賀茜 王艷萍 陳玉珍 盧存福

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院　林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京　100083）

沙冬青AmHsa32基因超表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草抗熱性

賀茜 王艷萍 陳玉珍 盧存福

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

Hsa32是一類新型的熱激蛋白，主要發(fā)現(xiàn)于陸地植物中，對(duì)植物抗逆性的獲得起關(guān)鍵作用。AmHsa32是Hsa32的同源蛋白之一，是從沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）克隆得到的耐熱性相關(guān)基因。成功構(gòu)建了Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS植物表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入到本生煙中。經(jīng)PCR和Western boltting檢測(cè)證明AmHsa32已經(jīng)被轉(zhuǎn)入到本生煙基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型本生煙在高溫脅迫下種子的萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)耐熱性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物的抗熱得到了明顯提高。研究結(jié)果表明，AmHsa32可作為植物耐熱基因育種的重要基因資源。

沙冬青；AmHsa32；轉(zhuǎn)基因；耐熱性

溫度是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一。溫度過高或過低均能抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育，限制植物分布，同時(shí)也會(huì)造成植株無法恢復(fù)的傷害，甚至?xí)?dǎo)致死亡。植物體可以響應(yīng)非致死高低溫，這使其能夠抵御極端溫度從而存活［1］，高溫能破壞植物的正常生理和代謝過程，如光系統(tǒng)Ⅱ活性［2］、花粉和種子發(fā)育［3］、乙炔還原［4］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整性［5］及葉生長(zhǎng)［6］等。同樣，非致死性高溫也能使植物基因的表達(dá)模式發(fā)生改變。熱脅迫使植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所需蛋白質(zhì)合成受到抑制，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱激蛋白，提高植物耐熱性。熱脅迫相關(guān)蛋白Hsa32（heat stress associated protein32，Hsa32）是一種小分子熱激蛋白，分子量為32 kD，在植物抵御熱脅迫及植物耐熱性獲得方面具有關(guān)鍵作用；另外，Hsa32也能夠響應(yīng)低溫、干旱、鹽等非生物脅迫［7，8］。目前，對(duì)Hsa32蛋白的研究主要集中在擬南芥、小麥、番茄等［9］，還未見對(duì)木本植物Hsa32的報(bào)道。

沙冬青是我國(guó)西北荒漠地區(qū)的常綠灌木，是亞熱帶地區(qū)第三紀(jì)殘遺物種［10，11］，具有很強(qiáng)的抵抗干旱、寒冷、高溫、鹽堿等特性。與楊樹等已測(cè)序木本植物相比［12］，沙冬青抗逆基因功能研究比較滯后，目前主要集中在抗逆基因的挖掘和功能驗(yàn)證［13-26］。Chen等［26］克隆了沙冬青的CBL1，將其轉(zhuǎn)入到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草相較于對(duì)照組具有較強(qiáng)的抗逆性。李曉東等［27］將沙冬青脫水素基因AmDHN 轉(zhuǎn)入到甜菜中，抗性實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因甜菜的抗旱性要高于非轉(zhuǎn)基因。智冠華等［28］初步證明了沙冬青基因AmZFPG 能提高植物的耐寒性。因此，沙冬青是研究木本植物抗逆基因資源的理想材料［29］。

我們先前的研究［29］表明，沙冬青AmHsa32基因ORF區(qū)域?yàn)?58 bp，共編碼286個(gè)氨基酸，與擬南芥、玉米、水稻、番茄、小麥中Hsa32都有較高的同源性。在40℃脅迫下，AmHsa32 在沙冬青幼苗中表達(dá)量迅速提高，1 h后達(dá)到對(duì)照的25倍。除此以外，轉(zhuǎn)入AmHsa32基因的大腸桿菌也具有一定的耐熱性［13］。本研究構(gòu)建Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS植物表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入到模式植物本生煙中，驗(yàn)證了AmHsa32具有提高植物耐熱性的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

含AmHsa32基因的菌液、真核表達(dá)載體Pcambia2300-35S-OCS、農(nóng)桿菌LBA4404以及野生型本生煙（Nicotiana benthamiana）均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。內(nèi)切酶Kpn I、BamH I、pMD-18T Vector、DNA marker均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建 以AMSP（5'-AggTACCATgTCAgCATACAgATggAAAAgC-3'，下劃線為Kpn I酶切點(diǎn)）為上游引物，AMSR（5'-AggATCCATgCAACACCAgCTATgA gACAAC-3'，下劃線為BamH I酶切點(diǎn)）為下游引物，含有AmHsa32的菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；終延伸 72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將AmHsa32目的片段切膠回收后與pMD18-T載體16℃連接3 h，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)正確序列的陽性克隆提質(zhì)粒，用Kpn I和BamH I雙酶切，同時(shí)雙酶切載體Pcambia-2300，均37℃酶切3 h，產(chǎn)物回收后，用T4連接酶16℃連接3 h，獲得重組載體，測(cè)序驗(yàn)證。提取重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.2 野生型煙草侵染，T1代轉(zhuǎn)基因煙草鑒定 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤侵染法將重組載體AmHsa32-2300轉(zhuǎn)化到野生型煙草中，將T1代煙草種子播種在含150 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗。選擇轉(zhuǎn)基因植株煉苗，之后轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)。用CTAB法提取T1代不同種系轉(zhuǎn)基因煙草DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3 Western boltting檢測(cè) AmHsa32抗血清是用我們先前獲得的重組蛋白AmHsa32-N［30］注射免疫兔子得到。液氮研磨不同株系轉(zhuǎn)基因煙草，將葉片粉末分裝于無菌2 mL EP管，加入200 μL預(yù)冷過的磷酸緩沖液（pH＞7.0），將Ep管置于4℃冰箱30 min溶解水溶性蛋白。12 000 r/min低溫離心10 min，取5 mL上清并加入5 μL loading buffer，混勻后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離AmHsa32。隨后利用水溶式電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。

1.2.4 脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)率的測(cè)定 將AmHsa32轉(zhuǎn)基因T1代煙草種子和野生型種子在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h（25℃，16 h光照 /8 h黑暗）。熱處理：37℃處理2 h，42℃再處理2 h后，轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件，恢復(fù)培養(yǎng)10 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草T1代幼苗耐熱性分析 將AmHsa32轉(zhuǎn)基因煙草T1代種子及野生型煙草播種于MS培養(yǎng)基上，至幼苗長(zhǎng)出4葉片時(shí)進(jìn)行熱脅迫處理。脅迫結(jié)束后，轉(zhuǎn)入25℃控溫箱（16 h光照 /8 h黑暗）培養(yǎng)15 d，觀察轉(zhuǎn)基因煙草及野生型株系的表型變化，統(tǒng)計(jì)存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

分別將轉(zhuǎn)基因煙草和野生型種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，培養(yǎng)6周。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行熱處理觀察表型變化。熱脅迫過程：將土培苗在37℃熱馴化1 h后，室溫恢復(fù)生長(zhǎng)2 h，45℃再次熱激3 h后，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，觀察表型變化，統(tǒng)計(jì)植株存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 2300-Hsa 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 克隆沙冬青AmHsa32基因，與pMD18-T載體連接后測(cè)序。選擇測(cè)序正確的單克隆菌液提質(zhì)粒，與Pcambia-35s-ocs真核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，具體構(gòu)建見圖1。

圖1 2300-HAS 真核表達(dá)載體構(gòu)建圖

2.1.2 克隆AmHsa32基因片段 以含有測(cè)序正確的AmHsa32的菌液為模板，AMSP、AMSR為引物擴(kuò)增目的基因編碼序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得大小約為850 bp的目的條帶（圖2）。將目的條帶切膠回收后，與pMD18-T載體16℃連接5 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。將上述連接產(chǎn)物涂在氨芐霉素抗性LB平板上篩選，挑取菌落，37℃震蕩培養(yǎng)后，PCR鑒定陽性克隆。

圖2 PCR擴(kuò)增AmHsa32電泳檢測(cè)圖

2.2 侵染本生煙及轉(zhuǎn)基因植株T1代的鑒定

在25℃恒溫（16 h光照/8 h黑暗）條件下，培養(yǎng)野生型煙草6周后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤侵染法將重組載體AmHsa32-2300轉(zhuǎn)化野生型煙草。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)侵染葉片5 d，轉(zhuǎn)入分化及抑菌培養(yǎng)基形成愈傷組織，培養(yǎng)愈傷組織4-5周后形成不定芽，將不定芽轉(zhuǎn)移至抑菌生根培養(yǎng)基中，得到T0代轉(zhuǎn)基因煙草。

將滅菌后的T1代轉(zhuǎn)基因株系種子播種到MS培養(yǎng)基（含卡那霉素）中進(jìn)行抗性篩選。培養(yǎng)4周后，轉(zhuǎn)基因種子正常生長(zhǎng)，葉片較綠，根系較為發(fā)達(dá)，無抗性的種子葉片發(fā)黃，根系短小，最終葉片白化死亡。在T1代種子中出現(xiàn)卡那霉素抗性分離，抗性苗與白化苗分離比約為3∶1。選擇生長(zhǎng)6周大小的組培苗進(jìn)行煉苗，3 d后轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)2周，提取T1代轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，條帶位置在850 bp，即T1代轉(zhuǎn)基因株系與陽性對(duì)照在相同位置存在目的條帶（圖3）。證明AmHsa32已整合到煙草基因組中，獲得含卡那霉素抗性的T1代轉(zhuǎn)基因煙草。

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因本生煙的PCR檢測(cè)

2.3 Western blotting檢測(cè)

為研究轉(zhuǎn)基因煙草中AmHsa32的表達(dá)情況，分別提取T1代不同株系轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的可溶性蛋白，以野生型煙草可溶性蛋白作為對(duì)照，進(jìn)行Western blotting。結(jié)果（圖4）顯示，T1代不同轉(zhuǎn)基因株系（H1-1，H2-1，H3-1）均有免疫印跡信號(hào)，而野生型煙草無信號(hào)，證明AmHsa32基因已在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)AmHsa32的Western blotting檢測(cè)

2.4 熱脅迫下煙草萌發(fā)率

將野生型煙草種子及AmHsa32轉(zhuǎn)基因株系T1代種子，分別播種于MS培養(yǎng)基，在25℃控溫培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養(yǎng)12 h，分組進(jìn)行熱脅迫。熱脅迫37℃處理2 h后，42℃處理2 h轉(zhuǎn)入25℃控溫培養(yǎng)箱，10 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。結(jié)果（圖5）顯示，AmHsa32轉(zhuǎn)基因株系98%全部萌發(fā)，野生型僅有36%萌發(fā)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AmHsa32基因煙草高溫脅迫抗性明顯提高。

圖5 轉(zhuǎn)AmHsa32和野生型本生煙種子在不同溫度處理下的萌發(fā)率

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的耐熱性

將野生型煙草播種在MS培養(yǎng)基，T1代轉(zhuǎn)基因煙草播種在含抗生素的MS培養(yǎng)基中，25℃控溫培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）培養(yǎng)幼苗長(zhǎng)出4葉片時(shí)，進(jìn)行熱脅迫處理，具體處理?xiàng)l件如表1。37℃處理幼苗1 h，42℃處理3 h，轉(zhuǎn)入25℃控溫培養(yǎng)箱回復(fù)培養(yǎng)15 d，觀察轉(zhuǎn)基因株系及野生型表型，野生型煙草約有20%葉片發(fā)白干枯，而轉(zhuǎn)基因株系正常生長(zhǎng)。37℃處理幼苗1 h，42℃處理3 h，45℃進(jìn)一步處理3 h，轉(zhuǎn)入25℃控溫培養(yǎng)箱，恢復(fù)培養(yǎng)15 d，觀察表型，野生型煙草幼苗全部死亡（圖6-A），而AmHsa32轉(zhuǎn)基因幼苗約有60%存活（圖6-B）。

表1 轉(zhuǎn)基因和野生型本生煙幼苗對(duì)熱脅迫反應(yīng)的比較

圖6 轉(zhuǎn)基因及野生型本生煙熱處理后恢復(fù)15 d后的表型

培養(yǎng)缽中生長(zhǎng)6周后的幼苗，經(jīng)42℃處理后，恒溫箱25℃恢復(fù)培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型植株的表型變化差異明顯。經(jīng)過熱脅迫，與轉(zhuǎn)基因植株相比，野生型株系葉片變黃，逐漸白化，受害明顯（圖7-D），轉(zhuǎn)基因株系80%葉片保持綠色（圖7-C），表明AmHsa32的表達(dá)能夠有效減輕熱脅迫對(duì)植株的傷害。

圖7 轉(zhuǎn)基因及野生型本生煙的表型

3 討論

已有的研究表明熱脅迫相關(guān)蛋白Hsa32對(duì)植物耐熱性的獲得具有關(guān)鍵作用。Liu等［30］對(duì)Hsa32耐熱性方面的研究表明，缺少Hsa32基因的擬南芥在高溫處理下較野生型更為敏感。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Hsa32的氨基酸序列與2-磷酸3-磺基乳酸合成酶（參與硫脂合成）相似，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明擬南芥Hsa32突變體對(duì)高溫的敏感性與硫脂的含量并無關(guān)聯(lián)，Hsa32也不參與硫脂的合成。Charng等［7］用插入突變的方法在Hsa32基因中插入T-DNA，該基因的突變并不影響植物在正常溫度下的生長(zhǎng)和發(fā)育。耐熱性獲得實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變株和野生型植株在經(jīng)受高溫處理后，需要一段時(shí)間的恢復(fù)，再次經(jīng)歷高溫時(shí)，野生型長(zhǎng)勢(shì)良好，突變株則相反；但是如果恢復(fù)時(shí)間不夠，則突變株和野生型都會(huì)死亡。這說明Hsa32在植物中起作用不僅需要誘導(dǎo)，Hsa32在熱脅迫后起作用也需要一段時(shí)間的恢復(fù)期。Wu等［31］為了探索Hsa32無效突變株僅存在短暫的耐熱性，但不具備長(zhǎng)期的耐熱性這一現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制，采用正向遺傳篩選的兩個(gè)錯(cuò)義隱性等位基因（編碼熱激蛋白分子伴侶HSP101）的突變體，免疫印記和異位表達(dá)等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明了HSP101 和HSA32在蛋白水平上互相調(diào)控，是一種正反饋機(jī)制，通過這種新型的機(jī)制能夠延長(zhǎng)植物熱馴化的效力。

我們前期的研究表明，轉(zhuǎn)AmHsa32大腸桿菌（BL21）經(jīng)50℃熱脅迫后存活率較野生型明顯提高。AmHsa32有可能結(jié)合了其他蛋白，共同維持大腸桿菌在逆境下的正常生存［29］。本研究中轉(zhuǎn)基因煙草種子在熱及低溫脅迫條件下仍能全部萌發(fā)，而野生型煙草種子在熱脅迫后僅有35%的萌發(fā)率，這說明AmHsa32提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗熱能力。幼苗的耐熱分析結(jié)果表明，AmHsa32轉(zhuǎn)基因植株抵御長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫后仍有60%存活，而野生型煙草全部死亡。在模式植物擬南芥的研究中也有類似報(bào)道，Hsa32突變體與野生型受到同樣的熱脅迫（44℃）處理60 min后，前者死亡［7］，這表明Hsa32的表達(dá)對(duì)植物響應(yīng)熱脅迫有重要作用。

4 結(jié)論

構(gòu)建沙冬青AmHsa32基因cDNA真核表達(dá)載體，侵染野生型煙草，經(jīng)過PCR及Western blotting鑒定后，證實(shí)目的基因已轉(zhuǎn)入煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草在高溫脅迫下的萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)分析證明，AmHsa32使轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性明顯提高。

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［29］王艷萍， 劉美芹， 師靜， 等. 沙冬青熱脅迫相關(guān)蛋白基因AmHsa32超表達(dá)提高大腸桿菌的抗熱性［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012（5）：37-43.

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（責(zé)任編輯 李楠）

Ectopic-overexpression of AmHsa32 from Ammopiptanthus mongolicus Promoted Heat Tolerance in Nicotiana benthamiana

He Qian Wang Yanping Chen Yuzhen Lu Cunfu
（College of Biological Sciences and Biotechnology，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing100083）

Hsa32 is a novel heat-shock protein（Hsp）and mainly found in land plants and essential for acquired thermo-tolerance. AmHsa32 as one orthologue of the Hsa32 gene， was isolated from a desert plant， Ammopiptanthus mongolicus（Leguminosae）. In order to verify the function of AmHsa32， we constructed the plant expression vector Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS， and transferred it into Nicotiana benthamiana through the medium of Agrobacterium strain. PCR and Western blotting demonstrated that AmHsa32 had been integrated into the genome of Nicotiana benthamiana. Seed germination and seedling growth analysis indicated that overexpressing AmHsa32 resulted in enhanced tolerance to heat stresse in transgenic Nicotiana benthamiana. Our work suggests that AmHsa32 might be a valuable gene for plant resistant breeding with transgene technology.

Ammopiptanthus mongolicus；AmHsa32；transgene；thermotolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.016

2014-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270737），高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目（B13007），長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（IRT13047），北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（6112016）

賀茜，男，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：tree.hq@163.com

盧存福，男，博士，教授，研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué)；E-mail ：lucunfu@bjfu.edu.cn