200 mm×4.6mm，3μm）；流動(dòng)相：甲醇；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下的色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品（用P2O5減壓干燥12 h）12.5mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，得質(zhì)量濃度為2.5 g/L的對(duì)照品貯備液。稱取薯蕷皂苷元樣品A1至A5各10mg，精密稱定，分別置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，以0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液A1至A5。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液并稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1.5，1.0，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02 g/L的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=71.536 X-0.417 4，r=0.9995（n=7）。結(jié)果表明，薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度在0.02～1.5g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下配制的質(zhì)量濃度為0.5 g/L的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的RSD為1.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取薯蕷皂苷元樣品A210mg，依法制備供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果峰面積的RSD為1.49%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取薯蕷皂苷元樣品A210mg，共6份，分別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果薯蕷皂苷元的平均含量為0.832 2 g/L，RSD=1.74%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的薯蕷皂苷元樣品9份，依法制備供試品溶液，精密量取各供試品溶液1.0 mL，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.8 g/L的薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液0.8，1.0，1.2mL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 薯蕷皂苷元加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3 樣品含量比較

取供試品溶液A1至A5，分別按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，由標(biāo)準(zhǔn)曲線法求樣品質(zhì)量濃度，通過計(jì)算得出薯蕷皂苷元得率和純度，結(jié)果見表2。以薯蕷皂苷元得率和純度為指標(biāo)，對(duì)以上5種方法進(jìn)行比較，為消除各指標(biāo)量綱的不同及各指標(biāo)量變范圍不同造成的影響，將各指標(biāo)數(shù)據(jù)按公式X′ij=（Xij-Xj）/Sj進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［14］，式中X′ij為標(biāo)準(zhǔn)化的值，Xij為樣品液i中成分j的含量，Xj為各種樣品液i中成分j的平均值，Sj為成分的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在薯蕷皂苷元生產(chǎn)中得率和純度同等重要，故2個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.5。按以下公式計(jì)算綜合評(píng)價(jià)值，W=（X′得率+X′純度）× 0.5。5種提取方法的W值由大到小順序?yàn)椋弘A梯生物酶法＞復(fù)合生物酶法＞浸提分離法＞預(yù)發(fā)酵法＞直接酸水解法，詳見表2。

表2 不同工藝提取薯蕷皂苷元含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

比較5種薯蕷皂苷元的提取方法，階梯生物酶法和復(fù)合生物酶法綜合提取效果優(yōu)于其他方法。直接酸水解法目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，其工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，但環(huán)境污染嚴(yán)重、資源利用率低、皂苷元得率低，正逐步被淘汰；預(yù)發(fā)酵法在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用也較廣泛，在酸水解前對(duì)盾葉薯蕷進(jìn)行自然發(fā)酵處理，可將皂苷元得率在直接酸水解法基礎(chǔ)上提高7.6%，但其發(fā)酵過程復(fù)雜，可控性差，薯蕷皂苷元得率仍較低，也逐步被淘汰；浸提分離法H2SO4用量為直接酸水解法的12.5%，可在一定程度上改善生產(chǎn)過程中環(huán)境污染問題，但薯蕷皂苷元得率比直接酸水解法還低12.4%，限制了該方法的推廣。階梯生物酶法和復(fù)合生物酶法在酸水解前應(yīng)用生物酶技術(shù)對(duì)盾葉薯蕷進(jìn)行預(yù)處理，可使酸用量減少55%，薯蕷皂苷元得率提高50%，純度提高10%以上，并且盾葉薯蕷經(jīng)酶處理可獲得副產(chǎn)品葡萄糖。此方法雖然成本略高于直接酸水解法，但綜合效益明顯提高，故將生物酶技術(shù)應(yīng)用于薯蕷皂苷元生產(chǎn)具有較好的市場(chǎng)前景。

盾葉薯蕷中約含薯蕷皂苷3%、淀粉37%、纖維素45%，由于淀粉和纖維素的包裹，阻礙了皂苷的水解［15］，故直接酸水解法只能提取出盾葉薯蕷中45%的薯蕷皂苷元成分［6］。階梯生物酶法、復(fù)合生物酶法在酸水解前，用生物酶對(duì)盾葉薯蕷進(jìn)行預(yù)處理，分解了大部分淀粉和纖維素，從而較大幅度提高了皂苷元得率。此外，淀粉和纖維素的存在，會(huì)增加H2SO4用量，階梯生物酶法和復(fù)合生物酶法在酸解前分解掉大部分的淀粉和纖維素，有效降低了H2SO4的用量。

試驗(yàn)中還考察了HPLC法測(cè)定薯蕷皂苷元含量的色譜條件。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合薯蕷皂苷元化學(xué)特性，考察了薯蕷皂苷元在203 nm［16］，206 nm［17］，209 nm［18］波長(zhǎng)處吸收情況，結(jié)果在203 nm處有最大吸收。對(duì)甲醇、甲醇-水（95∶5）、甲醇-水（85∶15）、乙腈-水（90∶10）、乙腈-水（80∶20）為流動(dòng)相等度洗脫及乙腈-水梯度洗脫的洗脫效果進(jìn)行考察，結(jié)果以純甲醇為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線穩(wěn)定，峰形較好，薯蕷皂苷元保留時(shí)間合理。本試驗(yàn)中還考察了3種不同色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)Waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱的分離效果較好。經(jīng)方法學(xué)考察，所選色譜條件符合測(cè)定要求，故使用其進(jìn)行薯蕷皂苷元含量測(cè)定。

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Comparison of Different Extraction Methods of Diosgenin from Dioscorea Zingeberensis

Lei Zhen1，Lei Pan1，2，Du Shiming1，2，Yang Guangyi2，Wei Jinbao2，Ye Fang2，Zhang Chenning2
（1.Department of Pharmacy，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China 442000；2.Hubei University of Chinese
Medicine，Wuhan，Hubei，China 430065）

Objective To provide foundation for new method and process′s optimization and establishment by comparing 5 diosgenin extraction methods of Diosgenin from Dioscorea Zingeberensis.Methods The diosgenin yield and purity were set as the indexes，and after standardization treatment，the direct acid hydrolysis（DACP），ladder enzymatic（LEP），composite enzymatic（CEP），prefermentation（PMP）and extraction separation methods（ESP）were compared by the comprehensive evaluation value（W）.Results The W of the 5 methods is as follows：LEP＞CEP＞ESP＞PMP＞DACP.Conclusion LEP has good effect for extracting the diosgenin from Dioscorea Zingeberensis.

Dioscorea zingeberensis；diosgenin；extraction method

R284.2；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0024-03

雷震（1969-），男，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）123492306@qq.com；杜士明，男，博士研究生，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹苿┭芯颗c開發(fā)，本文通訊作者，（電話）0719-8801163（電子信箱）dsmch@sina.com。

2015-05-07；

2015-07-04）

*2013年湖北省科技支撐計(jì)劃（對(duì)外科技合作類）項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2013BHE017；2014年湖北省教育廳中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：T201414。