李勇鵬 張力維 姚瑤 黃蕊 杜麗

（南陽師范學院生命科學與技術學院，南陽　473000）

香樟Actin基因的克隆及表達分析

李勇鵬 張力維 姚瑤 黃蕊 杜麗

（南陽師范學院生命科學與技術學院，南陽473000）

Actin作為一個看家基因，經(jīng)常在實時定量PCR中被用作內參對不同樣品中的mRNA進行定量，因此在基因表達分析中扮演重要的角色。利用同源克隆的方法，根據(jù)GenBank中已經(jīng)公布的其他植物的Actin基因的保守序列設計簡并引物，采用RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技術從香樟中獲得了4個cDNA片段。分子生物學分析軟件分析結果顯示，4個片段大小為均為998 bp，編碼332個氨基酸；同源性分析表明，所獲得的片段屬于Actin亞家族，分別命名為CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd并提交GenBank（登錄號：KM086736、KM086737、KM086738和KM086739）。實時定量PCR結果顯示，CcACTc在根、莖、葉及低溫處理的葉片中表達量相對穩(wěn)定，可以作為候選內參基因。

香樟；Actin；基因克?。槐磉_分析；實時定量PCR

半定量PCR（Semi-quantitative RT-PCR）和實時定量PCR（quantitative real-time PCR）即Q-PCR是對來自不同組織的mRNA進行定量的有效方法，內參基因可以矯正樣品之間的差異，因此對于上述兩種分析方法選擇合適的內參基因是非常必要的［1］。在植物基因的表達分析研究中比較常用的內參基因是看家基因（house-keeping gene），因為看家基因的表達水平受環(huán)境影響較小，主要包括肌動蛋白基因（ACT）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（G3PDH/ GAPDH）、18S 和 28S 核糖體RNA 基因（18S rRNA、28S rRNA）及肽鏈伸因子（EF1a）基因等［2］。其中Actin是一個比較常用的內參基因，該基因在真核細胞中普遍存在，并且編碼一類高度保守的蛋白，所編碼蛋白是細胞骨架的基本組成成分之一，參與許多重要的亞細胞進程，諸如細胞分裂與伸長、胞吞作用、細胞信號轉導、重力感應、極性生長、細胞器運動和程序性細胞死亡等，因此在植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用［3-6］。在肌動蛋白結合蛋白（Actin-binding protein）的作用下，肌動蛋白微絲的長度、極性、穩(wěn)定性和三維結構不斷變化［7，8］。自從1963年，Yan和Shi 第一次證明高等植物中存在肌動蛋白Actin，研究者們已經(jīng)相繼從多種高等植物中獲得Actin基因，如玉蘭、棗樹、木薯、芍藥、豌豆和荔波連蕊茶等［9-15］。然而，還有許多物種的Actin基因有待分離和鑒定，以便作為內參對該物種其它基因進行定量分析。

香樟（Cinnamomum camphora），又名樟樹、烏樟，樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum），屬常綠喬木，含有特殊香氣和揮發(fā)油，是貴重家具、高級建筑、造船和雕刻等的理想用材。近年來，香樟在園林綠化中的應用越來越多，正成為城市中重要的園林綠化樹種［16］。香樟主要分布于長江以南及西南地區(qū)，近幾年黃河流域也有分布。低溫脅迫是限制香樟的地理分布及其在園林綠化中應用的一個重要環(huán)境因子。因此，培育香樟抗寒新品種有利于其在冬季寒冷的北方地區(qū)推廣。研究抗寒相關基因，從而利用基因工程技術獲得香樟抗寒新品種，具有目的性強、方便快捷等優(yōu)點，是香樟新品種改良的有效途徑。香樟抗寒相關基因的表達模式研究需要一個在低溫條件下表達量相對恒定的內參，進行實時熒光定量PCR分析。Actin基因被證明在一些逆境脅迫條件下表達量相對恒定［17］，也經(jīng)常作為內參應用于植物抗寒相關基因DREB家族基因的表達分析。如Peng等［18］在研究羊草DREB基因轉擬南芥的表達分析時以擬南芥Actin作為內參；張勇等［19］在研究草莓FaCBF1基因的表達分析時也運用了Actin基因作為內參。本實驗室已經(jīng)從香樟中分離到兩個DREB1/CBF基因（數(shù)據(jù)未公布），優(yōu)先選擇Actin基因作為內參，然而，迄今為止關于香樟Actin基因的研究還未見報道。本研究首次從香樟中克隆Actin基因片段，并用Q-PCR技術對CcACTc基因進行表達分析，研究其在香樟不同器官中以及低溫處理條件下的穩(wěn)定性，旨在為開展香樟優(yōu)良內參基因的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 試驗材料為本實驗室保存的香樟無性系組培苗，繼代培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L 2，4-D，生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，其中蔗糖30 g/L，瓊脂粉8.0 g/L，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度2 500 lx，光照時間16 h/d。待材料在MS基本培養(yǎng)基上生長至有5-7片葉片時，開始對材料進行低溫處理，處理溫度為4℃，分別于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h 隨機取葉片；同時選取生根良好且長勢一致的健壯組培苗，取其根、莖、葉片。所有的材料平行取4個重復，收獲后立即用液氮速凍，-80℃保存直至RNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器 大腸桿菌感受態(tài)Trans5α、EasyTaq DNA聚合酶、TransTaq-T DNA聚合酶購自北京全式金（Transgen）生物技術有限公司；Premix ExTaq DNA聚 合 酶、primeSTAR GXL DNA聚 合酶、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、DL2000 DNA Marker、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒、EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司；0.2 mL EU材質薄壁8連管購自荷蘭Bioplastics公司；RT-qPCR反應試劑為FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自瑞士羅氏（Roche）公司；其他生化試劑采用國產(chǎn)或者進口分析純。熒光定量PCR儀為美國伯樂（Bio-Rad）公司生產(chǎn)的CFX-96實時熒光定量系統(tǒng)。

1.1.3 引物設計 通過比對GenBank中已公布的其他植物Actin基因cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)域利用Primer5.0軟件設計一對簡并引物CcAct-F和CcAct-R，預測所得片段長度約1 000 bp；根據(jù)CcACTc基因核苷酸序列的特異區(qū)域設計一對Q-PCR引物CcAct-RTF和CcAct-RTR，擴增片段373 bp。實驗所用引物信息，見表1。

表1 使用到的引物信息

1.2 方法

1.2.1 Actin基因片段的克隆 利用北京艾德萊EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取香樟葉片總RNA，取2 μg RNA利用TaKaRa公司PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Ki反轉錄合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增香樟Actin基因片段的模板。

PCR反應體系（20 μL）：ddH2O 7 μL，Premix ExTaq 10 μL，CcAct-F和CcAct-R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，28個循環(huán)；72℃總延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

經(jīng)電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物與預期目的條帶片段大小符合，另做5管20 μL體系，利用艾德萊瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。回收產(chǎn)物連接于克隆載體 pMD19-T上，16℃過夜，轉化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，以通用引物M13進行菌落PCR，挑取陽性菌擴大培養(yǎng)送往上海生工測序。

1.2.2 Actin基因的生物信息學分析 將測序獲得的香樟Actin基因片段的核苷酸序列以及推導的氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST在線分析工具進行序列相似性分析。序列的比對、翻譯利用DNAMAN分析，系統(tǒng)進化樹先用ClustalX進行多序列比對，然后利用Bioedit將多序列比對結果剪切對齊后用MEGA進行系統(tǒng)進化樹的構建。

1.2.3 CcACTc基因在香樟不同器官及低溫處理下葉片中的表達分析 采用實時定量PCR的方法檢測正常生長條件下的香樟組培苗不同器官及低溫處理0-72 h條件下葉片中Actin基因的表達差異。分別提取香樟根、莖、葉片及經(jīng)低溫處理不同時間的葉片的總RNA，反轉錄成cDNA，RNA起始模板量為2 μg，將反轉錄產(chǎn)物稀釋10倍，作為Q-PCR反應模板，定量分析引物CcAct-RTF和CcAct-RTR的擴增產(chǎn)物先進行電泳檢測及測序，確保其擴增產(chǎn)物特異。Q-PCR反應采用SYBR Green I法，利用羅氏公司的FastStart Universal SYBR Green Master（Roche），在伯樂（Bio-Rad）CFX96 實時定量PCR儀上進行。反 應 體 系（10 μL）：ddH2O 3.4 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 5 μL，CcAct-RTF和 CcAct-RTR（10 μmol/L）各0.3 μL，cDNA 1 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40次循環(huán)；熔解曲線在65-95℃之間，每0.05 s升高0.5℃?；虮磉_分析軟件為Bio-Rad CFX manager 2.0，每一樣品重復3次，實驗重復3次，根據(jù)各個樣品的CT值，利用Excell 2007和BestKeeper進行數(shù)據(jù)分析，BestKeeper是基于各個樣品的CT值計算標準偏差SD，SD值越小，基因穩(wěn)定性越好，若SD＞1，則認為該基因不穩(wěn)定［20，21］。

2 結果

2.1 總RNA的提取及檢測

提取香樟葉片總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1-A）顯示，28S和18S條帶清晰，表明本實驗提取的RNA完整性良好，可以用于后續(xù)反轉錄工作。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

以香樟cDNA為PCR反應模板，以CcAct-F、CcAct-R為引物進行PCR擴增。反應產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000 bp附近有一條亮帶（圖1-B），與預期片段大小一致，可能是香樟Actin基因片段，進一步測序鑒定。

2.3 陽性克隆的鑒定

將回收純化的目的片段連接到克隆載體pMD19-T上，轉化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，隨機挑選15株抗性菌進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）顯示，陽性菌落PCR擴增產(chǎn)物比目的基因片段PCR產(chǎn)物稍大，挑取保存在平板上的相應陽性菌擴大培養(yǎng)，并測序。

圖1 香樟葉片總RNA（A）和香樟ACT基因PCR（B）擴增結果

圖2 菌落PCR篩選陽性重組子結果

2.4 測序結果及多序列比對

測序結果經(jīng)分析并去除兩端引物序列，獲得了4個大小均為998 bp的高度相似的cDNA序列片段，均編碼332個氨基酸（從第3個堿基開始翻譯），利用DNAMAN將所獲得的4條核苷酸序列進行多序列比對，一致性為92.23%（圖3），圖中可以看出突變位點大多在密碼子的第3個堿基位點；而推導的相應氨基酸序列一致性高達99.62%（圖4），結果顯示，其氨基酸序列相互之間有1-4個氨基酸的差異。將本研究獲得的4個片段的核苷酸序列及推導的氨基酸序列在NCBI中進行BLASTN/P分析，結果顯示所獲得序列屬于Acitin基因家族，分別命名為CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd。其中，CcACTa和CcACTb的核苷酸序列都與樟科植物鱷梨Actin基因（GU272027.1）相似度最高，分別達91%和94%；而氨基酸序列分別與無油樟科植物無油樟一種未知蛋白（XP_006854536.1）和樟科植物鱷梨Actin（ADA70361.1）的相似度最高，均達到100%。CcACTc的核苷酸序列與樟科植物山雞椒ACT7（KF706373.1）相似度最高，達98%，氨基酸序列與樟科植物山雞椒ACT7（AGZ90151.1）相似度最高，達100%；CcACTd的核苷酸序列與葡萄科植物葡萄的ACT1（XM_002282480.2）的相似度最高，達87%，氨基酸序列與無油樟科植物無油樟未知蛋白（XP_006846523.1）相似度最高，達99%。由此推斷，本研究所獲得的基因片段應該為香樟肌動蛋白Actin基因片段，提交GenBank，登錄號分別為KM086736、KM086737、KM086738和KM086739。

2.5 香樟Actin基因的系統(tǒng)進化樹的構建

從NCBI下載與香樟肌動蛋白（CcACT）同源性較高的21個物種的Actin基因的氨基酸序列，利用ClustalX軟件進行多序列比對，比對結果經(jīng)對齊后利用MEGA軟件建立系統(tǒng)進化樹，結果（圖5）表明，CcACTc與山雞椒ACT7、CcACTa與無油樟未知蛋白、CcACTb和CcACTd與鱷梨ACT分別聚為一支，表明它們在氨基酸水平上親緣關系較近。

2.6 CcACTc基因在香樟不同器官及低溫處理下葉

片中的表達分析

利用CcAct-RTF和CcAct-RTR引物進行普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增產(chǎn)物沒有引物二聚體和非特異條帶，經(jīng)測序表明該對引物能特異地擴增相應目的片段，可以用于Q-PCR分析。通過Q-PCR技術，檢測香樟CcACTc基因在不同器官及低溫處理下葉片中的表達情況，根據(jù)各個樣品的平均CT值，利用Excel 2007作圖。Q-PCR結果顯示，CcACTc基因在香樟組培苗的根、莖、葉部位中（圖6-A）的平均CT值差異不大；低溫處理0-72 h各個葉片樣品的平均CT值（圖6-B）雖然有一定波動，但也相對穩(wěn)定。

BestKeeper根據(jù)各個樣品的CT值計算標準偏差SD，CcACTc基因在不同器官中和低溫脅迫處理的葉片中SD值分別為0.38和0.29。

3 討論

圖3 新克隆的4條CcACT核苷酸序列片段的多序列比對

圖4 所獲得的4條cDNA序列推導氨基酸的多序列比對

圖5 香樟CcACT基因推導的氨基酸序列與其他植物Actin氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

Actin是一種起源較早的基因，植物與哺乳動物之間有大約90%的相似性［22］，由于表達量高且相對穩(wěn)定，一般作為該物種其它基因定量和半定量PCR分析的內參基因，在大多數(shù)植物的表達分析研究中，Actin基因家族是使用次數(shù)最多的看家基因，并且廣泛應用于DREB家族基因表達分析研究［12-23］。高等植物肌動蛋白基因屬于多基因家族［24］，目前為止，研究者們已經(jīng)從多種物種中克隆到了Actin基因。本研究首次從園林植物香樟中分離到了Actin基因片段的cDNA序列，在實驗中用一對引物，以香樟葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序并分析獲得了4條高度相似卻有一定差異的cDNA序列片段，起初認為可能是由于引物的非特異性所致或者是 DNA聚合酶引起錯配或測序導致的錯誤，我們又重新進行了反轉錄并利用3種不同的DNA聚合酶（EasyTaq、TransTaq-T DNA聚合酶和primeSTAR GXL DNA聚合酶）以相同的程序進行香樟Actin基因片段的克隆，結果除primeSTAR GXL DNA聚合酶未能擴增出條帶，其余兩種DNA聚合酶均能擴增出正常條帶。將這兩種酶的PCR擴增產(chǎn)物連接到T載體轉化大腸桿菌感受態(tài)并分別隨機挑選20株陽性菌進行測序，結果依舊可以獲得4條不同的cDNA序列片段。本試驗表明，香樟葉片確實存在4個不同的Actin基因，并且序列高度相似，它們在香樟中可能行使相似的功能。從4條cDNA序列片段的核苷酸序列比對結果來看，核苷酸序列之間存在一定的差異，一致性達92.23%，但是4條cDNA序列片段所推導的氨基酸序列之間一致性高達99.62%，相互之間僅有1-4個氨基酸的差異，可能是由于堿基的突變位點主要集中在密碼子的第3個堿基位點所致。類似的是，李軍等［25］在桑樹中也一次獲得了2個同源性較高的肌動蛋白基因MaACT1、MaACT2。

圖6 香樟CcACTc基因在植株不同器官（A）及低溫處理下（B）葉片中的平均CT值

本研究所獲得的CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd基因經(jīng)NCBI在線分析均含有植物肌動蛋白家族的特征序列ATP、Gelsolin 和Profilin 結合位點，并且BLASTN/P分析結果顯示，它們與其它植物的Actin基因的核苷酸序列以及相應氨基酸都有較高的同源性，證明本研究所獲得的基因片段確實為香樟肌動蛋白基因（CcACT），也進一步證實了肌動蛋白的高度保守性［2627］。此外，從NCBI下載與香樟肌動蛋白（CcACT）同源性較高的21個物種的系統(tǒng)進化樹分析顯示，香樟肌動蛋白（CcACT）與山雞椒、無油樟和鱷梨的肌動蛋白聚為一支，這與NCBI的BLASTP在線同源性分析結果一致，也支持了傳統(tǒng)分類方法將香樟、山雞椒和鱷梨分為同一樟科植物。還可以看出各個物種的Actin起源于同一祖先，擬南芥ACT2獨立一支，而本研究克隆的香樟CcACT與擬南芥ACT7聚為一類，CcACT可能屬于ACT7。各個物種之間Actin的氨基酸序列高度保守表明Actin在不同物種行使相近的功能，其在進化過程中之所以變化較小可能是為了維持其在植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中行使的重要功能［15］。CT值作為評估內參基因穩(wěn)定性的一個重要指標廣泛應用于內參基因的篩選中，CT值是指反應體系累計足夠的擴增產(chǎn)物，至可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時的循環(huán)數(shù)，主要由擴增反應體系中模板的初始濃度決定。如果初始模板濃度低，需要較多的擴增循環(huán)才能產(chǎn)生足夠的熒光信號；反之，只需要較少的擴增循環(huán)就可以累計足夠的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生高過背景的熒光信號，即基因表達量與該樣品CT值呈反比例關系?；赒-PCR的表達分析結果顯示，CcACTc基因在不同植物器官組織及低溫處理葉片中的CT值差異不大，并且，BestKeeper根據(jù)各個樣品的CT值計算標準偏差SD值遠小于1，綜上可知，該基因在香樟根、莖、葉和低溫處理條件下的葉片中表達量穩(wěn)定，為一個非組織特異型表達，即組成型表達的肌動蛋白基因。期望可以作為香樟DREB1/CBF基因及其它功能基因研究的內參基因，也可以作為篩選香樟優(yōu)良內參基因的候選基因。

4 結論

本研究所獲得了香樟肌動蛋白基因（CcACT）且首次在香樟葉片組織中分離到氨基酸序列相似度較高的4個Actin基因，它們在香樟中可能行使相似的功能。CcACTc基因在香樟根、莖、葉和低溫處理條件下表達量穩(wěn)定，期望可以作為香樟DREB1/CBF基因及其它功能基因研究的內參基因，也可以作為篩選香樟優(yōu)良內參基因的候選基因。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Actin Gene in Cinnamomum camphora

Li Yongpeng Zhang Liwei Yao Yao Huang Rui Du Li
（School of Life Science and Technology，Nangyang Normal University，Nanyang473000）

As a house-keeping gene， Actin has been always being used as an internal standard to normalize mRNA levels between different samples by quantitative real-time PCR， thus plays an important role in gene expression analysis. In this research， through a method of homology cloning， a pair of degenerate primers were designed based on the conserved sequences of Actin genes from other plants submitted to GenBank， and then 4 cDNA fragments from Cinnamomum camphora were obtained using RT-PCR. Molecular biological analysis showed that，each of the 4 cDNA fragments was 998 bp and encoded a putative protein of 332 amino acids. Moreover， according to the homology analysis，the 4 cDNA fragments belonged to Actin subfamily， and they were named CcACTa， CcACTb， CcACTc and CcACTd， and deposited in GenBank（Accession number：KM086736 KM086737 KM086738 and KM086739）. Quantitative real-time PCR results revealed that the expression level of CcACTc in different organs such as root， stem， leaf and leaves under low temperature treaments was relatively stable. It could serve as a candidate reference gene.

Cinnamomum camphora；Actin；gene cloing；expression analysis；quantitative real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.019

2014-10-15

國家自然科學基金資助項目（31100511），河南省高校青年骨干教師計劃資助項目（2010GGJS-161），南陽師范學院博士科研啟動資助項目（nynu200746），2015年度研究生創(chuàng)新基金項目（2015CX008）

李勇鵬，男，碩士研究生，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：daniel_lee1217@yeah.net

杜麗，女，博士，副教授，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：dldldlucky@163.com