沈佳 江靈芝 孫雪

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院　浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波　315211）

蛋白核小球藻Fesod基因的克隆及表達分析

沈佳 江靈芝 孫雪

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波315211）

利用RACE技術(shù)克隆了蛋白核小球藻Fesod全基因序列，得到1 215 bp序列，其5'非翻譯區(qū)長52 bp，3'非翻譯區(qū)長452 bp，共編碼236個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該Fesod基因編碼蛋白的分子量為26.42 kD，等電點為6.98；位于線粒體中的概率是73.9%；該蛋白沒有信號肽序列；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明FeSOD中α-螺旋和無規(guī)卷曲分別占53.39%和39.41%。再利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了不同鹽度和水楊酸濃度對蛋白核小球藻Fesod基因表達的影響，結(jié)果表明Fesod表達量隨著鹽度升高而增加，45‰鹽度表達量為15‰鹽度的3.61倍；而植物激素水楊酸的添加一定程度抑制了45‰鹽度培養(yǎng)藻Fesod基因的表達，并且隨其濃度增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。表明蛋白核小球藻Fesod受鹽度誘導(dǎo)，而水楊酸對其影響不明顯。

蛋白核小球藻；鐵超氧化物歧化酶；轉(zhuǎn)錄表達；鹽度；水楊酸

超氧化物歧化酶（SOD）是一種普遍存在于植物界中的含金屬原子的抗氧化酶，常被作為研究植物抗逆性的指標(biāo)［1］。據(jù)SOD所結(jié)合金屬原子的不同，植物SOD可分為3種類型：MnSOD、Cu/ZnSOD和FeSOD，在低等植物中以FeSOD和MnSOD為主［2］。SOD作為生物體內(nèi)第一個參與活性氧清除反應(yīng)的重要保護酶［3］，可將超氧陰離子（O2·-）轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2再在過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等作用進一步還原為H2O和O2，從而清除植物體內(nèi)過多的自由基，以減少自由基對植物的毒害［4］。因此植物可以通過提高SOD等抗氧化酶活性來增強其抗逆性，使植物體在一定程度上能耐受或抵抗高溫、干旱、高鹽等逆境脅迫帶來的危害［1，5］。但逆境脅迫對SOD的影響并不完全一致，如杜氏藻D. tertiolecta在3 mol/L NaCl脅迫下的SOD和CAT等抗氧化酶活性則沒有明顯變化［6］。

此外，植物激素如水楊酸（SA）和脫落酸（ABA）等也能誘導(dǎo)sod基因的表達［7］。水楊酸是一種植物內(nèi)源信號物質(zhì)和新型植物激素，大量試驗證明水楊酸具有提高植物抗病害等生物脅迫和鹽度、高低溫等非生物脅迫的作用［8］。其中減輕逆境脅迫引起的抗氧化損傷是水楊酸提高植物抗逆性的重要方式［9］。SA可以提高鹽脅迫下的SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性，從而逆轉(zhuǎn)鹽度壓力對抗氧化酶的擾亂［10-12］。

小球藻（Chlorella）是一類廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化工等方面的重要經(jīng)濟微藻，同時小球藻具有較廣泛的耐受性，因此經(jīng)常用于重金屬、污染物及其它逆境脅迫的研究［13-15］。目前，在低等藻類中關(guān)于FeSOD的研究不多，本研究以蛋白核小球藻（C. pyrenoidosa）為材料，克隆該藻的鐵超氧化物歧化酶全基因序列，研究不同鹽度以及水楊酸濃度對Fesod表達變化的影響，旨在豐富低等藻類植物中Fesod基因序列信息，并為FeSOD酶在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)逆境脅迫研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用藻種為蛋白核小球藻820，來自寧波大學(xué)海洋生物工程重點實驗室藻種室。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理 蛋白核小球藻820培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度約為40 μmol/（m2·s），光暗周期為12 L/12 D。培養(yǎng)基為添加f/2的人工海水培養(yǎng)基，通過控制NaCl的量來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鹽度分別為15‰、30‰和45‰；在鹽度為45‰時，添加水楊酸母液至水楊酸終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0和2.0 mmol/L。

1.2.2 Fesod部分序列的克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的蛋白核小球藻（DQ183067）、菜菌衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，GQ413964、XM_001690539）和鹽生杜氏藻（Dunaliella salina，AY847684）的Fesod序列，運用MEGA5.1軟件中的ClustalW程序進行同源性比對，設(shè)計簡并引物sodF和sodR（表1）。將離心收集的對數(shù)生長中期的藻細(xì)胞加液氮研磨后，按照Trizol試劑（Invitrogen）說明進行RNA的提取。RNA經(jīng)過電泳檢測與紫外微量分光光度計（Nanodrop 1000）測定總RNA濃度和純度，再按照PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）的說明轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA作為模板進行PCR擴增。擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸8 min。將電泳檢測擴增大小正確的產(chǎn)物進行回收，用pMD18-T 載體（TaKaRa，大連）進行連接與轉(zhuǎn)化，最后將經(jīng)過挑菌檢測為陽性的重組克隆送去測序。所有引物序列的合成和序列測定均由Invitrogen（上海）公司完成。1.2.3 Fesod全基因序列擴增 測序得到的Fesod基因部分序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計RACE擴增引物（表1）。用上述相同方法進行RNA提取，以其反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行5'-RACE和3'-RACE（RACE試劑盒來自TaKaRa，大連）擴增。將擴增產(chǎn)物進行克隆后送去測序。最后將獲得的Fesod部分序列、5'-RACE和3'-RACE序列一起拼接后獲得Fesod全基因序列，并將序列遞交到NCBI數(shù)據(jù)庫。

表1 Fesod基因的擴增引物

1.2.4 Fesod基因的系統(tǒng)進化分析 在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的protein數(shù)據(jù)庫中查找?guī)追N綠藻的Fesod基因，將它們與本實驗得到的蛋白核小球藻一起用MEGA5.1軟件中的ClustalW程序進行比對，再用鄰接法進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，Bootstrap值為1 000。

1.2.5 Fesod的生物信息學(xué)分析 在NCBI網(wǎng)站，通過 ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html），查找其可能的開放閱讀框。蛋白質(zhì)分子量和等電點預(yù)測使用http：//www.expasy.org，亞細(xì)胞定位用http：//psort.hgc.jp，信號肽預(yù)測用http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP，蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測用http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=/NPSA/npsa_seccons.html。

1.2.6 Fesod的表達分析 利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計Fesod熒光定量PCR引物（表1），用18S rDNA作為內(nèi)標(biāo)［16］。按照SYBR Premix Ex Taq 說明書進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加水補足總體積到20 μL。熒光定量PCR（Rotor-Gene 6000 PCR儀）反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共40次循環(huán)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行分析［17］。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均采用Excel軟件作圖，用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用SPSS的獨立樣本T檢驗進行差異顯著性分析，用P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 蛋白核小球藻Fesod基因的克隆

以蛋白核小球藻cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴增得到約250 bp大小的cDNA片段，測序后其長度為269 bp（圖1-A）。利用GenBank中的BLASTn工具進行搜索發(fā)現(xiàn)，該序列與萊茵衣藻Fesod（GenBank登錄號為U22416）和鹽生杜氏藻（AY847684）的Fesod相似性均為75%，與蛋白核小球藻211-8bFesod（DQ183067）的相似性為73%。該比較結(jié)果表明獲得片段是蛋白核小球藻的Fesod基因。

根據(jù)獲得的269 bp的Fesod部分序列，設(shè)計RACE引物進行上下游未知序列的擴增。5'-RACE擴增后，電泳檢測（圖1-B）顯示大約在600 bp的位置有一條PCR條帶，3'-RACE擴增反應(yīng)后，電泳檢測（圖1-C）顯示在700 bp附近有一條PCR條帶?？寺y序后得到5'-RACE和3'-RACE的擴增產(chǎn)物分別為604 bp和639 bp。拼接后得到長為1 215 bp的全Fesod基因序列。

圖1 蛋白核小球藻Fesod基因擴增結(jié)果

2.2 幾株綠藻Fesod基因編碼蛋白的進化分析

在NCBI中利用該蛋白核小球藻Fesod（GenBank登錄號為KF736945，蛋白序列號為AHD25899）進行BLASTx搜索，發(fā)現(xiàn)該蛋白核小球藻Fesod編碼氨基酸序列與小球藻C. variabilis（XP_005851580）相似性最高（為68%），與萊茵衣藻Fesod（XP_0016-90591）相似性為64%，而與蛋白核小球藻Fesod（ABA71697）相似性為65%。

我們又從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了11條綠藻和1條小麥的FeSOD氨基酸序列，與本研究得到的蛋白核小球藻FeSOD共13條序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖2）表明，12條綠藻依次聚在一起，高等植物小麥（與其它綠藻的遺傳距離在0.529-0.548）在最外群。其中6株綠藻——兩株萊茵衣藻（綠藻門、綠藻綱、衣藻目和衣藻科）（XP_001690591和AAB04944），團藻目的雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）（AFC35159）、團藻Volvox carteri f. nagariensis（XP_002946030）和鹽生杜氏藻（AAX92665），以及衣藻科的Polytomella parva（ABH11031）最先聚類；外面依次是石莼綱的裂片石莼（Ulva fasciata）（ABR23159）、Trebouxiophyceae綱的蛋白核小球藻（ABA71697）、Coccomyxa subellipsoidea（XP_00564-7238）、本研究的蛋白核小球藻（AHD25899）和另外兩條小球藻C. variabilis（XP_005851580和XP_005850533）。可見，根據(jù)FeSOD氨基酸序列可以把綠藻門的不同綱分開，但是可能不太適合更低分類水平的區(qū)分。如蛋白核小球藻（ABA71697）并沒有與同屬的小球藻聚在一起，但該小球藻與裂片石莼的遺傳距離為0.310，與同屬其他3株小球藻的距離為0.329-0.394，差別較小。

圖2 根據(jù)FeSOD序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 蛋白核小球藻Fesod的生物信息學(xué)分析

獲得的Fesod基因全長1 215 bp，其中5'-非翻譯區(qū)長52 bp，3'-非翻譯區(qū)長452 bp，開放閱讀框長711 bp，共編碼236個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該Fesod編碼蛋白的理論分子量為26.42 kD，等電點為6.98。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該Fesod基因定位于線粒體中的概率是73.9%，位于細(xì)胞核中的概率是13.0%，位于細(xì)胞質(zhì)、胞外和細(xì)胞骨架的概率均是4.3%。

信號肽預(yù)測結(jié)果表明該FeSOD蛋白沒有信號肽?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明編碼的236個氨基酸全部位于胞外。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明α-螺旋占53.39%，β-折疊占5.93%，無規(guī)卷曲所占比例為39.41%，不明確的氨基酸占1.27%（圖3）。

圖3 蛋白核小球藻FeSOD二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.4 蛋白核小球藻Fesod基因的轉(zhuǎn)錄表達分析

圖4顯示，蛋白核小球藻Fesod表達量隨著鹽度升高而增加。以15‰鹽度培養(yǎng)藻的Fesod表達量為1，30‰和45‰鹽度培養(yǎng)藻的Fesod表達量分別是15‰鹽度培養(yǎng)藻的Fesod表達量的1.89倍（P＜0.05）和3.65倍（P＜0.01）。結(jié)果表明，高鹽脅迫一定程度地促進了蛋白核小球藻Fesod的表達，推測高鹽脅迫時，藻細(xì)胞通過增加Fesod基因表達從而增加FeSOD酶的含量來對抗高鹽逆境傷害。

植物激素水楊酸的添加對45‰鹽度培養(yǎng)蛋白核小球藻Fesod表達的影響，見圖5（30‰鹽度結(jié)果與45‰類似，文中未顯示）。從0.1-2.0 mmol/L SA濃度變化，F(xiàn)esod表達呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。以未添加SA的Fesod基因表達量作為1，0.1 mmol/L SA組Fesod表達量為對照組的0.54倍（P＜0.05），0.5和2.0 mmol/L SA組Fesod表達量分別為對照組的0.84倍和0.80倍，而1.0 mmol/L SA組Fesod表達量為對照的1.17倍。表明水楊酸誘導(dǎo)Fesod表達的作用不明顯，低濃度（0.1和0.5 mmol/L）和高濃度（2.0 mmol/L）水楊酸處理Fesod基因表達均低于對照組，只有1.0 mmol/L SA添加后Fesod表達水平比對照略高，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 鹽度對蛋白核小球藻Fesod轉(zhuǎn)錄表達的影響

圖5 水楊酸對蛋白核小球藻Fesod轉(zhuǎn)錄表達的影響

3 討論

SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的重要酶，相對于高等植物中Cu/ZnSOD和MnSOD的研究，低等藻類植物中關(guān)于SOD的研究并不多，如大型紅藻壇紫菜（Pyropia haitanensis）和龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）中Mnsod基因的克隆與熱脅迫下的表達［18，19］；微藻中的鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）、雨生紅球藻和萊茵衣藻的Fesod的克隆等［20-22］。FeSOD一般位于植物葉綠體中［23］，也有FeSOD位于細(xì)胞質(zhì)中的報道，如苔蘚植物Pogonatum inflexum和大豆［24，25］。但本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該FeSOD蛋白位于線粒體中（其概率是73.9%）。已進行基因組測序的小球藻C. variabilis中有兩條Fesod基因，分別編碼236個和204個氨基酸。該小球藻C. variabilis中編碼236個氨基酸的Fesod（XP_005851580）與本研究小球藻Fesod編碼的氨基酸個數(shù)相同，對其序列進行亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明其FeSOD蛋白位于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的概率分別是34.8%和30.4%。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明該蛋白核小球藻中α-螺旋占53.39%，β-折疊占5.93%；鈍頂螺旋藻FeSOD的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占比例很大，而β-折疊只有一個［20］；而雨生紅球藻FeSOD中則含有3個β-折疊片和11個α-螺旋［21］，這些結(jié)果都符合植物中FeSOD的α-螺旋所占比例遠遠大于β-折疊的序列結(jié)構(gòu)特征［23］。并且，該蛋白核小球藻FeSOD序列也有高等單子葉植物FeSOD蛋白的WEHAYY保守序列［23］。

鹽脅迫是影響植物生命活動的重要環(huán)境因素。鹽脅迫會對植物體內(nèi)活性氧的代謝系統(tǒng)平衡造成破壞，具體表現(xiàn)在活性氧（ROS）含量增加，SOD活性增加。而作為SOD家族的一員，F(xiàn)esod表達量也受鹽度誘導(dǎo)。如杜氏鹽藻中3.0 mol/L NaCl培養(yǎng)的Fesod表達量明顯比1.5 mol/L NaCl增加［26］；100 mmol/L NaCl 處理后銀杏葉中Fesod基因表達量提高為對照組的4.3倍［27］。這些結(jié)果與本研究一致。

此外，據(jù)報道其他植物激素對高等植物Fesod基因表達的影響不同，如ABA可以誘導(dǎo)銀杏Fesod基因的表達［27］，但IAA則無此作用［27］；而ABA和IAA不能誘導(dǎo)煙草Fesod的表達，并且ABA作用下煙草Fesod mRNA反而有所降低［28］。本研究結(jié)果顯示水楊酸對蛋白核小球藻Fesod表達作用不明顯。

4 結(jié)論

本研究從蛋白核小球藻中克隆到1 215 bp的Fesod序列，共編碼236個氨基酸，該蛋白很可能位于線粒體中，無信號肽序列，α-螺旋含量遠高于β-折疊。該Fesod基因表達受鹽度誘導(dǎo)，而植物激素水楊酸對其表達影響較小。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Gene Cloning and Expression Analysis of Fesod Gene from Chlorella pyrenoidosa

Shen Jia Jiang Lingzhi Sun Xue
（Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo315211）

The Fesod gene of Chlorella pyrenoidosa was cloned by RACE method. Total 1 215 bp Fesod sequence was obtained， containing 52 bp 5' untranslated region， 452 bp 3' untranslated region， and an open reading frame of 711 bp. The bioinformatics analysis showed that the molecular weight of FeSOD was 26.42 kD and isoelectric point was 6.98； the FeSOD protein located in the mitochondria with a probability of 73.9%； the FeSOD protein had no signal peptide； and the secondary structure prediction results showed that a-helix and random coil in FeSOD accounted for 53.39% and 39.41%， respectively. Then， the transcriptional expression of Fesod at different concentrations of salinity and salicylic acid was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that Fesod expression increased with the salinity varying from 15‰ to 45‰， and the expression quantity was 3.61 times under 45‰ salinity culture than that under 15‰ salinity. Moreover， salicylic acid could inhibit the mRNA accumulation of Fesod to a certain extent under 45‰ salinity， and its accumulation firstly increased and then decreased with the salicylic acid concentration from 0.1 to 2.0 mmol/L. In conclusion， the expression of Fesod was induced by salinity， while salicylic acid showed no significant effect on its expression.

Chlorella pyrenoidosa；Fe-superoxide dismutase；transcriptional expression；salinity；salicylic acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.027

2014-09-05

浙江省自然科學(xué)基金項目（LY13D060007），浙江省科技創(chuàng)新團隊（2010R50025-25）

沈佳，女，碩士研究生，研究方向：藻類生化與分子生物學(xué)；E-mail：sj677501@163.com

孫雪，女，博士，副研究員，研究方向：藻類生化與分子生物學(xué)；E-mail：sunxue@nbu.edu.cn