羅小溪 高建忠 陳再忠 于永亮

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上?！?01306）

新型脫氮菌Rhizobium radiobacter的分離鑒定及其硝化特征分析

羅小溪 高建忠 陳再忠 于永亮

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

旨在從污水處理廠中分離和鑒定具有硝化能力的脫氮菌。采用富集培養(yǎng)、平板劃線分離菌株，命名為N312，并通過形態(tài)觀察、16S rDNA基因序列分析及Biolog鑒定，利用正交試驗法對該菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，分離獲得具有硝化能力的自養(yǎng)脫氮菌，初步鑒定屬于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），為革蘭氏陰性桿菌，菌落圓形，乳白色，6 d內(nèi)亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%，通過正交試驗初步得到最佳培養(yǎng)基配方為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g。菌株N312是一株具有研究價值的自養(yǎng)脫氮菌。

脫氮菌；16S rDNA；Biolog；正交試驗；硝化速率

亞硝酸鹽是氮循環(huán)的一部分，也是氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物［1］。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過程中，亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中的主要污染之一，它對養(yǎng)殖對象有一定的毒害作用。水體中亞硝酸鹽超過一定濃度會導(dǎo)致魚類缺氧甚至窒息死亡［2，3］?？梢?，亞硝酸鹽已成為嚴(yán)重影響水質(zhì)的因素之一。因此，去除水體中的亞硝酸鹽對水質(zhì)調(diào)控具有重要的意義。

生物脫氮是目前水處理領(lǐng)域中關(guān)注和研究的熱點(diǎn)［4］。傳統(tǒng)方法中，一般是使用硝化細(xì)菌進(jìn)行脫氮，但是硝化細(xì)菌生長緩慢，培養(yǎng)困難，而且價格高［5］，因此，亟待開發(fā)新的、高效的脫氮菌。根瘤菌的發(fā)現(xiàn)并證實其與豆科植物的共生有固氮作用已有上百年的歷史［6］，但其脫氮作用目前鮮有相關(guān)報道。關(guān)于應(yīng)用根瘤菌的脫氮是對傳統(tǒng)理論的豐富和突破。

本研究以某污水處理廠的活性污泥為分離源，通過富集和分離純化等步驟，分離到一株具有去除亞硝態(tài)氮能力的細(xì)菌，命名為菌株N312。根據(jù)其形態(tài)、16S rDNA基因序列和Biolog鑒定系統(tǒng)，探討該菌株的分類學(xué)地位，旨在為水族箱和養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮處理的實際應(yīng)用提供有效菌源。

1 材料與方法

1.1.1 試驗材料 供試水樣采自2014年4月上海市某污水處理廠的污水。試驗于上海海洋大學(xué)觀賞水族實驗室進(jìn)行，菌株N312從污水中篩選分離得到。

1.1.2 試驗試劑 UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR Master Mix（2×）、PCR 引物、膠回收試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑（分析純）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 富集培養(yǎng)基［7］NaNO21.0 g，Na2CO31.0 g，MgSO4·7H2O 0. 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，蒸餾水1 L定容，KH2PO40.5 g單獨(dú)滅菌。

1.1.4 分離培養(yǎng)基 NaNO20.5 g，Na2CO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.015 g，MnSO4·H2O 0.005 g，K2HPO40.5 g，NaH2PO40.5 g，蒸餾水 1 L定容，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉2%。

1.1.5 自配廢水組成 NaNO21.0 g，Na2CO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，蒸餾水1 L定容，KH2PO40.5 g單獨(dú)滅菌。

1.2 方法

其二為串通招投標(biāo)。在藥品、設(shè)備的采購過程中，參與招標(biāo)的藥企或設(shè)備供應(yīng)商在利益的驅(qū)動下，暗行串通抬價之事侵占國有資產(chǎn)，加劇醫(yī)療保險基金流失。

1.2.1 菌株的富集 取10 mL污泥樣品加到經(jīng)滅菌（1×105Pa、30 min）處理分裝有100 mL上述富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，富集培養(yǎng)5 d，設(shè)計對照組，做2個平行。每隔24 h定期檢測NH4+-N和NO2

--N含量。當(dāng)檢測亞硝酸氮含量接近0時，添加20 mL富集培養(yǎng)基。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌株的分離純化 取NO2--N減少快的富集培養(yǎng)液，采用平板劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，28℃恒溫、黑暗培養(yǎng)，觀察有乳白色菌落后，挑取單菌落至分離平板，重復(fù)劃線分離3次，得到純培養(yǎng)。將此單菌接種到上述富集培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔24 h檢測培養(yǎng)基上清液的NH4+-N和NO2

--N。

1.2.3 水質(zhì)檢測方法［8］的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，的測定采用納氏試劑分光光度法。

1.2.4 16S rDNA的PCR擴(kuò)增、克隆與測序 參考黃毅［9］的方法，采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA。通用引物，正向引物27F為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PCR Master Mix（2×）25 μL，引物27F（0.2 μmol/L）1 μL，引物1492R（0.2 μmol/L）1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用膠回收試劑盒（San Prep Column DNA Gel Extraction Kit，Sangon Biotech）進(jìn)行回收。純化后的目的片段連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中。經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)菌液，利用M13通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測，取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 測序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索［10］，選取同源性最高的序列并通過MEGA5.0軟件進(jìn)行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.6 Biolog鑒定 挑取單個純化菌種接種到Biolog專用接種液IF-A中，制成一定細(xì)胞濃度的菌懸液，用Turbidimeter進(jìn)行校準(zhǔn)，使細(xì)胞濃度在92%-96%范圍內(nèi)，然后用移液槍將菌懸液按每孔100 μL轉(zhuǎn)接GenIII微孔板的96個孔內(nèi)，做好標(biāo)記然后放到33℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h和16-24 h時在讀數(shù)儀上讀取菌株的代謝指紋特征，在Biolog數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對，查找最接近的結(jié)果。

1.2.7 培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗 為了研究菌株N312營養(yǎng)因子需要的影響，設(shè)計L9（33）培養(yǎng)基正交試驗，3個關(guān)鍵因素分別為氮源、碳源和無機(jī)鹽。其中，氮源（NaNO2）取0.5、1.0和1.5 g，碳源（Na2CO3）取0.5、1.0和1.5 g，無機(jī)鹽（MgSO4·7H2O）取0.25、0.5和0.75 g。以硝化速率為依據(jù)，檢驗培養(yǎng)菌株N312的最佳培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

由圖1可知，菌株N312在分離培養(yǎng)基上的菌落為乳白色，表面光滑，不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色得到菌株N312形態(tài)（圖2），為革蘭氏陰性，油鏡下觀察為短桿狀，單個排列。

圖1 菌株N312篩選驗證圖

圖2 細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）

2.2 硝化速率結(jié)果

2.3 菌株P(guān)CR擴(kuò)增、克隆與測序結(jié)果

克隆后，利用M13通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，約在1 800 bp處有一明亮的條帶（圖4）。測序結(jié)果經(jīng)在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，菌株N312與Rhizobium sp.同源性最高，GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為KM047639。從中選取同源性最高的4株菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖5）顯示，N312與Rhizobium radiobacter GCIZ（AM157353）在同一分支上，一致性達(dá)到100%。

表1 自配廢水中菌株N312的硝化作用結(jié)果

圖3 菌株N312的NO2

--N降解曲線

圖4 菌株N312的 16S rDNA基因電泳圖

2.4 Biolog全自動微生物鑒系統(tǒng)結(jié)果

Biolog GenIII 微孔板可以對微生物進(jìn)行94種表型測試，其中包括：71種碳源利用測試（圖6-圖7，1-9列）以及23種化學(xué)敏感性測試（圖6-圖7，10-12列）。微生物在測試板上所顯示出的“表型指紋”被用來在種的水平上鑒定該微生物，結(jié)果顯示3個重要參數(shù)：可能性（PROB）、相似性（SIM）和位距（DIST）。培養(yǎng)4-6 h，ID 框中顯示“No ID Yet”，表示結(jié)果不能匹配得很好。如圖6所示，培養(yǎng)6 h，該菌株只與F11孔中的四唑紫發(fā)生陽性反應(yīng)。培養(yǎng)16-24 h后，鑒定結(jié)果顯示為綠色狀態(tài)欄（Species ID），可知，菌株N312得到匹配好的結(jié)果（圖7）。鑒定結(jié)果表明，菌株N312最具可能性為Rhizobium radiobacter，PROB值為≥0.5、SIM 值為0.535和DIST 值為6.922，是較為可信的鑒定結(jié)果。

圖5 菌株N312基于16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 菌株N312的Biolog代謝指紋特征圖

圖7 菌株N312的Biolog代謝指紋特征圖

2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化結(jié)果

通過L9（33）培養(yǎng)基正交試驗，結(jié)果（表2）表明，不同的培養(yǎng)基對菌株N312的硝化速率有顯著影響。表現(xiàn)最強(qiáng)的是7號培養(yǎng)基，硝化速率達(dá)到197.142 mg/L，硝化速率最弱的是2號培養(yǎng)基，僅有26.094 mg/L。由極差R值的大小可以判斷，影響菌株N312硝化速率的3種因素的強(qiáng)弱順序：NaNO2＞MgSO4·7H2O ＞Na2CO3。由下表2可得知，培養(yǎng)基配方組合最佳培養(yǎng)基為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g。

表2 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化結(jié)果

3 討論

目前，集約化、高密度和高產(chǎn)出的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變，帶來一系列嚴(yán)重的問題：大量水產(chǎn)動物糞便、殘餌、分泌物的累積，造成水體中含氮污染物的累積，導(dǎo)致水產(chǎn)動物的病害甚至死亡，提高了養(yǎng)殖成本，減少了收益［12，13］。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中的主要污染之一，傳統(tǒng)的生物脫氮是在好氧條件下，采用硝化細(xì)菌將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮［14，15］。已有報道利用硝化細(xì)菌［16］、地衣芽孢桿菌［17］、不動桿菌［18］、Pseudomona sputida［19］、假單胞菌［20］、反硝化細(xì)菌［21］等細(xì)菌進(jìn)行生物脫氮，盡管這些細(xì)菌能夠脫氮，但是在其產(chǎn)物和脫氮能力上存在差異。從已有研究來看，大部分脫氮細(xì)菌是異養(yǎng)細(xì)菌和去除氨氮作用，自養(yǎng)的硝化細(xì)菌卻存在生長緩慢，培養(yǎng)困難，價格高等缺陷。本研究報道的Rhizobium radiobacter菌株N312為首次報道的具有自養(yǎng)硝化作用的新型脫氮菌，并且在好氧條件下具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽脫除能力，為水族箱和養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮處理的實際應(yīng)用提供有效菌源。

本試驗以NaNO2為唯一氮源，以Na2CO3為唯一碳源，培養(yǎng)2 d，NO2--N濃度不斷減少，這與魏巍等［22］發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌Rhizobium sp.生長規(guī)律相一致，培養(yǎng)過程未出現(xiàn)氨氮及硝態(tài)氮的累積，表明菌株N312具有硝化能力。利用細(xì)菌16S rDNA基因序列的保守性，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并TA克隆，通過16S rDNA序列分析只能鑒定到屬的水平，而Biolog全自動微生物鑒定系統(tǒng)卻能鑒定到種水平，并具有準(zhǔn)確、快捷、簡便等優(yōu)點(diǎn)［23］，進(jìn)一步保證了鑒定結(jié)果的可信度。N312在培養(yǎng)4-6 h和16-24 h的讀數(shù)不一致，是由于菌株的生長狀況不同造成的［24］，該菌株在接種后期利用微孔中單一碳源代謝表現(xiàn)活性較強(qiáng)?？傮w來看，16S rDNA基因序列分析與Biolog鑒定結(jié)果一致。

本研究報道的Rhizobium radiobacter菌株N312的自養(yǎng)型硝化微生物，在6 d內(nèi)亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%。魏巍等［22］卻認(rèn)為根瘤菌Rhizobium sp.具有異養(yǎng)硝化作用，氨氮去除率達(dá)到58.17%，同時還能實現(xiàn)同步硝化反硝化。劉鈺瑩等［25］通過貝洛氏法對氨氮進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)中華根瘤菌NP1（Sinorhizobium sp. NP1）具有去除氨氮能力。本文研究的菌株N312具有自養(yǎng)硝化作用，能去除亞硝酸鹽。首次通過培養(yǎng)基配方的優(yōu)化得到菌株N312最佳培養(yǎng)基：NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，Mg2SO4·7H2O 0.25 g，為未來對該菌種制劑的研制提供理論依據(jù)。

因此，本研究篩選得到的放射型根瘤菌是自養(yǎng)脫氮菌，具有去除亞硝酸鹽功能，該功能在國內(nèi)外未見報道，為新生物制劑的研發(fā)提供新的菌源。下一步將對其作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，為水族箱和養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮處理的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)，為水體營養(yǎng)化，污水處理施用的可行性研究提供理論及試驗支持。

4 結(jié)論

本研究從污水處理廠的活性污泥中分離篩選出一株具有硝化能力的脫氮菌，通過富集培養(yǎng)、平板劃線分離菌株，命名為N312，并進(jìn)行形態(tài)觀察，經(jīng)16S rDNA基因序列分析和Biolog鑒定得到該菌株屬于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），為革蘭氏陰性桿菌，菌落圓形，乳白色。菌株N312在自配廢水條件下，6 d亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%。利用正交試驗法對該菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基配方為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g。研究表明菌株N312在水質(zhì)處理中具有良好的應(yīng)用前景，是一株具有研究價值的自養(yǎng)脫氮菌。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of Novel Denitrifier Strain Rhizobium radiobacter and Its Nitrifying Characterisation

Luo Xiaoxi Gao Jianzhong Chen Zaizhong Yu Yongliang
（College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306）

In order to screen and identify new strain with nitrification， a denitrifier was isolated from sewage treatment plant. The strain named N312 isolated by enrichment and plate culture was identified based on its morphology characteristics， 16S rDNA gene sequence analysis and Biolog. The conditions of medium composition were optimized by orthogonal experiment. The autotrophic denitrifier strain N312 was isolated and identified as Rhizobium radiobacter， which was rod， Gram-negative， colony round and white. The results indicated that the nitrite removal efficiency by the strain could reach 100% after 6 days. The best medium was NaNO21.5 g， Na2CO31.5 g， Mg2SO4·7H2O 0.25 g， FeSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g. Strain N312 is a new autotrophic denitrifier with a highly research value.

denitrifier；16S rDNA；Biolog；orthogonal experiment；nitrification rate

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.026

2014-09-05

上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心項目（ZF1206）

羅小溪，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)微生物，微生物制劑研究與應(yīng)用；E-mail：446039386@qq.com

高建忠，男，副教授，研究方向：水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)，微生物制劑研究與應(yīng)用；E-mail：jzhgao@shou.edu.cn