蔡佳張雪利吳灶和簡紀常魯義善馮東岳焦茂興

（1.廣東海洋大學 水產學院，湛江　524088；2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江　524088；3.廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江　524088；4.農業(yè)部全國水產技術推廣總站，北京　100125；5.宜春學院，宜春　336000）

紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）C型凝集素基因的克隆與組織表達分析

蔡佳1，2，3張雪利1，2，3吳灶和2，3簡紀常1，2，3魯義善1，2，3馮東岳4焦茂興5

（1.廣東海洋大學 水產學院，湛江524088；2.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江524088；3.廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江524088；4.農業(yè)部全國水產技術推廣總站，北京100125；5.宜春學院，宜春336000）

根據(jù)已知的海水魚類C型凝集素基因的核苷酸保守區(qū)序列設計一對簡并引物，先后通過RT-PCR 和RACE PCR法從紅笛鯛脾臟中首次克隆獲得紅笛鯛C型凝集素（CTL）基因的cDNA全長（登錄號：AGT37609）。該序列長828 bp，開放閱讀框663 bp，編碼220個氨基酸。氨基酸序列分析顯示，紅笛鯛CTL基因氨基酸序列與其他物種CTL的相似性在30%-68%之間。系統(tǒng)進化分析表明，紅笛鯛C型凝集素與鳉魚、條石鯛、斜帶石斑魚 CTL蛋白親緣關系最近，聚成一支。通過熒光定量PCR 分析紅笛鯛基因的組織差異表達，紅笛鯛CTL基因在肝、脾以及皮膚中表達水平較高，其次是頭腎、腎、胃、腸及肌肉，在心臟與腦中表達量較低。

紅笛鯛；C型凝集素；基因克?。唤M織表達分析

凝集素是真核生物中一類重要的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）。根據(jù)不同的結構和功能，凝集素大致可分為calnexin、C型、L型、P型、I型、R型和S型凝集素［1］。其中C型凝集素（C-Type lectins，CTLs）的研究較為廣泛。此類蛋白具有相同的結構特征，如具有碳水化合物識別結構域（carbohydrate recognition domain，CRD），二硫化物結合位點以及鈣離子結合位點［2-5］。在脊椎動物中，C型凝集素可分為17個亞類，它們大多數(shù)都能結合病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），也能通過病原微生物表面的糖基（如N-乙酰氨基葡萄糖、甘露糖等）與病原本身結合［6］。

目前，多種魚類如石斑魚［7］、虹鱒［8］、鯉魚［9］、日本牙鲆［10］、大西洋鮭［11］及鰻鱺［12］的C型凝集素相繼被鑒定，魚類CTLs的組織分布各不相同［7，8，11，12］，并且在受到病原細菌、真菌以及病毒刺激后的表達量上調［7］；此外，魚類C型凝集素在Ca2+的存在下還能使細菌與真菌發(fā)生凝集［7，12］，表明魚類CTLs在魚體抵御病原侵染的免疫反應中可能發(fā)揮著重要的作用。

紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國南部沿海地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖魚類。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，紅笛鯛養(yǎng)殖中弧菌病頻發(fā)，對其養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。但是目前有關紅笛鯛免疫防御機制的研究報道相對較少。本研究對紅笛鯛C型凝集素基因（CTL）進行克隆鑒定，并對該基因的序列特征及組織分布進行分析，旨在為進一步研究紅笛鯛CTL在抵御病原感染過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅笛鯛（50-60 g/條）購于湛江東風市場。

1.2 方法

1.2.1 cDNA一鏈合成 紅笛鯛暫養(yǎng)后取皮膚、心臟、肌肉、腦、頭腎、胃、腸、腎、脾和肝，采用Trizol（Invitrogen）法分別提取總RNA。分別用M-MLV將提取得到的各組織的總RNA反轉成cDNA一鏈用于后續(xù)試驗。另取脾的總RNA，利用Clontech公司的SMARTer RACE 試劑盒，按照試劑盒的方法分別合成用于3' RACE與5' RACE擴增的cDNA模板。

1.2.2 紅笛鯛CTL基因cDNA全長的擴增

1.2.2.1 紅笛鯛CTL基因引物的設計 首先根據(jù)已報道的斜帶石斑魚、條石鯛與香港石斑魚CTL核苷酸序列（登錄號分別為：FJ805452、GU097438與FJ392023）的保守區(qū)域設計簡并引物LsCTL-DF與LsCTL-DR（表1），從脾臟cDNA一鏈中擴增紅笛鯛CTL基因的保守序列，然后根據(jù)簡并引物擴增得到的序列設計紅笛鯛CTL cDNA全長的RACE引物。

1.2.2.2 紅笛鯛CTL基因片段的擴增 利用引物LsCTL-DF與LsCTL-DR，通過降落PCR擴增CTL基因的片段。PCR反應條件為：98℃預變性3 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 30 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應產物電泳檢測后將目的條帶切膠回收?；厥债a物與pMD18-T Vector連接后轉化DH5α感受態(tài)，挑克隆進行菌落PCR鑒定，將鑒定的陽性克隆送至深圳華大基因公司測序。

1.2.2.3 紅笛鯛CTL基因3'與5'端擴增 利用Ls-CTL3'-F1、LsCTL5'-R1分別與試劑盒自帶的UPM Mix引物進行3' RACE與5' RACE PCR的第一輪擴增。反應條件為：98℃預變性3 min；94℃ 30 s，72℃2 min，5個循環(huán)；94℃ 30s，70℃ 30 s，72℃ 2 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，25個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取第一輪PCR產物稀釋10倍作為第二輪的模板，用LsCTL3'-F2、LsCTL5'-R2分別與試劑盒引物NUP進行第二輪PCR，反應條件為：98℃預變性3 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。余下步驟同1.2.2.2。

1.2.3 紅笛鯛CTL基因的序列分析 上述測序結果采用DNAMAN5.2軟件進行拼接，獲得的cDNA序列通過NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast）進行比對分析；通過Genetyx 7 軟件預測開放閱讀框（ORF）以及氨基酸序列；應用 Clustal X2.0及MEGA5軟件分別進行序列的多重比對與系統(tǒng)進化樹構建。通過ExPASy網站的工具http：//web.expasy. org/protparam/在線分析紅笛鯛CTL氨基酸序列的組成與理化性質；http：//web.expasy.org/protscalel分析紅笛鯛CTL蛋白的親/疏水性。利用SignalP4.1 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalIP）分析蛋白的信號肽。跨膜結構通過TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測。序列比對所用登錄號，見表2。

表1 實驗所用引物序列

表2 序列比對所用登錄號

1.2.4 紅笛鯛CTL基因的組織表達分析 利用CTL引物RT-LsCTL-F、RT-LsCTL-R與內參基因β-actin引物RT-actin-F、RT-actin-R，通過熒光定量PCR分析紅笛鯛CTL基因在各個組織中的表達。將各組織的總RNA經DNase I消化后合成cDNA一鏈，用無菌水稀釋后作為熒光定量PCR的模板。以紅笛鯛β-actin做為內參基因，利用Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR 儀對紅笛鯛CTL基因的表達量進行分析，每個樣本進行3個重復。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，進行40個循環(huán)；72℃延伸30 s，4℃保存。PCR反應結束后以各組織中最低的mRNA 表達量為基準，通過2-△△Ct方法計算紅笛鯛CTL基因在不同組織中的相對表達量。

2 結果

2.1 紅笛鯛CTL基因的克隆

紅笛鯛CTL cDNA全長828 bp，其中5'非翻譯區(qū)（5' UTR）37 bp，3'非翻譯區(qū)（3' UTR）128 bp，開放閱讀框663 bp，編碼220個氨基酸。3' UTR含有兩個加尾信號AATAAA。該基因氨基酸序列具有CTLs家族特有的CRD結構域及關鍵的功能基序“EPD”，且含有信號肽序列（前31個氨基酸），不具有跨膜結構，為分泌型蛋白（圖1-圖3）。

2.2 紅笛鯛CTL序列分析

2.2.1 紅笛鯛CTL氨基酸序列的理化性質 ProtParam在線分析結果顯示，紅笛鯛CTL蛋白的理論分子量為 24.53 kD，等電點為5.81。推測的氨基酸序列中Glu的含量最高，比例為9.5%；Leu含量次之，為8.2%；Met含量最低，僅為0.9%。帶正電荷的氨基酸有20個，帶負電荷的氨基酸有35個。不穩(wěn)定指數(shù)為38.55，歸類為一個穩(wěn)定的蛋白。該蛋白總的平均親水值為-0.469，是親水性蛋白。ProtScale分析表明紅笛鯛CTL蛋白親水性氨基酸含量較高，親水區(qū)域較大（峰值小于零的為親水性峰，圖4），為親水性蛋白，與理化分析的結果一致。

2.2.2 紅笛鯛CTL蛋白的同源性比對與進化分析 利用Clustal X2.0軟件將紅笛鯛CTL編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的其他物種CTL蛋白進行序列比較，發(fā)現(xiàn)紅笛鯛CTL與條石鯛、斜帶石斑魚、鳉魚CTL相似度較高，分別為68%、61%和58%，與斑馬魚CTL僅為32%，與牛CTL的相似度最低，為30%。紅笛鯛CTL與其他的比對的序列具有特征性的CRD結構域，其中含有“EPD”功能基序以及4個完全保守的半胱氨酸殘基（圖5）。進化分析結果（圖6）顯示，紅笛鯛CTL蛋白與鳉魚、條石鯛、斜帶石斑魚 CTL蛋白親緣關系最近，聚為一支，與哺乳類以及甲殼類CTL蛋白的親緣關系較遠。

2.3 紅笛鯛CTL基因的組織表達分析

通過熒光定量PCR 檢測紅笛鯛各組織CTL基因的表達量，結果（圖7）顯示，紅笛鯛CTL基因在肝、脾與皮膚中表達水平較高，其次是頭腎、腎、胃、腸及肌肉，在心臟和腦中的表達量較低。

圖1 紅笛鯛 CTL基因cDNA序列及推導的氨基酸序列

圖2 紅笛鯛CTL蛋白的信號肽預測分析

圖3 紅笛鯛CTL蛋白的跨膜結構分析

圖4 紅笛鯛CTL蛋白的親水性/疏水性分析

3 討論

C型凝集素廣泛存在于所有真核生物中，能通過結合細胞表面特定的碳水化合物促進不同細胞的凝集及調節(jié)細胞的吞噬作用，在非己識別與清除侵染微生物中發(fā)揮著重要的功能［13-15］。本試驗通過同源克隆和RACE PCR技術獲得了紅笛鯛C型凝集素基因（CTL），該基因cDNA全長828 bp，開放閱讀框663 bp，編碼220個氨基酸，分子量為 24.53 kD，等電點為 5.81。其編碼的氨基酸序列具有C型凝集素家族特征性的CRD結構域，并且其N端具有信號肽，表明紅笛鯛CTL為分泌型蛋白。

圖5 紅笛鯛CTL與其他物種CTL氨基酸序列比對

圖6 紅笛鯛CTL基因的進化分析

圖7 紅笛鯛CTL基因的組織表達分析

C 型凝集素含有特異的糖識別結構域（CRD），該類結構域一般由115-130個氨基酸組成，包括14個幾乎不變的和18個高度保守的殘基具有相似的序列特征，包括保守的疏水殘基和4個半胱氨酸殘基［16，17］。CDR結構域包含一類重要的功能基序“E/QPN/D/K/S/Q/T”［18］，其中EPN基序（Glu-Pro-Asn）主要與甘露糖結合，而QPD（Gln-Pro-Asp）則對半乳糖的結合具有重要作用［16，17］。在紅笛鯛CTL序列中該基序為EPD（Glu-Pro-Asp），Asp代替了EPN中第3位的Asn，此特征與石斑魚CTL的相應序列相同。石斑魚CTL的研究顯示其主要參與半乳糖的結合，與QPD的結合特性一致，并且石斑魚CTL能使釀酒酵母（真菌）、創(chuàng)傷弧菌（革蘭氏陰性菌）與金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）產生凝集反應［7］。而在其他水產動物中，凡納濱對蝦CTL3蛋白也含有相同的“EPD”基序，其重組蛋白能使溶藻弧菌、副溶血弧菌（革蘭氏陰性菌）以及枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性菌）發(fā)生凝集，但是對無乳鏈球菌（革蘭氏陽性菌）卻沒有相同的作用［19］。上述研究表明C型凝集素的凝集特異性可能不僅僅與本身的糖基結合特性及細菌種類相關。此外，C型凝集素 CRD結構域中還具有一段保守的“WIGL”基序，該序列可以作為鑒定C型凝集素的一個有效標志，其中的甘氨酸（Gly）由于其位置的高度保守被推測可能與CRD的折疊以及穩(wěn)態(tài)相關［6］。本研究下一步將通過點突變構建突變體真核表達載體，并對紅笛鯛CTL不同突變體的重組蛋白進行結構與特性分析，為深入了解該蛋白的功能機制奠定基礎。

目前已報道的不同魚類CTLs基因表達譜存在差異，且具有較明顯的組織分布特異性，在免疫相關組織中均有較高的表達。其中石斑魚CTL在肝與皮膚中的表達量最高［7］，牙鲆和日本鰻鱺CTL分別僅在肝和皮膚中表達［11，12］；而虹鱒CTL則分布在脾臟與外周血淋巴細胞中［8］。本研究中，紅笛鯛CTL基因在肝、脾以及皮膚中表達水平較高。硬骨魚類的肝與脾等器官在受到免疫接種后，其黑色素巨噬細胞增多，通過與淋巴細胞和抗體生成細胞的聚集參與體液免疫和炎癥反應，并對內源或者外源的異物進行貯存、破壞或脫毒［20］。而魚類皮膚的上皮組織中分布有大量的黏液細胞，是魚體與外界環(huán)境接觸的第一道屏障，對魚體抵御病原侵染至關重要［21］。盡管不少研究已經證實魚類CTL蛋白能使多種細菌、真菌發(fā)生凝集［7，12，22］，并且魚類CTL結合微球還能顯著增強巨噬細胞的吞噬作用［22］，但是魚類CTL相關的作用模式及其在魚類抵御病原侵染過程中的功能尚不清楚。因此，今后可以從兩方面開展紅笛鯛CTL基因的研究：一方面，通過原位雜交或者免疫組化技術鑒定分泌CTL的細胞類群，推測其可能的生物學功能；另一方面，分析CTL蛋白在調節(jié)免疫細胞功能及抗病原微生物免疫反應中的功能，這些研究結果將為我們進一步了解C型凝集素在魚類免疫系統(tǒng)中的作用提供新的方向。

4 結論

本試驗克隆獲得紅笛鯛CTL基因cDNA全長，該序列長828 bp，其中開放閱讀框663 bp，編碼220個氨基酸。組織表達分析表明，紅笛鯛CTL基因在多種組織中均有表達，在肝、脾以及皮膚中表達水平較高。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Tissue Expression Analysis of C-type Lectin Gene from Humphead Snapper（Lutjanus sanguineus）

Cai Jia1，2，3Zhang Xueli1，2，3Wu Zaohe2，3Jian Jichang1，2，3Lu Yishan1，2，3Feng Dongyue4Jiao Maoxing5
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang524088；3. Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang524088；4. National Fisheries Technical Extension Center，Beijing100125；5. Yichun University，Yichun336000）

According to conservative region of known C-type lectin（CTL）gene， a pair of degenerate primers were designed， and full length cDNA sequence of C-type lectin gene was amplified by RT-PCR and RACE PCR from spleen of humphead snapper， Lutjanus sanguineus（GenBank accession number: AGT37609）for the first time. The total cDNA sequence of the gene was 828 bp， consisting of a 663 bp open reading frame（ORF）and encoding 220 amino acids. The deduced amino acid sequence of humphead snapper CTL shared 30%-68% identities with other species CTLs. Phylogenetic analysis showed that humphead snapper CTL was clustered closely with mummichog， rock bream， and orange-spotted grouper CTL. Moreover， the mRNA expression levels in different tissues were analyzed by real time quantitative PCR. The result showed that humphead snapper CTL gene expressed in all tested tissues with highest level in liver， spleen and skin， moderate level in head kidney， kidney， stomach， intestine and muscle， and lowest level in heart and brain.

Lutjanus sanguineus；C-type lectin；gene cloning；tissue expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.028

2014-10-11

廣東高校國際合作創(chuàng)新平臺項目（2013gjhz0008），十二五國家科技支撐計劃（2012BAD17B02），廣東教育廳科技創(chuàng)新重點項目（2012CXZD0026）

蔡佳，男，講師，研究方向：水產動物病害防治；E-mail：matrix924@foxmail.com

魯義善，教授，研究方向：水產動物免疫學及病害控制；E-mail：fishdis@163.com