羅小溪 高建忠 陳再忠 于永亮

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海　201306）

新型脫氮菌Rhizobium radiobacter的分離鑒定及其硝化特征分析

羅小溪 高建忠 陳再忠 于永亮

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

旨在從污水處理廠中分離和鑒定具有硝化能力的脫氮菌。采用富集培養(yǎng)、平板劃線分離菌株，命名為N312，并通過(guò)形態(tài)觀察、16S rDNA基因序列分析及Biolog鑒定，利用正交試驗(yàn)法對(duì)該菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，分離獲得具有硝化能力的自養(yǎng)脫氮菌，初步鑒定屬于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），為革蘭氏陰性桿菌，菌落圓形，乳白色，6 d內(nèi)亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%，通過(guò)正交試驗(yàn)初步得到最佳培養(yǎng)基配方為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g。菌株N312是一株具有研究?jī)r(jià)值的自養(yǎng)脫氮菌。

脫氮菌；16S rDNA；Biolog；正交試驗(yàn)；硝化速率

亞硝酸鹽是氮循環(huán)的一部分，也是氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽過(guò)程中的中間產(chǎn)物［1］。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過(guò)程中，亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中的主要污染之一，它對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象有一定的毒害作用。水體中亞硝酸鹽超過(guò)一定濃度會(huì)導(dǎo)致魚類缺氧甚至窒息死亡［2，3］?？梢姡瑏喯跛猁}已成為嚴(yán)重影響水質(zhì)的因素之一。因此，去除水體中的亞硝酸鹽對(duì)水質(zhì)調(diào)控具有重要的意義。

生物脫氮是目前水處理領(lǐng)域中關(guān)注和研究的熱點(diǎn)［4］。傳統(tǒng)方法中，一般是使用硝化細(xì)菌進(jìn)行脫氮，但是硝化細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)困難，而且價(jià)格高［5］，因此，亟待開發(fā)新的、高效的脫氮菌。根瘤菌的發(fā)現(xiàn)并證實(shí)其與豆科植物的共生有固氮作用已有上百年的歷史［6］，但其脫氮作用目前鮮有相關(guān)報(bào)道。關(guān)于應(yīng)用根瘤菌的脫氮是對(duì)傳統(tǒng)理論的豐富和突破。

本研究以某污水處理廠的活性污泥為分離源，通過(guò)富集和分離純化等步驟，分離到一株具有去除亞硝態(tài)氮能力的細(xì)菌，命名為菌株N312。根據(jù)其形態(tài)、16S rDNA基因序列和Biolog鑒定系統(tǒng)，探討該菌株的分類學(xué)地位，旨在為水族箱和養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮處理的實(shí)際應(yīng)用提供有效菌源。

1 材料與方法

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試水樣采自2014年4月上海市某污水處理廠的污水。試驗(yàn)于上海海洋大學(xué)觀賞水族實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，菌株N312從污水中篩選分離得到。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR Master Mix（2×）、PCR 引物、膠回收試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 富集培養(yǎng)基［7］NaNO21.0 g，Na2CO31.0 g，MgSO4·7H2O 0. 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，蒸餾水1 L定容，KH2PO40.5 g單獨(dú)滅菌。

1.1.4 分離培養(yǎng)基 NaNO20.5 g，Na2CO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.015 g，MnSO4·H2O 0.005 g，K2HPO40.5 g，NaH2PO40.5 g，蒸餾水 1 L定容，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉2%。

1.1.5 自配廢水組成 NaNO21.0 g，Na2CO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，蒸餾水1 L定容，KH2PO40.5 g單獨(dú)滅菌。

1.2 方法

其二為串通招投標(biāo)。在藥品、設(shè)備的采購(gòu)過(guò)程中，參與招標(biāo)的藥企或設(shè)備供應(yīng)商在利益的驅(qū)動(dòng)下，暗行串通抬價(jià)之事侵占國(guó)有資產(chǎn)，加劇醫(yī)療保險(xiǎn)基金流失。

1.2.1 菌株的富集 取10 mL污泥樣品加到經(jīng)滅菌（1×105Pa、30 min）處理分裝有100 mL上述富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，富集培養(yǎng)5 d，設(shè)計(jì)對(duì)照組，做2個(gè)平行。每隔24 h定期檢測(cè)NH4+-N和NO2

--N含量。當(dāng)檢測(cè)亞硝酸氮含量接近0時(shí)，添加20 mL富集培養(yǎng)基。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌株的分離純化 取NO2--N減少快的富集培養(yǎng)液，采用平板劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，28℃恒溫、黑暗培養(yǎng)，觀察有乳白色菌落后，挑取單菌落至分離平板，重復(fù)劃線分離3次，得到純培養(yǎng)。將此單菌接種到上述富集培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔24 h檢測(cè)培養(yǎng)基上清液的NH4+-N和NO2

--N。

1.2.3 水質(zhì)檢測(cè)方法［8］的測(cè)定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法。

1.2.4 16S rDNA的PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序 參考黃毅［9］的方法，采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA。通用引物，正向引物27F為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PCR Master Mix（2×）25 μL，引物27F（0.2 μmol/L）1 μL，引物1492R（0.2 μmol/L）1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用膠回收試劑盒（San Prep Column DNA Gel Extraction Kit，Sangon Biotech）進(jìn)行回收。純化后的目的片段連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中。經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)菌液，利用M13通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，取陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 測(cè)序結(jié)果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索［10］，選取同源性最高的序列并通過(guò)MEGA5.0軟件進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.6 Biolog鑒定 挑取單個(gè)純化菌種接種到Biolog專用接種液IF-A中，制成一定細(xì)胞濃度的菌懸液，用Turbidimeter進(jìn)行校準(zhǔn)，使細(xì)胞濃度在92%-96%范圍內(nèi)，然后用移液槍將菌懸液按每孔100 μL轉(zhuǎn)接GenIII微孔板的96個(gè)孔內(nèi)，做好標(biāo)記然后放到33℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h和16-24 h時(shí)在讀數(shù)儀上讀取菌株的代謝指紋特征，在Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)，查找最接近的結(jié)果。

1.2.7 培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn) 為了研究菌株N312營(yíng)養(yǎng)因子需要的影響，設(shè)計(jì)L9（33）培養(yǎng)基正交試驗(yàn)，3個(gè)關(guān)鍵因素分別為氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽。其中，氮源（NaNO2）取0.5、1.0和1.5 g，碳源（Na2CO3）取0.5、1.0和1.5 g，無(wú)機(jī)鹽（MgSO4·7H2O）取0.25、0.5和0.75 g。以硝化速率為依據(jù)，檢驗(yàn)培養(yǎng)菌株N312的最佳培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

由圖1可知，菌株N312在分離培養(yǎng)基上的菌落為乳白色，表面光滑，不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色得到菌株N312形態(tài)（圖2），為革蘭氏陰性，油鏡下觀察為短桿狀，單個(gè)排列。

圖1 菌株N312篩選驗(yàn)證圖

圖2 細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）

2.2 硝化速率結(jié)果

2.3 菌株P(guān)CR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序結(jié)果

克隆后，利用M13通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，約在1 800 bp處有一明亮的條帶（圖4）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，菌株N312與Rhizobium sp.同源性最高，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KM047639。從中選取同源性最高的4株菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖5）顯示，N312與Rhizobium radiobacter GCIZ（AM157353）在同一分支上，一致性達(dá)到100%。

表1 自配廢水中菌株N312的硝化作用結(jié)果

圖3 菌株N312的NO2

--N降解曲線

圖4 菌株N312的 16S rDNA基因電泳圖

2.4 Biolog全自動(dòng)微生物鑒系統(tǒng)結(jié)果

Biolog GenIII 微孔板可以對(duì)微生物進(jìn)行94種表型測(cè)試，其中包括：71種碳源利用測(cè)試（圖6-圖7，1-9列）以及23種化學(xué)敏感性測(cè)試（圖6-圖7，10-12列）。微生物在測(cè)試板上所顯示出的“表型指紋”被用來(lái)在種的水平上鑒定該微生物，結(jié)果顯示3個(gè)重要參數(shù)：可能性（PROB）、相似性（SIM）和位距（DIST）。培養(yǎng)4-6 h，ID 框中顯示“No ID Yet”，表示結(jié)果不能匹配得很好。如圖6所示，培養(yǎng)6 h，該菌株只與F11孔中的四唑紫發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。培養(yǎng)16-24 h后，鑒定結(jié)果顯示為綠色狀態(tài)欄（Species ID），可知，菌株N312得到匹配好的結(jié)果（圖7）。鑒定結(jié)果表明，菌株N312最具可能性為Rhizobium radiobacter，PROB值為≥0.5、SIM 值為0.535和DIST 值為6.922，是較為可信的鑒定結(jié)果。

圖5 菌株N312基于16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 菌株N312的Biolog代謝指紋特征圖

圖7 菌株N312的Biolog代謝指紋特征圖

2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)L9（33）培養(yǎng)基正交試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，不同的培養(yǎng)基對(duì)菌株N312的硝化速率有顯著影響。表現(xiàn)最強(qiáng)的是7號(hào)培養(yǎng)基，硝化速率達(dá)到197.142 mg/L，硝化速率最弱的是2號(hào)培養(yǎng)基，僅有26.094 mg/L。由極差R值的大小可以判斷，影響菌株N312硝化速率的3種因素的強(qiáng)弱順序：NaNO2＞MgSO4·7H2O ＞Na2CO3。由下表2可得知，培養(yǎng)基配方組合最佳培養(yǎng)基為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g。

表2 培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化結(jié)果

3 討論

目前，集約化、高密度和高產(chǎn)出的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變，帶來(lái)一系列嚴(yán)重的問(wèn)題：大量水產(chǎn)動(dòng)物糞便、殘餌、分泌物的累積，造成水體中含氮污染物的累積，導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的病害甚至死亡，提高了養(yǎng)殖成本，減少了收益［12，13］。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中的主要污染之一，傳統(tǒng)的生物脫氮是在好氧條件下，采用硝化細(xì)菌將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮［14，15］。已有報(bào)道利用硝化細(xì)菌［16］、地衣芽孢桿菌［17］、不動(dòng)桿菌［18］、Pseudomona sputida［19］、假單胞菌［20］、反硝化細(xì)菌［21］等細(xì)菌進(jìn)行生物脫氮，盡管這些細(xì)菌能夠脫氮，但是在其產(chǎn)物和脫氮能力上存在差異。從已有研究來(lái)看，大部分脫氮細(xì)菌是異養(yǎng)細(xì)菌和去除氨氮作用，自養(yǎng)的硝化細(xì)菌卻存在生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)困難，價(jià)格高等缺陷。本研究報(bào)道的Rhizobium radiobacter菌株N312為首次報(bào)道的具有自養(yǎng)硝化作用的新型脫氮菌，并且在好氧條件下具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽脫除能力，為水族箱和養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮處理的實(shí)際應(yīng)用提供有效菌源。

本試驗(yàn)以NaNO2為唯一氮源，以Na2CO3為唯一碳源，培養(yǎng)2 d，NO2--N濃度不斷減少，這與魏巍等［22］發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌Rhizobium sp.生長(zhǎng)規(guī)律相一致，培養(yǎng)過(guò)程未出現(xiàn)氨氮及硝態(tài)氮的累積，表明菌株N312具有硝化能力。利用細(xì)菌16S rDNA基因序列的保守性，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并TA克隆，通過(guò)16S rDNA序列分析只能鑒定到屬的水平，而Biolog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)卻能鑒定到種水平，并具有準(zhǔn)確、快捷、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［23］，進(jìn)一步保證了鑒定結(jié)果的可信度。N312在培養(yǎng)4-6 h和16-24 h的讀數(shù)不一致，是由于菌株的生長(zhǎng)狀況不同造成的［24］，該菌株在接種后期利用微孔中單一碳源代謝表現(xiàn)活性較強(qiáng)?？傮w來(lái)看，16S rDNA基因序列分析與Biolog鑒定結(jié)果一致。

本研究報(bào)道的Rhizobium radiobacter菌株N312的自養(yǎng)型硝化微生物，在6 d內(nèi)亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%。魏巍等［22］卻認(rèn)為根瘤菌Rhizobium sp.具有異養(yǎng)硝化作用，氨氮去除率達(dá)到58.17%，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化。劉鈺瑩等［25］通過(guò)貝洛氏法對(duì)氨氮進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)中華根瘤菌NP1（Sinorhizobium sp. NP1）具有去除氨氮能力。本文研究的菌株N312具有自養(yǎng)硝化作用，能去除亞硝酸鹽。首次通過(guò)培養(yǎng)基配方的優(yōu)化得到菌株N312最佳培養(yǎng)基：NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，Mg2SO4·7H2O 0.25 g，為未來(lái)對(duì)該菌種制劑的研制提供理論依據(jù)。

因此，本研究篩選得到的放射型根瘤菌是自養(yǎng)脫氮菌，具有去除亞硝酸鹽功能，該功能在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，為新生物制劑的研發(fā)提供新的菌源。下一步將對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，為水族箱和養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮處理的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)，為水體營(yíng)養(yǎng)化，污水處理施用的可行性研究提供理論及試驗(yàn)支持。

4 結(jié)論

本研究從污水處理廠的活性污泥中分離篩選出一株具有硝化能力的脫氮菌，通過(guò)富集培養(yǎng)、平板劃線分離菌株，命名為N312，并進(jìn)行形態(tài)觀察，經(jīng)16S rDNA基因序列分析和Biolog鑒定得到該菌株屬于放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），為革蘭氏陰性桿菌，菌落圓形，乳白色。菌株N312在自配廢水條件下，6 d亞硝酸鹽去除率達(dá)到100%。利用正交試驗(yàn)法對(duì)該菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基配方為NaNO21.5 g，Na2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g。研究表明菌株N312在水質(zhì)處理中具有良好的應(yīng)用前景，是一株具有研究?jī)r(jià)值的自養(yǎng)脫氮菌。

［1］ 陳薇， 劉清術(shù)， 許麗娟， 等. 兩株以亞硝態(tài)氮為氮源的異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離及鑒定［J］. 生命科學(xué)研究， 2012， 16（6）：489-495.

［2］Soucek DJ， Dickinson A. Acute toxicity of nitrate and nitrite to sensitive freshwater insects， mollusks， and a crustacean［J］. Archives of Environmental Contamination and Toxicology， 2012， 62（2）：233-242.

［3］ Frances J， Allan GL， Nowak BF. The effects of nitrite on the short-term growth of silver perch（Bidyanus bidyanus）［J］. Aquaculture， 1998， 163（1）：63-72.

［4］ 余潤(rùn)蘭， 苗雷. 異養(yǎng)硝化細(xì)菌 Alcaligenes sp. S3 除氮特性及動(dòng)力學(xué)［J］. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)， 2012， 6（3）：869-872.

［5］ 羅小溪， 高建忠， 陳再忠. 硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 水產(chǎn)科技情報(bào)， 2013， 40（6）：320-323.

［6］ 韓華君， 張磊， 張琴， 等. 土壤中根瘤菌定殖研究進(jìn)展［J］. 土壤， 2008， 40（2）：174-180.

［7］ 陳紹銘， 鄭福壽. 水生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法［M］. 北京：海洋出版社， 1990.

［8］ 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. 水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］. 第4版. 北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社， 2002：258-282.

［9］ 黃毅. 硝化細(xì)菌對(duì)淡水水族箱水質(zhì)和異養(yǎng)細(xì)菌類群變化的影響［D］. 上海：上海海洋大學(xué)， 2013.

［10］ Altschul SF， Madden TL， Sch?ffer AA， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs［J］. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）：3389-3402.

［11］ Shishehchian F， Yusoff F， Shariff M. The effects of commercial bacterial products on macrobenthos community in shrimp culture ponds［J］. Aquaculture International， 2001， 9（5）：429-436.

［12］ 雷霽霖. 中國(guó)海水養(yǎng)殖大產(chǎn)業(yè)架構(gòu)的戰(zhàn)略思考［J］. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2010， 17（3）：600-609.

［13］ Bitra A， Hussain B， Tanwar AS， et al. Identification of function and mechanistic insights of guanine deaminase from Nitrosomonas europaea：role of the C-terminal loop in catalysis［J］. Biochemistry，2013， 52（20）：3512-3522.

［14］ Sayavedra-Soto L， Hommes N， Alzerreca J， et al. Transcription of the amoC， amoA and amoB genes in Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp. NpAV［J］. FEMS Microbiology Letters， 1998，167（1）：81-88.

［15］ 南曉梅， 宋新山， 趙曉祥. 硝化細(xì)菌包埋固定化條件的研究［J］. 應(yīng)用化工， 2014， 43（2）：200-202.

［16］ 曾慶武， 梁運(yùn)祥， 葛向陽(yáng). 反硝化細(xì)菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 27（5）：616-620.

［17］ 王景峰， 金敏， 諶志強(qiáng)， 等. 1株好氧脫氮菌的篩選與脫氮特性研究［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2011， 32（8）：2409-2413.

［18］ Kim M， Jeong SY， Yoon SJ， et al. Aerobic denitrification of Pseudomonas putida AD-21 at different C/N ratios［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2008， 106（5）：498-502.

［19］ 韓麗華， 張紹璐. 好氧脫氮菌群的篩選馴化及 PCR-DGGE 分析［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 39（8）：90-93.

［20］ 邢國(guó)偉， 李彥芹， 李鳳超， 等. 一株反硝化細(xì)菌與光合細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖海水的凈化效果［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（3）：151-154.

［21］ 魏巍， 黃廷林， 蘇俊峰， 等. 1株貧營(yíng)養(yǎng)好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮特性［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2010， 19（9）：2166-2171.

［22］ 杜昕波， 趙耘， 李偉杰， 等. 利用BIOLOG系統(tǒng)對(duì)不同種類細(xì)菌鑒定的研究［J］. 中國(guó)獸藥雜志， 2008， 42（9）：31-33.

［23］ 張朝正， 郭蘭珍. 利用16S rDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株［J］. 河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 38（5）：52-55.

［24］ 劉鈺瑩， 邱楓， 宋琴， 等. 中華根瘤菌NP1氨單加氧酶基因的克隆與功能鑒定［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2010，26（8）：768-775.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of Novel Denitrifier Strain Rhizobium radiobacter and Its Nitrifying Characterisation

Luo Xiaoxi Gao Jianzhong Chen Zaizhong Yu Yongliang
（College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306）

In order to screen and identify new strain with nitrification， a denitrifier was isolated from sewage treatment plant. The strain named N312 isolated by enrichment and plate culture was identified based on its morphology characteristics， 16S rDNA gene sequence analysis and Biolog. The conditions of medium composition were optimized by orthogonal experiment. The autotrophic denitrifier strain N312 was isolated and identified as Rhizobium radiobacter， which was rod， Gram-negative， colony round and white. The results indicated that the nitrite removal efficiency by the strain could reach 100% after 6 days. The best medium was NaNO21.5 g， Na2CO31.5 g， Mg2SO4·7H2O 0.25 g， FeSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g. Strain N312 is a new autotrophic denitrifier with a highly research value.

denitrifier；16S rDNA；Biolog；orthogonal experiment；nitrification rate

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.026

2014-09-05

上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心項(xiàng)目（ZF1206）

羅小溪，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)微生物，微生物制劑研究與應(yīng)用；E-mail：446039386@qq.com

高建忠，男，副教授，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)，微生物制劑研究與應(yīng)用；E-mail：jzhgao@shou.edu.cn