金紅焦根林陳剛

（1. 深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，深圳　518004；2. 肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，肇慶　526061）

基于RNA-seq技術(shù)的楮頭紅轉(zhuǎn)錄組分析

金紅1焦根林1陳剛2

（1. 深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，深圳518004；2. 肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，肇慶526061）

利用RNA-seq技術(shù)對所構(gòu)建的楮頭紅葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測定，對原始reads進(jìn)行過濾和組裝，得到了51 305條質(zhì)量較高的Unigenes，平均長度為921 nt，N50為1 490 nt。利用BLAST和BLAST2GO 軟件對這些從頭組裝的Unigenes進(jìn)行注釋。用NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Nr）、非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫（Nt）、基因本體論（GO）、直系同源基因簇（COG）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫做參考，共注釋了40 532條Unigenes。注釋到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO庫中的比例相對較高，分別為77.53%、56.18%、53.14%、46.58%、29.69%和60.72%。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對所有的Unigenes進(jìn)行blast以后，發(fā)現(xiàn)有39 302個CDS，用ESTscan預(yù)測了2 065個CDS。KEGG通路分析顯示，參與次生代謝物生物合成的Unigenes有2 323條，占全部Unigenes的9.72%。其中有78條Unigenes編碼了細(xì)胞色素P450家族蛋白，這些信息為藥用植物次生代謝物生物合成關(guān)鍵基因的挖掘提供了理論參考。

楮頭紅轉(zhuǎn)錄組；RNA-seq

楮頭紅（Sarcopyramis nepalensis Wall.），民間又稱風(fēng)柜斗草，為野牡丹科肉穗草屬植物，無亞種名。主要分布于我國臺灣、福建、江西、云南和四川等地。該植物全草可入藥，其提取物中主要成分為黃酮類、多酚、脂肪酸和酚酸類［1，2］，常被用于治療急、慢性肝炎、肺熱咳嗽、風(fēng)濕骨痛、無名腫毒等疾病［3］，是較有價值的珍稀名貴中草藥，在我國臺灣和福建地區(qū)廣為使用。然而，目前對楮頭紅的研究主要停留在藥理活性及化學(xué)成分等方面［4-6］，缺乏對其分子生物學(xué)方面的研究，其基因信息也極少，給楮頭紅次生代謝途徑的研究帶來了極大困難。

轉(zhuǎn)錄組是在特定的發(fā)育階段和不同的生理條件下，所有轉(zhuǎn)錄出來的RNA的集合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是解讀基因組功能元件、揭示細(xì)胞和組織中的分子組成所必需的［7］。目前由于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)錄組學(xué)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要方法之一，是連接基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的橋梁。通過高通量的轉(zhuǎn)錄組分析，可以獲得機(jī)體在生命過程中基因的表達(dá)模式。RNA-seq是2008年建立起來的基于深度測序的轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)，它能夠在單核苷酸水平上對任何物種進(jìn)行整體轉(zhuǎn)錄活動的檢測［8］。與依賴基因組背景信息的基因芯片技術(shù)相比，該方法更適合基因組圖譜尚未完成或遺傳背景信息較為匱乏的物種［9，10］，是目前在全基因組水平上研究基因表達(dá)模式的主導(dǎo)技術(shù)。本研究擬采用RNA-seq技術(shù)對所構(gòu)建的楮頭紅葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測定，并對此全基因組水平轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全局分析，為重要性狀相關(guān)基因的克隆及功能分析、鑒定次級代謝物生物合成相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，對于未來通過基因工程調(diào)控有用成分的含量以及相關(guān)藥物的生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為楮頭紅的新鮮葉片，葉片全展開，寬約1.5 cm，于2013年11月采自湖北省利川市毛壩新華村，采集后液氮速凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA的提取和檢測 6片新鮮的葉片混合用于RNA的提取，采用Trizol（Invitrogen，USA）法提取葉片總RNA，提取過程中所用器具和耗材都經(jīng)過RNase free處理，提取步驟參照說明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，微量紫外分光光度計（NaNoDrop1000）檢測RNA的純度和濃度。

1.2.2 楮頭紅葉片轉(zhuǎn)錄組測序 轉(zhuǎn)錄組測序由深圳華大基因研究院提供技術(shù)服務(wù)，測序平臺為Illumina HiSeqTM2000。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)的組裝和注釋 測序后得到的原始reads，去除含有接頭、重復(fù)的和測序質(zhì)量很低的reads后，得到clean reads。使用短reads組裝軟件Trinity對clean reads進(jìn)行從頭組裝［11］。過濾和組裝以后得到的高質(zhì)量的Unigenes，對這些從頭組裝的Unigenes進(jìn)行注釋。用NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Nr）、非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫（Nt）、基因本體論（GO）、直系同源基因簇（COG）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫作參考，得到Unigene的功能注釋信息。根據(jù)Nr注釋信息，使用Blast2GO［12］和WEGO［13］軟件對Unigene進(jìn)行GO注釋和功能分類。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序和組裝

通過Illumina Hiseq2000平臺測序，總計產(chǎn)出58 187 602條reads，去除低質(zhì)量的和含有接頭的reads以后，得到54 795 874條clean reads，共計4 931 628 660個核苷酸（Nucleotides，nt）。G+C含量、Q20和未知堿基序列分別為52.59%、98.33%和0.00%（表1）。

Raw reads總數(shù)量　Clean reads總數(shù)量　Clean reads堿基數(shù)/nt　Q20/%　N值/%　G+C含量/% 58 187 602　54 795 874　4 931 628 660　98.33　　0.00　52.59

利用Trinity軟件對這些reads進(jìn)行組裝得到平均長度為347 nt（N50=648 nt）的Contigs 120 934條，共計41 909 136 nt。對Contigs進(jìn)行去冗余以后最終得到51 305條Unigenes，平均長度為921 nt， N50為1 490 nt。Unigenes的長度分布顯示（圖1），長度大于1 000 nt的Unigenes有16 999條，占全部Unigenes的33.13%。說明本研究中轉(zhuǎn)錄組文庫的測序和組裝結(jié)果都較好，能夠進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

圖1 Unigenes的長度分布圖

2.2 Unigenes的功能注釋

通過blastx將Unigene序列比對到NCBI上的蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot以及KEGG（http：//www. genome.jp/kegg/pathway.html） 和COG（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/COG）（E-value＜1e-5），并通過blastn將Unigene比對到核酸數(shù)據(jù)Nt（E-value＜1e-5），得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

注釋結(jié)果顯示共有40 532（79.0%）的Unigenes是有注釋的（表2），其中匹配到Nr數(shù)據(jù)庫中的有39 781條，占全部Unigenes的77.53%。此外，有21%的Unigenes無法注釋，這可能與楮頭紅的遺傳背景信息較少有關(guān)。注釋到Nr數(shù)據(jù)庫中Unigenes的E-value分布顯示（圖2-A），比對到的物種序列E-value均小于1e-5，其中E-value小于1e-100的有32.8%，說明比對結(jié)果的可信度較高。對Unigene的注釋結(jié)果進(jìn)行物種相似性分析顯示（圖2-B），序列比對相似性在15%-100%之間，其中大部分序列相似性在40%-80%之間，序列相似度大于80%的有21.4%，說明楮頭紅轉(zhuǎn)錄組的功能注釋結(jié)果較好。

表2 楮頭紅葉片轉(zhuǎn)錄組中Unigenes的注釋統(tǒng)計

圖2 Unigenes在Nr庫中的E-value分布（A）、相似性分布（B）及物種分布（C）

注釋基因的同源序列的物種分布情況見圖2-C，注釋到葡萄（Vitis vinifera）的序列有21.6%；其次是蓖麻（Ricinus communis），有15.0%。這是因為葡萄和蓖麻具有豐富的基因組信息，為本研究中轉(zhuǎn)錄組的注釋提供了參考序列［14，15］。

Gene Ontology（簡稱GO）是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表（controlled vocabulary）來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫注釋信息，使用Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息，然后用WEGO［13］對所有Unigene做GO功能分類統(tǒng)計，從宏觀上認(rèn)識楮頭紅的基因功能分布特征。對楮頭紅轉(zhuǎn)錄組Unigenes進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，有31 153條Unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫，注釋比例為60.72%。注釋到生物學(xué)過程的基因最多，為129 573個，其次是細(xì)胞組成（96 967個），分子功能的最少，只有34 741個。GO分析的這3個ontology又分為56個亞類，如在生物過程中，細(xì)胞過程和代謝過程所占比例較高，細(xì)胞和細(xì)胞器部分在細(xì)胞組成所占比例較高，連接和催化活性在分子功能中占有較高比例（圖3）。

COG注釋表明，本研究中得到的注釋到COG中的15 234條Unigenes分布于25個基因家族（圖4），如RNA加工與修飾、染色體結(jié)構(gòu)和動力學(xué)、能量產(chǎn)生與運(yùn)輸、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂及染色體分裂等。在25類基因家族中，注釋最多的是一般功能預(yù)測（R），其次是轉(zhuǎn)錄（K）。值得注意的是，有4 564條Unigenes被注釋到次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸及分解代謝，為后續(xù)研究楮頭紅中有用化學(xué)成分相關(guān)的基因奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.3 Unigenes的代謝通路分析

對楮頭紅葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，有23 898條Unigenes注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，分布于128條已知的通路中，包括類黃酮生物合成（169條，ko00941）、類胡蘿卜素生物合成（160條，ko00906）、環(huán)烯醚萜生物合成（144條，ko00900）。注釋序列數(shù)目較多的3個通路分別是代謝途徑、次生代謝物生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（表3）。此外，從KEGG分析中，鑒定出了78個編碼細(xì)胞色素P450的Unigenes。這些注釋為后續(xù)次生代謝物的合成和代謝提供了很多有價值的信息。

2.4 預(yù)測編碼蛋白框

按照Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的優(yōu)先級順序?qū)﹁^紅葉片轉(zhuǎn)錄組中51 305條Unigenes進(jìn)行blastx比對（E-value＜1e-5），以確定該Unigene的編碼區(qū)序列。然后將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列，得到該Unigene編碼區(qū)的氨基酸序列和核酸序列（序列方向5'→3'）。最后，用ESTScan軟件預(yù)測無法比對到以上蛋白質(zhì)庫的Unigenes編碼區(qū)，得到其編碼區(qū)的氨基酸序列和核酸序列（序列方向5'→3'）。將所有的Unigenes在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對以后，發(fā)現(xiàn)有39 302個Coding Sequence（CDS），其中有74.32%（29 211個）的序列長度大于1 000 nt（圖5）。在ESTscan預(yù)測了2 065個CDS（圖6），序列長度范圍分布在200-2 000 nt之間，其中片段長度為500-1 000 nt的有233條，比例約為11.28%。說明Unigenes的序列質(zhì)量較好，共預(yù)測了41 367個CDS。

3 討論

近年來，新一代高通量測序技術(shù)的建立和發(fā)展，為非模式植物功能基因的研究提供了有效手段［16］，也為植物基因組的研究提供了便利。然而，與模式植物和重要的農(nóng)作物相比，目前對藥用植物基因組的研究相對較少［17］，RNA-seq技術(shù)為植物轉(zhuǎn)錄組研究提供了新的發(fā)展契機(jī)［18］。通過藥用植物的研究，可以清楚地了解其生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)功能的基本信息［19，20］。本研究首次利用RNA-seq高通量測序技術(shù)對楮頭紅葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析，為其次生代謝物合成相關(guān)基因的挖掘、研究基因功能提供了基礎(chǔ)信息，同時為其有效成分的生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究中共得到51 305條質(zhì)量較高的Unigenes，平均長度為921 nt，注釋比例高達(dá)79.0%，其Unigenes數(shù)目、平均長度和注釋比例都遠(yuǎn)高于基于Roche 454的丹參（Salvia miltiorrhiza）轉(zhuǎn)錄組（46 722條Unigenes，平均長度為414 nt，注釋比例約為28.48%）［21］，美國西洋參（American ginseng）的轉(zhuǎn)錄組（31 088條序列，平均長度為427 nt，注釋比例為69.8%）［22］。在丹參和西洋參的研究中，測序平臺為Roche 454，而在本研究中，測序平臺為Illumina。Roche 454平均讀長較長，但是準(zhǔn)確率低，Illumina性價比較高，覆蓋度較深，經(jīng)過技術(shù)升級后，平均讀長也得到了改善，是目前使用較為廣泛的測序平臺之一［23］。Unigenes的片段長度對注釋效率也有顯著的影響，本研究中Unigenes注釋到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO庫中的比例也相對較高，分別為77.53%、56.18%、53.14%、46.58%、29.69%和60.72%。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對所有的Unigenes進(jìn)行blast發(fā)現(xiàn)，有39 302個CDS，用ESTscan預(yù)測了2 065個CDS。通過與以上兩種藥用植物的測序結(jié)果相比，進(jìn)一步說明了本研究轉(zhuǎn)錄組測序的產(chǎn)量更高、質(zhì)量更好。

圖3 Unigene在GO庫中的分布

圖4 Unigene在COG庫中的分布

編號　　途徑　　注釋基因數(shù)/23 898　　占總基因數(shù)的比例/%　　代謝通路ID 1新陳代謝通路　5810 　24.31　ko01100 2次生代謝物生物合成　2323 　9.72　ko01110 3植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)　1532　6.41　ko04075 4內(nèi)吞作用　1461 　6.11　ko04144 5植物-病原菌感染　1453 　6.08　ko04626 6甘油磷脂代謝　1350　5.65　ko00564 7醚脂類代謝　1193　4.99　ko00565 8 RNA運(yùn)輸　1084　4.54　ko03013 9剪接體844 　3.53　ko03040 10　　淀粉和蔗糖代謝　800 　3.35　ko00500 11　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工　740　3.1　ko04141 12　mRNA監(jiān)測途徑　681 　2.85　ko03015 13　　核糖體　650 　2.72　ko03010 14　　泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用　603　2.52　ko04120 15　　戊糖和葡萄糖醛酸酯互變　511　2.14　ko00040 16　　嘌呤代謝　501 　2.1　ko00230 17　　嘧啶代謝　434　1.82　ko00240 18　　氧化磷酸化　383　1.6　ko00190 19　RNA降解　354　1.48　ko03018 20　　真核生物核糖體合成　334　1.4　ko03008

圖5 Blast預(yù)測的Unigenes的CDS長度分布圖

圖6 ESTscan預(yù)測的Unigenes的CDS長度分布圖

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）是廣泛存在于幾乎所有生物體內(nèi)的代謝酶，參與了內(nèi)源性生理物質(zhì)如類固醇、細(xì)胞激素和脂肪酸等物質(zhì)的代謝［24］，是植物中所占比例最大的一類蛋白家族，負(fù)責(zé)大多數(shù)次生代謝物的氧化過程［25，26］。本研究中KEGG通路分析顯示，參與次生代謝物生物合成的Unigenes有2 323條，占全部Unigenes的9.72%，其中有78條Unigenes編碼了細(xì)胞色素P450家族蛋白。除此之外，還有參與二萜類生物合成、異黃酮生物合成、生物堿合成等次生代謝物合成的Unigenes。

研究表明，楮頭紅中主要的活性物質(zhì)為黃酮類化合物，黃酮是植物體內(nèi)具有重要作用的次生代謝物，具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等廣泛的藥理活性［27］。查爾酮異構(gòu)酶（Chalconeisomerase，CHI）是黃酮類化合物代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，能夠催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，從而使雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為有生物活性的三環(huán)（2S）-黃烷酮［28］。目前已在燈盞菊［29］、水母雪兔子［30］、金蕎麥［31］等藥用植物中分離出了CHI基因。本研究中有4條Unigenes編碼了CHI，這對于調(diào)控楮頭紅中黃酮類化合物的合成提供了可靠的依據(jù)。

植物生物堿是一種廣泛存在于高等和低等植物中的含氮有機(jī)化合物，是許多中草藥和藥用植物的有效成分［32］。據(jù)報道，大約有20%的有花植物都能產(chǎn)生生物堿［33］。由于目前對楮頭紅的有效成分研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)楮頭紅中有生物堿成分的報道。然而，基于轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢，我們發(fā)現(xiàn)在KEGG通 路 中 有7條（KO00901、KO00950、KO00960、KO00900、KO00904、KO00909、KO00902） 是 與生物堿合成相關(guān)的代謝途徑，包括萜類合成途徑、吲哚合成途徑、異喹啉合成途徑等，共有362條Unigenes，這從側(cè)面反映了楮頭紅中含有不同類型的生物堿，為其藥用成分的開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用Illumina測序技術(shù)對楮頭紅葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和分析，揭示了其轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)模式，初步獲得了一些參與次生代謝物合成的基因序列信息，共獲得51 305條質(zhì)量較高的Unigenes，其中有注釋的40 532條，注釋比例高達(dá)79%。初步獲得了一些與次生代謝物合成相關(guān)的基因序列，為深入開展藥用植物生物活性成分的合成和鑒定以及功能基因的篩選提供了豐富了數(shù)據(jù)資料。在利用生物技術(shù)提高藥用植物有效成分含量以及相關(guān)藥物研發(fā)和生產(chǎn)方面，具有重要的應(yīng)用價值。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Transcriptome Analysis of Sarcopyramis nepalensis via RNA-seq Technology

Jin Hong1Jiao Genlin1Chen Gang2
（1. Fairy Lake Botanical Garden，Shenzhen and CAS，Shenzhen518004；2. College of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing526061）

Transcriptome analysis of Sarcopyramis nepalensis leaves was performed via a newly developed high-throughput sequencing technology（Illumina RNA-seq）. A total of 51 305 unigenes were generated with 921 nt of average length and 1 490 nt of unigene N50 after filtering and assembly of original reads. These unigenes from the de novo assembly were further annotated using BLAST and BLAST2GO softwares. A total of 40 532 unigenes annotated with databases of non-redundant protein sequence（Nr）， non-redundant nucleotide（Nt），Swiss-Prot， Gene Ontology database（GO）， Clusters of Orthologous Groups（COG）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）databases available at NCBI as

. The proportion of unigenes annotated in Nr， Nt， Swiss-Prot， KEGG， COG and GO databases were 77.53%， 56.18%， 53.14%， 46.58%， 29.69% and 60.72%， respectively. Total 39 302 CDSs were obtained using blast in protein databases，and 2 065 CDSs were predicted using ESTscan software. KEGG pathway parsing revealed that 2 323（9.72%）unigenes were involved in biosynthesis of secondary metabolites（KO01110）， and 78 unigenes encoding the cytochrome P450 family proteins were identified. These annotated information provided theoretical foundation for determining the vital genes involved in biosynthesis of secondary metabolites of medicinal plants.

Sarcopyramis nepalensis transcriptome；RNA-seq

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.014

2014-09-11

深圳市城市管理局項目（201318）

金紅，博士，高級工程師，研究方向：植物多樣性保護(hù)及利用；E-mail：jinhong@szum.gov.cn