林世鋒 付強(qiáng) 余婧 趙杰宏 任學(xué)良 王仁剛

（貴州省煙草科學(xué)研究院　煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)　550081）

煙草胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的克隆及表達(dá)分析

林世鋒 付強(qiáng) 余婧 趙杰宏 任學(xué)良 王仁剛

（貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550081）

采用電子克隆的方法，結(jié)合RT-PCR和SMART RACE技術(shù)，首次從煙草（Nicotiana tabacum）中克隆到1個(gè)胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）基因的cDNA序列，命名為Nt6PGDH（GenBank登錄號(hào)：KM211534）。該基因cDNA全長(zhǎng)1 932 bp，開(kāi)放閱讀框1 455 bp，編碼484個(gè)氨基酸，與番茄（Solanum lycopersicum）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）的6PGDH氨基酸序列一致性最高，為95%。生物信息學(xué)分析表明，Nt6PGDH氨基酸序列不存在信號(hào)肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞質(zhì)。對(duì)煙草不同發(fā)育時(shí)期Nt6PGDH基因的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，Nt6PGDH基因在煙草旺長(zhǎng)期根、莖、葉中的表達(dá)量均高于苗期，并且在同一發(fā)育時(shí)期，煙草根中表達(dá)量最強(qiáng)，莖次之，葉片最弱。

煙草；胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；基因克隆；表達(dá)分析

戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是植物體中糖代謝的重要途徑，其主要生理功能是產(chǎn)生供還原性生物合成需要的NADPH以及可供核酸代謝的磷酸戊糖［1-4］，一些中間產(chǎn)物則可參與氨基酸和脂肪酸合成等［5，6］。已有研究表明，磷酸戊糖途徑與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、各類(lèi)環(huán)境脅迫密切相關(guān)［6-12］。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphaogluconate dehydrogenase，6PGDH）是磷酸戊糖途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，廣泛分布于高等植物的胞質(zhì)和質(zhì)體中［6］。由于G6PDH和6PGDH是PPP的限速酶而受到人們更多的研究，人們也常常通過(guò)對(duì)這兩個(gè)酶的研究來(lái)研究磷酸戊糖途徑。據(jù)報(bào)道煙草葉片受到馬鈴薯Y病毒侵染時(shí)，植物體內(nèi)G6PDH與6PGDH的活性顯著增強(qiáng)，而且質(zhì)體中的G6PDH與6PGDH酶活性的增幅遠(yuǎn)大于胞質(zhì)中兩個(gè)酶活性的增強(qiáng)，研究者認(rèn)為G6PDH活性的增強(qiáng)可能受到某種粗調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)節(jié)［13］。目前，研究者已從煙草中克隆到G6PDH基因的全長(zhǎng)cDNA序列［14］，并進(jìn)行了相應(yīng)的功能研究［15］，但對(duì)煙草中6PGDH cDNA序列的克隆與分析還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究利用生物信息學(xué)方法，結(jié)合RT-PCR和SMART RACE技術(shù)，對(duì)編碼煙草6PGDH的cDNA全序列進(jìn)行克??；并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)其在煙草組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以期為煙草6PGDH基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

分別采集煙草栽培品種K326（Nicotiana tabacum L. K326）生根期幼苗的根、莖、葉和芽組織，液氮迅速冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 所有植物材料RNA采用Trizol Reagent（Invitrogen公司）法提取總RNA，并參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。

1.2.2 Nt6PGDH全長(zhǎng)cDNA的克隆 以黃瓜6PGDH全長(zhǎng)cDNA序列（登錄號(hào)：FJ610345）為信息探針，在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，將檢索到的來(lái)自煙草品種K326的全部EST序列利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行拼接，獲得1個(gè)重疊群（Contig）。根據(jù)獲得的重疊群設(shè)計(jì)合成1對(duì)PCR 引物P-iF和P-iR，見(jiàn)表1。以煙草品種K326 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證拼接結(jié)果。

表1 引物序列及預(yù)期片段大小

根據(jù)驗(yàn)證得到的基因片段設(shè)計(jì)基因3'RACE嵌套引物和5'RACE嵌套引物，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，RACE擴(kuò)增后分別獲得基因的3'端序列和5'端序列。利用DNAMAN軟件組裝以上序列，獲得全長(zhǎng)cDNA序列信息，設(shè)計(jì)合成1對(duì)基因全長(zhǎng)引物P-F和P-R，以合成的煙草品種K326 cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得煙草6PGDH的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.3 Nt6PGDH基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用ORF Finder（http：//www. ncb.i nlm. nih.gov/gorf/gor.f html）程序確定正確的開(kāi)放閱讀框（ORF）；通過(guò)NCBI 上的 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行序列相似性檢索；利用 ExPASy（http：//web. expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)蛋白的分子質(zhì)量計(jì)算值和理論等電點(diǎn)；利用Smart（http：//smart.emblheidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；信號(hào)肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析分別由SignalP 4.1、TargetP 1.1和TMHMM Server v.2.0在線程序（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）進(jìn)行預(yù)測(cè)；亞細(xì)胞定位采用PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行分析；用ClustalX 2.0和MEGA4.0軟件-鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 Nt6PGDH的DNA序列克隆 采用CTAB法從新鮮幼嫩的煙草葉片中提取基因組DNA。利用基因全長(zhǎng)引物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)Nt6PGDH的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物P-rF和P-rR。選用煙草Actin基因（NTU60495）為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)引物Actin-rF和Actin-rR。利用Taqman探針試劑盒（TaKaRa公司）在ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，分析Nt6PGDH在煙草不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Nt6PGDH基因的克隆

以煙草品種K326 cDNA為模板，用P-iF和P-iR為引物，進(jìn)行煙草6PGDH基因中間片段的PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序（圖1）。由此設(shè)計(jì)合成RACE引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得該基因的3'端和5'端。通過(guò)測(cè)序拼接，獲得該基因的全長(zhǎng)序列信息。經(jīng)ORF搜索以及其他植物來(lái)源6PGDH基因比對(duì)分析，確定該基因具有完整的ORF。根據(jù)全長(zhǎng)基因拼接序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR方法，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，將其命名為Nt6PGDH，GenBank登錄號(hào)為KM211534（圖2）；同時(shí)以煙草基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得與RT-PCR擴(kuò)增相同大小的序列，說(shuō)明該基因內(nèi)部無(wú)內(nèi)含子。

圖1 煙草Nt6PGDH基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 Nt6PGDH基因的序列分析

Nt6PGDH基因cDNA全長(zhǎng)1 932 bp（不包括polyA尾上31個(gè)連續(xù)的堿基A），由174 bp的5'端非翻譯區(qū)（5'-UTR）、1 455 bp編碼區(qū)和303 bp的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）組成（圖2）。該序列可編碼484個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量約為53.30 kD，等電點(diǎn)為5.70。SMART分析表明，該蛋白質(zhì)4-178氨基酸位形成6PGDH的NADP結(jié)合結(jié) 構(gòu) 域（NAD binding domain of 6-phosphogluconate dehydrogenase），其中氨基酸序列GMGVSGGEEG符合高度保守的NADP結(jié)合位點(diǎn)序列GXGXXGXXXG（圖2）；182-476氨基酸位為6PGDH的C-末端結(jié)構(gòu) 域（6-phosphogluconate dehydrogenase，C-terminal domain），其中氨基酸序列VLDKTGMKGTGKW與已知的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物的6PGDH高度保守的底物結(jié)合位點(diǎn)序列V/I/L/M-X-D-X-X-G/A-N/Q/S-K-G-T-G-X-W相符，只是第263位氨基酸M替代了N，這一變化在植物界普遍發(fā)生。

2.3 信號(hào)肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)Nt6PGDH蛋白不具有信號(hào)肽。利用TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（chloroplast transit peptide，cTP）為 0.023、線粒體信號(hào)肽（mitochondrial targeting peptide，mTP）為0.189、分泌通路信號(hào)肽（secretory pathway signal peptide，SP）為0.449、其他為0.286。利用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，結(jié)果（圖3）顯示Nt6PGDH蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)域。在線工具PSORT II Prediction預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示Nt6PGDH蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中的概率達(dá)52.2%，k值達(dá)到23。因此，Nt6PGDH蛋白最可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 煙草Nt6PGDH基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸

圖3 預(yù)測(cè)的Nt6PGDH蛋白的跨膜區(qū)

2.4 煙草與其他植物的6PGDH蛋白的同源性比較經(jīng)氨基酸序列同源檢索，發(fā)現(xiàn)Nt6PGDH與已知其他高等植物胞質(zhì)6PGDH氨基酸序列一致性為76%-95%，其中與番茄（XP_004237068）和馬鈴薯（XP_006363551）基因一致性最高為95%。進(jìn)一步利用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并采用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，6PGDH蛋白是一個(gè)比較古老的蛋白，在單子葉植物和雙子葉植物分化之前已經(jīng)出現(xiàn)，并在單子葉植物與雙子葉植物形成過(guò)程中發(fā)生了分化。此外，6PGDH蛋白在番茄、馬鈴薯、黃瓜等植物中均以多種形式存在，其中菠菜質(zhì)體6PGDH（AF295670）在進(jìn)化樹(shù)中并未形成一個(gè)獨(dú)立的分支，而與黃瓜、番茄、馬鈴薯等胞質(zhì)6PGDH聚在一起，這支持胞質(zhì)和質(zhì)體6PGDH并非獨(dú)立起源的觀點(diǎn)。

圖4 植物胞質(zhì)6PGDH的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 Nt6PGDH基因的時(shí)空表達(dá)模式分析

采用熒光定量RT-PCR法，對(duì)Nt6PGDH基因在煙草不同發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉中的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。圖5顯示，Nt6PGDH在苗期和旺長(zhǎng)期的各組織中均有表達(dá)，以根的表達(dá)量為最高，旺長(zhǎng)期各組織的表達(dá)量均比苗期相同組織的表達(dá)量高。

圖5 Nt6PGDH基因的時(shí)空表達(dá)特性

3 討論

本研究首次報(bào)道了煙草Nt6PGDH基因的克隆。通過(guò)氨基酸序列同源檢索，結(jié)果顯示煙草Nt6PGDH與已知其他高等植物6PGDH一致性都在76%以上；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，煙草Nt6PGDH最先與番茄、馬鈴薯等茄科植物6PGDH聚類(lèi)，其次與大豆、黃瓜等物種6PGDH聚類(lèi)合并；用SMART軟件分析Nt6PGDH具有典型的6PGDH特征：含有一個(gè)NADP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-末端結(jié)構(gòu)域。上述分析結(jié)果都表明Nt6PGDH為煙草6PGDH基因。植物中6PGDH存在兩種形式，一種為存在于胞質(zhì)中的胞質(zhì)6PGDH（cytosolic 6PGDH）；另一種為存在于質(zhì)體基質(zhì)中的質(zhì)體6PGDH（plastidic 6PGDH），其中后者氨基酸的N端顯著長(zhǎng)于前者，編碼一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽（transit peptide）序列［6，7］。本研究克隆的Nt6PGDH編碼的氨基酸序列與菠菜胞質(zhì)6PGDH（AAK51690）、菠菜質(zhì)體6PGDH（AF295670）的氨基酸一致性分別為90%和77%（資料未列出），而且與其他物種的胞質(zhì)6PGDH相類(lèi)似氨基酸N端都缺少一段長(zhǎng)度約為40 aa的轉(zhuǎn)運(yùn)肽［16，17］，因此推測(cè)本研究克隆的Nt6PGDH編碼的6PGDH為胞質(zhì)6PGDH。

戊糖磷酸途徑是植物中重要的代謝途徑，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著非常重要的作用，不僅為生物合成提供還原力NADPH，為核酸的合成提供五碳糖，還涉及到多種環(huán)境脅迫引起的植物應(yīng)答反應(yīng)，其中6PGDH的活性或基因表達(dá)水平與各種逆境脅迫以及淀粉的生物合成等過(guò)程有關(guān)［7-12］。Fahrendorf等［18］在苜蓿中比較了胞質(zhì)6PGDH基因在各個(gè)組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)根中的表達(dá)量要高于葉，而且胞質(zhì)6PGDH在葉中的表達(dá)幾乎無(wú)法檢測(cè)。在大豆根瘤中，存在高活性的6PGDH可能與嘧啶的合成、酰脲的產(chǎn)生和氮的固定有關(guān)［19，20］。因此，胞質(zhì)6PGDH在根中的大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能與氮的吸收利用有關(guān)。經(jīng)表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)克隆的Nt6PGDH在旺長(zhǎng)期根、莖、葉的表達(dá)量均比苗期相同組織的表達(dá)量高，其中在旺長(zhǎng)期的根中表達(dá)量最高，這可能是因?yàn)橥L(zhǎng)期牽涉到大量的細(xì)胞分裂與生物合成，而戊糖磷酸途徑正為生物合成提供必要的還原力NADPH和供DNA/RNA合成所必須的五碳糖；而根中的表達(dá)高于葉，也進(jìn)一步驗(yàn)證本研究克隆的Nt6PGDH編碼胞質(zhì)6PGDH。

4 結(jié)論

從煙草中克隆到一個(gè)胞質(zhì)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因，命名為Nt6PGDH，基因登錄號(hào)為KM211534?；蛉L(zhǎng)1 932 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 455 bp，編碼484個(gè)氨基酸。Nt6PGDH氨基酸序列不存在信號(hào)肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞質(zhì)。Nt6PGDH基因在煙草苗期和旺長(zhǎng)期的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在旺長(zhǎng)期各組織中的表達(dá)量均高于苗期，并且在同一發(fā)育時(shí)期，煙草根中表達(dá)量最強(qiáng)，莖次之，葉片最弱。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Cytosolic 6-phosphogluconate Dehydrogenase Gene in Tobacco（Nicotiana tabacum）

Lin Shifeng Fu Qiang Yu Jing Zhao Jiehong Ren Xueliang Wang Rengang
（Key Laboratory of Molecular Genetics，CNTC，Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang550081）

A cDNA sequence of cytosolic 6-phosphogluconate dehydrogenase（6PGDH）gene was cloned from Nicotiana tabacum by in silico cloning combined with RT-PCR and SMART RACE technologies， and designated as Nt6PGDH（Accession number KM211534）. The full length of its cDNA sequence is 1 932 bp， with a 1 455 bp open reading frame， and the gene encoded a protein of 484 amino acids with the sequence of highest identity， 95% as 6PGDH from Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. Bioinformatics analysis indicated that Nt6PGDH had no signal peptide， no transit peptide and notrans-membrane domain， and it was located in cytoplasm. Gene expression analysis showed that the expression levels of Nt6PGDH in roots， stems and leaves were higher at fast-growirg stage than at seedling stage. Moreover， at the same developmental stage， the highest level of Nt6PGDH expression were in the roots， then in the stems， the lowest in the leaves.

Nicotiana tabacum；cytosolic glucose-6-phosphate dehydrogenase；gene cloning；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.018

2014-09-12

中國(guó)煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目（110201302004），貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專(zhuān)項(xiàng)資金（黔科合人字［2013］02 號(hào)），貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2012］2256號(hào)）

林世鋒，男，博士，副研究員，研究方向：煙草遺傳育種與分子生物學(xué)；E-mail：linshifeng1978@163.com

王仁剛，男，碩士，副研究員，研究方向：煙草遺傳育種與分子生物學(xué)；E-mail：rengangwang@126.com